高效液相色譜法測(cè)定橙汁中酸性大紅GR的不確定度評(píng)定

袁 圓 曾 輝 肖 艷 楊麗霞 崔曉嬌 楊 韻 吳后呂

(1. 長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410036；2. 國(guó)家酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心〔湖南〕，湖南 長(zhǎng)沙 410036；3. 湖南國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心〔長(zhǎng)沙海關(guān)口岸門診部〕，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

酸性大紅GR又名酸性紅73，為黃光紅色粉末，屬于偶氮類生物染色劑，溶于水、乙醇和乙二醇乙醚，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，主要用于毛絲織物、皮革和紙張的染色，還可用于塑料、木材和水泥等的著色[1-4]。酸性大紅GR是一種強(qiáng)致癌物，為食品禁用色素[5-6]。由于酸性大紅GR具有水溶性好、顏色鮮艷、固色能力強(qiáng)和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，有不法經(jīng)營(yíng)者為了美化食品的外觀，將其充當(dāng)食用色素添加到食品中。2021年7月28日，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布的《食品中酸性大紅GR的測(cè)定》[7]等4項(xiàng)食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的公告(2021年第28號(hào))，為檢測(cè)食品中違法添加酸性大紅GR提供了有力的技術(shù)支撐。

不確定度是表征合理賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[8-10]。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果能提供不確定度數(shù)值時(shí)可以很大程度提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性[11-12]。研究擬參照BJS 202107《食品中酸性大紅GR的測(cè)定》中的液相色譜法測(cè)定自制陽(yáng)性橙汁中酸性大紅GR含量(定量限為1.5 mg/kg)，依據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析，以期為高效液相色譜法檢測(cè)橙汁等復(fù)雜基質(zhì)中酸性大紅GR含量的測(cè)量及結(jié)果判定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸性大紅GR標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.8%，北京曼哈格生物科技有限公司；

甲酸：色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

甲醇：色譜純，德國(guó)默克化工公司；

乙酸銨、無(wú)水乙醇、氨水、檸檬酸、乙酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

橙汁：市售；

陽(yáng)性橙汁：實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters Alliance e2695型，配2998PDA檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國(guó)密理博公司；

電子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；

離心機(jī)：ST16R型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

氮吹儀：N-ECAP45型，美國(guó)Organomation公司；

固相萃取裝置：HSE-24B型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 依據(jù)BJS 202107《食品中酸性大紅GR的測(cè)定》進(jìn)行樣品處理。

(1) 樣品提?。壕_稱取2.0 g(精確到0.000 01 g)樣品于50 mL離心管中，用移液器移取10 mL無(wú)水乙醇—氨水—水(V無(wú)水乙醇∶V氨水∶V水=7∶2∶1)溶液加入到樣品中，搖勻后超聲5 min，以8 000 r/min的速度離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。重復(fù)上述步驟提取2次，合并提取液，于60 ℃水浴下用氮?dú)獯抵? mL以下。用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0～4.0。

(2) 樣品凈化：加少許水將1 g聚酰胺粉調(diào)成糊狀，倒入提取液中攪拌均勻后再倒入G3垂熔漏斗中抽濾，依次用60 ℃ pH 4的水、甲醇—甲酸(V甲醇∶V甲酸=6∶4)溶液和水洗滌容器、垂熔漏斗3～5次，直到洗出的水溶液pH為中性后，再用無(wú)水乙醇—氨水水(V無(wú)水乙醇∶V氨水∶V水=7∶2∶1)溶液洗滌3～5次，至吸附的色素完全解吸后，收集全部解吸液至離心管，用乙酸調(diào)節(jié)pH直至中性，于60 ℃水浴下氮吹至近干，加入甲醇—水(V甲醇∶V水=6∶4)溶液溶解，定容至5 mL后渦旋混勻，用0.45 μm 尼龍膜過(guò)濾，濾液供高效液相色譜分析測(cè)定。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇—0.01 mol/L乙酸銨(V甲醇∶V乙酸銨=60∶40)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)512 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取0.025 34 g酸性大紅GR標(biāo)準(zhǔn)品溶于水中，定容至25 mL A級(jí)容量瓶中，得到1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)中間液：用移液管(A級(jí))準(zhǔn)確移取2.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶(A級(jí))中，用水定容，得到20.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液管(A級(jí))分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10，0.25，0.50，2.50，5.00，10.00 mL于10 mL容量瓶(A級(jí))中，用水稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

