聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑?qū)λ镜厩【穆?lián)合毒力測(cè)定

吳斌 姜珊珊 張眉 徐德坤 王升吉 辛相啟

摘要：本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽（polyhexamethylene biguanidine hydrochloride）與氟環(huán)唑（epoxiconazole）混配對(duì)水稻稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）的毒力，旨在明確二者混配對(duì)水稻稻曲病菌的聯(lián)合作用類型及最佳配比。結(jié)果表明，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽、氟環(huán)唑?qū)λ镜厩【腅C50分別為44.111、1.743 mg·L-1，氟環(huán)唑?qū)λ镜厩【氖覂?nèi)毒力活性明顯高于聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑25∶1配比表現(xiàn)為相加作用；5∶1、10∶1、15∶1和20∶1四個(gè)配比表現(xiàn)為增效作用，其中，配比為10∶1和15∶1的SR分別為1.64和1.66，增效作用明顯。

關(guān)鍵詞：聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽；氟環(huán)唑；水稻稻曲病菌；聯(lián)合毒力；增效作用

中圖分類號(hào)：S435.111.4+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）02-0108-04

Abstract This study was conducted to clarify the co-effects of mixed polyhexamethylene biguanidine hydrochloride （PHMB） and epoxiconazole on Ustilaginoidea virens， and to find out their best mixed ratio by mycelium growth rate method.The results showed that the EC50 of PHMB and epoxiconazole to U. virens were 44.111 and 1.743 mg·L-1， respectively， which indicated that the indoor toxicity of epoxiconazole to U. virens was more active compared with PHMB. In the 5 different mixing ratios of PHMB and epoxiconazole， the ratio of 25∶1 could do additively， and the ratio of 5∶1， 10∶1， 15∶1 and 20∶1 had synergistic effect on U. virens； among which， the ratio of 10∶1 and 15∶1 showed the strongest synergistic effect with the synergistic coefficients as 1.64 and 1.66， respectively.

Keywords Polyhexamethylene biguanidine hydrochloride （PHMB）； Epoxiconazole； Ustilaginoidea virens； Combined toxicity； Synergistic effect

水稻稻曲病是由稻綠核菌[Ustilaginoidea virens（Cooke） Tak.]引起的一種水稻穗期病害，可導(dǎo)致水稻結(jié)實(shí)率顯著下降、品質(zhì)降低，一般可減產(chǎn)3%～5%，嚴(yán)重時(shí)達(dá) 8.7%～45.7%[1，2]。另外，稻曲病菌還能產(chǎn)生一種類似麥角多精的生物堿，抑制微管蛋白合成，對(duì)人畜安全造成威脅[3，4]。因此控制稻曲病的發(fā)生，對(duì)水稻生產(chǎn)及糧食安全至關(guān)重要。近年來(lái)，隨著全球氣候變化和矮稈緊湊型水稻品種、秈粳亞種間雜交稻組合的推廣以及施肥水平的提高，稻曲病在我國(guó)各地稻區(qū)普遍發(fā)生，且逐年加重，已從次要病害上升為主要病害[5-7]。水稻稻曲病的防治研究逐漸成為目前關(guān)注和亟待研究解決的問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)，水稻每穗谷粒數(shù)稀少、穗性較為松散的品種較為抗病[8，9]，但抗病品種往往不能滿足優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的生產(chǎn)實(shí)際需求。因此，選擇適當(dāng)藥劑并采用合適的施藥方法是防治水稻稻曲病的重要措施。由于稻曲病菌的侵染途徑及致病機(jī)制尚不明確[10，11]，化學(xué)防治仍較困難。當(dāng)前用于防治水稻稻曲病的藥劑主要有戊唑醇、氟環(huán)唑、咪鮮胺，均是麥角甾醇合成抑制劑。長(zhǎng)期使用同類型藥劑會(huì)提高病原菌抗藥性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。將三唑類殺菌劑與非麥角甾醇合成抑制劑混配，有利于延緩稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑抗藥性的發(fā)展。阮宏椿等[12]室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑與井岡霉素A按1∶2的比例混配共毒系數(shù)為174.78，增效明顯。李競(jìng)生等[13]采用菌絲干重法測(cè)定烯唑醇與井岡霉素混配對(duì)水稻稻曲病菌的毒力，發(fā)現(xiàn)二者按1∶3和1∶5的比例混配，SR值分別為1.812和1.905，表現(xiàn)出較好的增效作用。陳莉等[14]采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定藥劑混配對(duì)該病菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明丙環(huán)唑與井岡霉素按1∶10的比例混配，SR值為1.92，增效作用良好。

