轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑棉花在雜交制種中的應(yīng)用初探

高明偉 王秀麗 張超 陳瑩 姜輝 王家寶 柴啟超 王永翠 趙軍勝

摘要：以轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑棉花種質(zhì)為父本，以不具有除草劑抗性的普通陸地棉種質(zhì)為母本，實(shí)施不去雄直接授粉配置雜交組合，并繼而對(duì)其F1代雜交種苗期進(jìn)行除草劑篩選鑒定，據(jù)此探討出一種簡(jiǎn)化制種方法。SSR分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，該方法可以得到100%純度的雜交種。該方法進(jìn)一步改良后可以結(jié)合營(yíng)養(yǎng)缽育苗在棉花雜交制種中推廣，在簡(jiǎn)化制種技術(shù)上有重要利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：棉花；EPSPS基因；除草劑；赤霉素；簡(jiǎn)化制種

中圖分類號(hào)：S562.035.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）03-0029-04

Abstract In this paper， a simplified method of cotton hybrid seed production was discussed. The EPSPS transgenic cotton with herbicide resistance was used as the male parent， and the normal upland cotton germplasm was used as the female parent to carry out cotton seed production through direct pollination without castration， and then the F1 hybrids with herbicide resistance were screened out at seedling stage. The SSR molecular marker detection results showed that the simplified seed production method could produce 100% pure hybrids. This method can be further improved and popularize in the hybrid seed production of cotton with the combination of seedling nursing with nutrient bowl， which will have important utilization value in simplified seed production technology.

Keywords Cotton； EPSPS gene； Herbicide； Gibberellin； Simplified seed production

種植抗除草劑棉花可以擴(kuò)大棉田殺草譜，使田間雜草防除變得簡(jiǎn)便易行，是降低除草成本、提高植棉效益的有效途徑[1]。草甘膦（glyphosate） 是目前廣泛應(yīng)用的內(nèi)吸型廣譜性除草劑，它通過(guò)抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，從而殺滅雜草，對(duì)植物無(wú)選擇性[2]。國(guó)內(nèi)外科技工作者先后創(chuàng)制出轉(zhuǎn)G6-EPSPS、CP4-EPSPS、GR79-EPSPS等基因的抗除草劑棉花種質(zhì)[4-6]，為培育具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦棉花品種奠定了基礎(chǔ)。研究表明特定濃度的草甘膦可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)EPSPS基因棉花產(chǎn)生雄性不育，因此在棉花育種及雜交制種中研究較多，可用于簡(jiǎn)化制種[7-11]。然而此前的研究均是以抗除草劑棉花作為母本進(jìn)行簡(jiǎn)化制種，但抗除草劑棉花只作母本也限制了雜種優(yōu)勢(shì)的充分利用。本研究擬初步探討一種以轉(zhuǎn)EPSPS基因棉花種質(zhì)作父本進(jìn)行簡(jiǎn)化制種的方法，為抗草甘膦棉花育種應(yīng)用以及商業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗除草劑棉花品系R02及R118：利用引自浙江大學(xué)以中棉所49為受體的轉(zhuǎn)G6-EPSPS基因的原始抗除草劑材料，與本課題組自育材料回交轉(zhuǎn)育而成。

非抗草甘膦品系為G35：本課題組自育材料。

除草劑：41%農(nóng)達(dá)（孟山都公司生產(chǎn)的草甘膦）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組合配制 2016年將R02、R118和G35種植于山東棉花研究中心臨清試驗(yàn)站，管理措施同大田。共有兩組雜交組合，組合1為G35×R02，組合2為G35×R118。

母本處理方式分為兩種，即處理A為對(duì)照，不噴施赤霉素；處理B為現(xiàn)蕾后15 d，用濃度為100 mg/kg的赤霉素整株均勻噴施，此后每隔10 d噴施同等濃度赤霉素1次，共噴3次。試驗(yàn)用赤霉素為Sigma公司生產(chǎn)的分析純G7645。

母本開花后不去雄，用父本直接進(jìn)行人工授粉，并在盛花期調(diào)查母本兩個(gè)處理下連續(xù)20棵棉花的柱頭長(zhǎng)度。

1.2.2 雜種田間除草劑篩選鑒定 2017年將親本R02、R118和G35及上年度獲得的4組雜交種種植于山東棉花研究中心臨清試驗(yàn)站，每個(gè)材料種植3行，面積為20 m2。

在苗期選擇晴朗天氣用100倍41%農(nóng)達(dá)除草劑噴施葉片，3 d后觀察表型。G35與非抗單株葉片邊緣皺縮枯萎，R02、R118與抗性單株葉片無(wú)變化。對(duì)表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，雜種中抗性單株標(biāo)記為真雜種。

