纖維素酶解法提取劍麻總皂苷工藝研究

賈桂云，顧長瑜，李 云，劉 紅，2*

(1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南?？?571127；2.熱帶特色藥食同源植物研究與開發(fā)重點實驗室，海南海口 571127)

劍麻(AgavesisaianaPerrine)，又名菠蘿麻、西紗爾麻、劍麻麻，是劍麻科劍麻屬植物，亞熱帶多年生草本硬質(zhì)纖維作物，原產(chǎn)于墨西哥的龍加丹半島。在我國廣東、廣西、福建、海南有大面積種植，主要用于生產(chǎn)劍麻纖維。劍麻葉片抽取纖維后的液汁中含有甾體骨架成分劍麻皂苷(Tigogenin)，甾體皂苷是天然產(chǎn)物中一類重要的化學(xué)成分，有降血糖、祛痰、止咳、抗炎、抗癌等多種生物活性，是半合成四大甾體激素藥物的主要原料之一[1-2]。因此，從植物中提取天然甾體皂苷具有廣闊的前景。目前，劍麻皂苷的提取多采用發(fā)酵方法，破除堅厚的植物細(xì)胞壁，讓依附在纖維素中的劍麻皂苷釋放出來，該方法原料、試劑消耗較多，且產(chǎn)生大量的酸堿廢水。近年來，超聲輔助提取劍麻總皂苷的工藝和超臨界CO2萃取劍麻中總皂苷的工藝也有報道[4-7]。采用纖維素酶解法-乙醇浸提法[8]，即用纖維素酶分解劍麻植物的堅硬細(xì)胞壁，用乙醇提取劍麻總皂苷，探討最佳提取工藝，為纖維素酶解法提取劍麻的皂苷類化學(xué)成分提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器ZN-04A小型粉碎機(北京興時利和科技發(fā)展有限公司)；TP-214電子天平(丹佛儀器(北京)有限公司)；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；i5紫外可見分光光度計(濟南海能儀器股份有限公司)；SB-5200DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；HH-1數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市金南儀器制造有限公司)；數(shù)顯酸度計(上海佑科儀器儀表有限公司)。

1.2材料與試劑劍麻采摘于海南師范大學(xué)桂林洋校區(qū)。洗凈、陰干后放在干燥箱內(nèi)37 ℃干燥后粉碎。

纖維素酶[安倍醫(yī)療器械貿(mào)易(上海)有限公司(MP Biomedicals)]；熊果酸[阿拉丁試劑(上海)有限公司]；乙醇、甲醇、冰乙酸、香草醛、高氯酸等均為國產(chǎn)分析純；蒸餾水(實驗室自制)。

1.3方法

1.3.1劍麻總皂苷的提取。準(zhǔn)確稱取劍麻的樣品粉末0.500 0 g至50 mL的圓底燒瓶中，按一定的固液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，加入纖維素酶，使酶的質(zhì)量濃度達到控制值。將圓底燒瓶置于水浴鍋中，在一定溫度下酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，移入80 ℃的恒溫水浴鍋中滅活30 min。離心分離酶解液，上層清液留用，下層的沉淀物用15 mL 95%乙醇在70 ℃恒溫水浴回流浸提60 min后抽濾，濾液與酶解液合并，減壓蒸干。移至100 mL容量瓶用甲醇溶解定容，即為提取物的樣品溶液。

1.3.2纖維素酶解法提取單因素試驗。影響纖維素酶解反應(yīng)的主要因素包括酶質(zhì)量濃度、酶解溫度、pH、酶解時間及固液比等因素，針對其中一個因素，在保持其他因素相同的條件下進行單因素試驗，考察單因素對劍麻總皂苷提取率的影響。

1.3.3纖維素酶解法提取正交試驗。選取單因素試驗中對總皂苷提取率影響較大的因素進行正交試驗，按照因素水平表設(shè)計，考察各因素對劍麻總皂苷的影響程度，優(yōu)選最佳工藝條件。

1.3.4工作曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取熊果酸對照品0.010 0 g于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度(200 μg/mL)，搖勻。精確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL溶液分別置于7支磨口的具塞試管中，水浴揮干無水乙醇后加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，塞緊試管磨口塞，混勻。在70 ℃水浴中加熱15 min使顯色反應(yīng)完全，冰水冷卻10 min。加冰乙酸4 mL搖勻，隨行試劑作空白。在545 nm測定吸光度[8]。熊果酸對照品加入量為x坐標(biāo)，吸光度為y坐標(biāo)，線性回歸，得線性回歸方程y=0.002 19x+0.000 91，R=0.998 16，線性范圍0～240 μg。

1.3.5劍麻總皂苷含量的測定。準(zhǔn)確吸取提取物的樣品溶液0.2 mL于具塞磨口試管中，按“1.3.4”中顯色方法操作，在545 nm測樣品吸光度，計算提取率。