橙汁中酸性大紅GR含量按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

X——試樣中酸性大紅GR含量，mg/kg；

v——試樣定容體積，mL；

c——測(cè)定試液中酸性大紅GR的質(zhì)量濃度，μg/mL；

c0——空白試液中酸性大紅GR的質(zhì)量濃度，μg/mL；

m——試樣質(zhì)量，g；

1 000——單位換算系數(shù)。

2.2 不確定度來(lái)源分析

通過(guò)對(duì)檢測(cè)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析得出，高效液相色譜法測(cè)定橙汁中酸性大紅GR不確定度來(lái)源如圖1所示。

圖1 不確定度來(lái)源分析圖

2.3 不確定度的評(píng)定

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的不確定度urel(std1)

(2) 配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液需使用3支1 mL A級(jí)移液管，1支2 mL A級(jí)移液管，2支5 mL A級(jí)移液管，5個(gè)10 mL A級(jí)容量瓶，1個(gè)100 mL A級(jí)容量瓶，計(jì)算得出各量具引入的相對(duì)不確定度見(jiàn)表1，配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的相對(duì)不確定度urel(c)按式(2)計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各量具引入的不確定度

表2 配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的相對(duì)不確定度

(2)

式中：

urel(c)——配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的不確定度；

urel(v1)——移液管引入的相對(duì)不確定度；

v2——移液管移取的體積，mL；

v3——移液管的體積，μg/mL；

urel(v4)——容量瓶引入的相對(duì)不確定度；

10——容量瓶的體積，mL。

通過(guò)式(2)，可以得出標(biāo)準(zhǔn)系列各濃度引入的不確定度的詳細(xì)過(guò)程。

因此，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(std2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度分別為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)分析3次，用最小二乘法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度與峰面積進(jìn)行擬合，得到線性回歸方程見(jiàn)表3。通過(guò)式(3)計(jì)算得出殘差標(biāo)準(zhǔn)差s為2 274.98。樣品平行測(cè)定7次，測(cè)得樣液平均濃度C0=0.586 8，定容體積為5.0 mL，將各數(shù)值代入式(1)，計(jì)算得出試樣中酸性紅含量為1.46 mg/kg，再由式(4)求得擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.021。

表3 線性回歸方程

(3)

(4)

式中：

Aj——第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的第j次計(jì)數(shù)值；

B1——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，53 154.78；

B0——截距，1 386.48；

Ci——第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；

C0——樣品的平均質(zhì)量濃度，0.586 7 μg/mL；

S——工作液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，2 274.98；

P——樣品的測(cè)量次數(shù)，7；

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)，18；

urel(std2)——標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3.6 樣液的定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(νd)

2.3.8 重復(fù)測(cè)定樣品引入的相對(duì)不確定度urel(X) 取被測(cè)樣品重復(fù)檢測(cè)7次(n=7)，按式(5)和式(6)計(jì)算，得出樣品中酸性大紅GR含量、重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)測(cè)定引入的不確定度

(5)

(6)

式中：

Xi——酸性大紅GR第i次測(cè)量的含量，mg/kg；

n——測(cè)量次數(shù)，7；

s(X)——重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

urel(X)——重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)不確定度。

2.3.9 樣品回收率引入的相對(duì)不確定度urel(R) 對(duì)空白試樣進(jìn)行添加量為3.0 mg/kg的加標(biāo)試驗(yàn)(n=7)，按式(7)、式(8)和式(9)計(jì)算，得出酸性大紅GR的回收率引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表5。

表5 樣品回收率引入的不確定度

(7)

(8)

(9)

式中：

Ri——酸性大紅GR第i次測(cè)量的回收率，%；

n——測(cè)量次數(shù)，7；

s(R)——回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

u(R)——回收率引入的不確定度；

urel(R)——回收率引入的相對(duì)不確定度。

2.3.10 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel根據(jù)式(10)合成各分量得到：urel=0.038。

(10)

2.3.11 擴(kuò)展不確定度 該測(cè)量誤差的分布類型屬正態(tài)分布，在置信水平為95%時(shí)，取k=2。擴(kuò)展不確定度U=urel×k×X=0.038×2×1.46=0.11。

2.3.12 不確定度評(píng)定結(jié)果 采用高效液相色譜法測(cè)定橙汁中酸性大紅GR含量，檢測(cè)結(jié)果表示為X=(1.46±0.11) mg/kg (k=2)。

3 結(jié)論

研究所用自制陽(yáng)性橙汁樣品中酸性大紅GR含量的檢測(cè)結(jié)果為X=(1.46±0.11) mg/kg (k=2)，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定橙汁中酸性大紅GR含量可能引入的不確定度分量進(jìn)行評(píng)定。評(píng)定結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和高效色譜儀分析引入的不確定度為測(cè)定過(guò)程中不確定度的主要來(lái)源。在實(shí)際檢測(cè)中可以通過(guò)提高標(biāo)準(zhǔn)品純度、控制標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)過(guò)程和定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，來(lái)減小測(cè)量結(jié)果的不確定度，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。