1.2.3 雜種室內(nèi)分子鑒定 提取全部抗性單株及親本DNA，利用棉花基因組SSR標(biāo)記對(duì)雜交種真?zhèn)涡赃M(jìn)行分子鑒定。棉花基因組DNA提取采用簡(jiǎn)化的CTAB法[12]，DNA用1×TE溶解，稀釋到50 ng/μL備用。選擇多態(tài)性好的核心引物用于雜交種分子鑒定[13-15]，SSR標(biāo)記序列來(lái)自棉花標(biāo)記公共數(shù)據(jù)庫(kù)CMD（http：//www.cottonmarker.org/），引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增在ABI9700PCR儀上進(jìn)行，體系為20 μL，包括2×EasyPCR mix 10 μL，DNA模板1μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后[16]用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳分離結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS軟件處理，用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素處理后柱頭伸長(zhǎng)效果

如圖1所示，經(jīng)赤霉素噴施誘導(dǎo)后，母本G35柱頭明顯伸長(zhǎng)。未進(jìn)行赤霉素誘導(dǎo)的處理A的柱頭平均長(zhǎng)度為0.05 cm，而處理B的柱頭長(zhǎng)度平均為1.03 cm，柱頭平均伸長(zhǎng)近1.0 cm，差異達(dá)到極顯著水平（表1）。

2.2 制種純度的田間鑒定

抗除草劑單株和非抗單株對(duì)41%農(nóng)達(dá)的敏感性明顯不同，噴施農(nóng)達(dá)3 d后，非抗單株生長(zhǎng)明顯被抑制，葉片邊緣皺縮，局部出現(xiàn)壞死斑，而抗性單株生長(zhǎng)正常（圖2）。根據(jù)葉片對(duì)農(nóng)達(dá)的反應(yīng)程度對(duì)各處理組合制種純度進(jìn)行田間鑒定，結(jié)果如表2所示：不噴施赤霉素情況下，組合1的田間鑒定純度為36.09%，組合2的田間鑒定純度為37.32%，平均純度為36.71%；赤霉素誘導(dǎo)后，組合1的田間鑒定純度為43.40%，組合2的田間鑒定純度為48.31%，平均純度為45.86%。這說(shuō)明赤霉素誘導(dǎo)后柱頭伸長(zhǎng)，在一定程度上降低了棉花自交率，但是在本研究中差異不顯著，效果不理想。

2.3 雜種純度分子鑒定

用棉花基因組SSR標(biāo)記對(duì)具有除草劑抗性的雜種植株做進(jìn)一步分子鑒定，以明確其是否為真雜種。選取多態(tài)性較好的256對(duì)SSR引物對(duì)3個(gè)親本進(jìn)行差異篩選，共獲得9個(gè)差異共顯性標(biāo)記（表3）。

對(duì)組合1、組合2的F1存活單株分別進(jìn)行SSR檢測(cè)，結(jié)果顯示存活的單株均為真雜種，純度為100%。圖3、圖4分別為用CGR5732 和NAU1221標(biāo)記篩選部分F1單株的結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高棉花產(chǎn)量的有效途徑之一。利用不育系和人工去雄是目前生產(chǎn)雜交種的主要方式，但是不育系制種在很大程度上限制了親本選配，而人工去雄費(fèi)工費(fèi)時(shí)、成本高，因此探討不去雄直接授粉的簡(jiǎn)化制種為解決雜交制種難題提供了可能。本研究初步探討了以轉(zhuǎn)EPSPS棉花種質(zhì)為父本的簡(jiǎn)化制種方法。本試驗(yàn)還嘗試對(duì)母本進(jìn)行赤霉素誘導(dǎo)，結(jié)果處理后柱頭伸長(zhǎng)，在一定程度上降低了自交結(jié)實(shí)率，制種純度高于未經(jīng)赤霉素處理的對(duì)照，但效果并不理想。張銀虎[17]對(duì)sGK321進(jìn)行赤霉素誘導(dǎo)處理，優(yōu)化結(jié)果顯示濃度在100 mg/kg時(shí)制種產(chǎn)量及純度能達(dá)到理想水平。本研究未能達(dá)到同樣水平，可能是與所用的母本基因型不同有關(guān)，因此下一步有必要針對(duì)母本G35進(jìn)行赤霉素誘導(dǎo)最適濃度的探討。

本簡(jiǎn)化制種方法以非抗除草劑材料作母本，抗除草劑材料作父本，制種所得種子經(jīng)過(guò)田間除草劑篩選處理及分子標(biāo)記檢測(cè)，存活植株全部為真雜交種，說(shuō)明這種簡(jiǎn)化制種方式在生產(chǎn)上具有可行性。浸種是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的種子處理技術(shù)，具有易操作、高效、低成本的特點(diǎn)，有研究表明利用草甘膦浸種法鑒定轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花是可行的[18，19]，可以對(duì)本簡(jiǎn)化制種方法獲得的種子進(jìn)行草甘膦浸種，有效去除母本自交株?？紤]到雜交種生產(chǎn)上多用營(yíng)養(yǎng)缽育苗移栽的方式[20，21]，也可以對(duì)苗床用草甘膦預(yù)處理，保證大田使用的雜交種的高純度。因此，該方法進(jìn)一步優(yōu)化后可應(yīng)用于棉花雜交種子的生產(chǎn)，以達(dá)到簡(jiǎn)化制種省工的目的。

參 考 文 獻(xiàn)：

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