式中，C為樣品溶液中總皂苷濃度(mg/mL)，V為樣品溶液的總體積(mL)；W為劍麻粉末的質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1酶的質(zhì)量濃度對提取率的影響。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g劍麻葉粉末于50 mL圓底燒瓶中，在固液比為1∶20，pH 5.0，水浴酶解溫度為50 ℃，酶解時間為100 min，纖維素酶質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，酶的質(zhì)量濃度對劍麻總皂苷提取率的影響見圖1。

圖1 酶的質(zhì)量濃度對提取率的影響Fig.1 Effects of concentration of cellulase on extraction rate

當(dāng)纖維素酶質(zhì)量濃度在0.15～0.20 mg/mL，總皂苷的提取率達到最大值，酶濃度超過0.20 mg/mL劍麻總皂苷的提取率反而呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是體系中過量的酶沒有機會與底物反應(yīng)，反而影響總皂苷提取。

2.1.2酶解溫度對提取率的影響。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g劍麻粉末于50 mL圓底燒瓶中，在固液比為1∶20，pH 5.0，酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，酶解時間為100 min，分別在40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴酶解，酶解溫度對劍麻總皂苷提取率的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對提取率的影響Fig.2 Effects of temperature of enzymatic hydrolysis on extraction rate

隨酶解溫度的提高，劍麻皂苷提取率增加，50 ℃時達到最高，繼續(xù)提高酶解溫度，提取率下降。其原因是溫度超過50 ℃纖維素酶活性下降，細(xì)胞壁沒有被完全分解，影響劍麻皂苷的浸出。最適宜的酶解溫度是50 ℃。

2.1.3溶液pH對提取率的影響。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g劍麻葉粉末于50 mL圓底燒瓶中，在固液比1∶20，水浴酶解溫度為50 ℃，纖維素酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，水浴酶解時間為100 min，調(diào)節(jié)溶液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶解pH對劍麻總皂苷提取率的影響見圖3。

圖3 提取液pH對提取率的影響Fig.3 Effects of pH on extraction rate

試驗結(jié)果顯示，溶液的pH對總皂苷提取率影響很大。當(dāng)溶液pH在4.0～5.0時，總皂苷的提取率隨著pH的升高而增加，在溶液pH為5.0時，總皂苷的提取率達到最大值。繼續(xù)增加溶液的pH，總皂苷的提取率開始下降?？梢娮罴讶芤簆H為5.0。

2.1.4酶解時間對提取率的影響。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g劍麻粉末于50 mL圓底燒瓶中，在固液比為1∶20，pH 5.0，纖維素酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，50 ℃恒溫水浴酶解，酶解時間分別為30、60、90、120、150 min，纖維素酶酶解反應(yīng)時間對劍麻總皂苷提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對提取率的影響 Fig.4 Effects of time of enzymatic hydrolysis on extraction rate

隨著酶解時間的增加，劍麻總皂苷提取率在增加，超過120 min時，提取率下降，這與黃山等[9]酶解法提取絞股藍總皂苷的結(jié)果吻合。可能是隨著酶解時間的增加，酶解液糊化，影響劍麻總皂苷提取。最佳酶解時間為90～120 min。

2.1.5固液比對提取率的影響。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g劍麻葉粉末于50 mL圓底燒瓶中，在溶液的pH為5.0，水浴酶解溫度為50 ℃，纖維素酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，水浴酶解時間為100 min，固液比分別為1∶18、1∶20、1∶22、1∶24、1∶26，按“1.3.2”項下方法制備樣品溶液，固液比對劍麻總皂苷提取率的影響見圖5。

圖5 固液比對提取率的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate

固液比在1∶18～1∶26對總皂苷提取率的影響較為平緩，考慮節(jié)省試劑及減少后續(xù)濃縮的能耗、工作量等因素，選取固液比1∶20。

2.2正交試驗優(yōu)化提取工藝為考察各個因素對總皂苷提取率的交互作用，選取單因素試驗中對總皂苷提取率影響較大的酶質(zhì)量濃度、酶解溫度、酶解時間、酶解pH 4個因素進行考察，每個因素設(shè)3個水平，采用L9(34)正交設(shè)計表，正交試驗的因素水平見表1，正交試驗的結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果顯示，在選定的因素水平中，影響程度依次為：D>B>C>A，即酶解液pH>酶解溫度 >酶解時間>酶質(zhì)量濃度，極差分析中最佳提取工藝是A2B1C1D3，即酶質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL，酶解溫度為45 ℃，pH 5.5，酶解時間為100 min，料液比1∶20。該條件在正交試驗中沒有出現(xiàn)，需驗證。

方差分析表明，酶解液的pH、酶解溫度對劍麻總皂苷的提取率影響極顯著，酶解時間影響顯著，酶質(zhì)量濃度在選定的水平范圍內(nèi)影響不顯著。

2.3最佳工藝條件下驗證試驗為確定最佳提取工藝的穩(wěn)定性，在A2B1C1D3下平行做3次驗證試驗，提取率分別為19.21%、18.95%和19.45%，平均提取率19.20%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD1.8%。

2.4加樣回收率精密度為進一步驗證方法的精密度，進行加標(biāo)回收試驗。分別吸取10、20、30、40、50 μL已知濃度的樣品溶液，再加入0.1 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定其吸光度，并計算總皂苷濃度，以計算其回收率和回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率精密度

由表3可見，加標(biāo)平均回收率為91.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.52%，因此可保證用該方法處理樣品的誤差小，試驗可靠性高。

3 討論

植物中的總皂苷等分布在植物的細(xì)胞壁內(nèi)，細(xì)胞壁主要由纖維素構(gòu)成。利用酶解反應(yīng)的高效、專一性，選擇纖維素酶解反應(yīng)破壞細(xì)胞壁，以便提取皂苷類成分。劍麻總皂苷中含有多種甾體皂苷[10-11]，甾體皂苷極性大，因此，破壁后的酶解物用95%乙醇提取。提取物總皂苷測定時利用甾體皂苷在無水條件下，遇某些酸類可產(chǎn)生與三萜皂苷相類似的顏色反應(yīng)，故用五環(huán)三萜類的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)對照品，選用顯色靈敏的香草醛-高氯酸反應(yīng)，進行顯色。因為要求無水條件下，所以選擇極性比無水乙醇大的甲醇定容。

選取對酶解反應(yīng)影響較大的酶解時間、酶解溫度、酶的質(zhì)量濃度、固液比、溶液的pH進行單因素試驗，結(jié)果顯示，除固液比外，其他4個因素對提取率的影響較大，固液比的影響較為平緩，因此，選固液比1∶20。正交試驗極差分析及方差分析結(jié)果顯示，對劍麻總皂苷提取率的影響順序為酶解液pH>酶解溫度 >酶解時間>酶質(zhì)量濃度，酶解液的pH、酶解溫度對劍麻總皂苷的提取率影響極顯著，酶解時間影響顯著，酶質(zhì)量濃度在選定的水平范圍內(nèi)影響不顯著。這與文獻[12]的研究相吻合。

在優(yōu)選出的最佳提取工藝下A2B1C1D3，即酶質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL，酶解溫度為45 ℃，pH 5.5，酶解時間為100 min，料液比1∶20，驗證試驗劍麻總皂苷的平均提取率為19.20%。加標(biāo)回收率顯示，平均回收率在91.1%，RSD為1.52%，說明該方法比較準(zhǔn)確，可用于皂苷類成分提取的檢測。

纖維素酶解法提取劍麻總皂苷，綠色環(huán)保，可為纖維素酶解法提取劍麻總皂苷的工業(yè)化提供參考。

[1] 計志忠.化學(xué)制藥工藝學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997：12.

[2] 李作平，衛(wèi)恒巧.甾體皂甙的生物活性[J].國外醫(yī)藥(植物藥分冊)，1996，11(2)：51-55.

[3] 韓耀玲.劍麻的綜合利用[D].南寧：廣西大學(xué)，2014：1-3.

[4] 李少亮.天然甾體皂苷的提取分離現(xiàn)狀[J].遼寧化工，2010，39(4)：428-430.

[5] 周寧，趙曉璐，謝慶武.超聲波輔助提取劍麻總皂苷的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016(8)：26-28，30.

[6] 鄧楚津，聶芳紅.超臨界CO2萃取劍麻中總皂苷的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29(2)：41-44.

[7] 馬超，丁怡，王偉，等.劍麻總皂苷制備工藝研究[J].中國中藥雜志，2005，30(5)：391-393.

[8] 楊力，賈桂云.酶解法提取海南龍血樹葉總皂苷的工藝研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，25(4)：421-424.

[9] 黃山，公衍玲，金宏.酶法提取絞股藍總皂苷工藝條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2009，30(4)：178-180，273.

[10] 叢浦珠，陳延鏞，黃量.龍舌蘭屬植物中甾族皂甙元的研究——Ⅱ.劍麻中甾族皂甙元的分離和鑒定[J].化學(xué)學(xué)報，1976，34(3)：179-195.

[11] 趙文浩，黃國峰，王俊.劍麻渣中的皂苷/皂苷元成分研究[J].廣西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015，40(3)：532-544.

[12] 楊安平，蔡小連.纖維素酶提取無患子總皂苷的正交設(shè)計實驗優(yōu)選[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，18(3)：73-74.