結(jié)構(gòu)類型不同的殺菌劑復(fù)配使用是提高防效、延緩抗藥性發(fā)展、降低用藥成本的重要途徑[15]。藥劑之間不同配比的聯(lián)合作用效果評(píng)價(jià)是殺菌劑復(fù)配的基礎(chǔ)研究工作。鑒于此，本研究測(cè)定了聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑單劑及其五種復(fù)配組合對(duì)水稻稻曲病菌的毒力，明確不同配比對(duì)該病菌的聯(lián)合作用類型，以期為復(fù)配藥劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

供試病原菌為水稻稻曲病菌（U. virens），用PDA培養(yǎng)基、經(jīng)常規(guī)組織分離法分離獲得，經(jīng)純化、鑒定及按照柯赫氏法則（Kochs Rule）[16]進(jìn)行致病性測(cè)定后保存?zhèn)溆?。病株采自山東濟(jì)南，試驗(yàn)于2013年10—11月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 供試藥劑

98.0%聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽原藥、96.7%氟環(huán)唑原藥，均由江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單劑毒力測(cè)定結(jié)果，混劑毒力測(cè)定設(shè)置5個(gè)配比，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽：氟環(huán)唑?yàn)?∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。2種單劑及5種混劑組合質(zhì)量濃度設(shè)置如下：

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽單劑的7個(gè)系列測(cè)試濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg·L-1；

氟環(huán)唑單劑及5種混配組合的7個(gè)系列測(cè)試濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg·L-1。

以藥劑有效成分在培養(yǎng)基中的濃度為測(cè)試濃度[17]。空白對(duì)照為0.1%吐溫-80水溶液。每處理重復(fù)4次。

1.3.2 藥劑配制 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽原藥用無(wú)菌水稀釋；氟環(huán)唑原藥用二甲基甲酰胺溶解。采用逐級(jí)稀釋法，用0.1%吐溫-80水溶液稀釋成各質(zhì)量濃度的藥液（藥液濃度為1.3.1中所述測(cè)試濃度的30倍）。

1.3.3 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)方法參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1156.2—2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第2部分：抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn) 平皿法》[18]。

在無(wú)菌條件下，用微量移液器從低濃度到高濃度，依次向裝有29.0 mL加熱融化的滅菌PDA培養(yǎng)基（溫度50～55℃）的瓶?jī)?nèi)，注入1.0 mL藥液，充分搖勻，分裝到3個(gè)培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）中，得到相應(yīng)濃度的含藥平板?？瞻讓?duì)照的培養(yǎng)基內(nèi)，注入1.0 mL 0.1%吐溫-80無(wú)菌水。

將供試病菌菌株于28℃條件下活化培養(yǎng)120 h，在無(wú)菌條件下，用滅菌打孔器（內(nèi)徑為0.6 cm）從其菌落邊緣切取菌餅。用接種針在無(wú)菌條件下將菌餅轉(zhuǎn)移至帶藥培養(yǎng)基平板中央，菌絲面朝下（菌絲面與培養(yǎng)基接觸），每只培養(yǎng)皿內(nèi)放置1個(gè)菌餅。將接菌后的培養(yǎng)皿于溫度28℃條件下培養(yǎng)120 h，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，單位為毫米（mm）。按式（1）計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-藥劑處理菌落增長(zhǎng)直徑空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑 ）×100（1）

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為x、以菌絲生長(zhǎng)抑制率的幾率值為y作回歸分析，求得毒力回歸曲線方程y=a+bx，計(jì)算各單劑及不同比例混劑的EC50及其95%置信限。

按Wadley法，計(jì)算增效系數(shù)（SR）；根據(jù)SR值評(píng)價(jià)藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR﹤0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR﹥1.5為增效作用，公式如下。

式中，A、B分別為聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽、氟環(huán)唑單劑，PA、PB為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，EC50（th）為混劑EC50理論值，EC50（ob）為混劑EC50實(shí)測(cè)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽、氟環(huán)唑單劑對(duì)靶標(biāo)病菌生長(zhǎng)的影響

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽濃度為0.1～100.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)水稻稻曲病菌的生長(zhǎng)抑制率為0.80%～61.89%；氟環(huán)唑濃度為0.05～50.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)水稻稻曲病菌的生長(zhǎng)抑制率為14.16%～87.44%，詳見表1。

2.2 聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑混配對(duì)靶標(biāo)病菌生長(zhǎng)的影響

聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1混配組合，濃度為0.05～50.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)水稻稻曲病菌的生長(zhǎng)抑制率分別為7.47%～78.15%、7.63%～76.06%、5.86%～72.21%、4.58%～60.00%、4.98%～57.59%，詳見表2。

2.3 對(duì)靶標(biāo)病菌的毒力及聯(lián)合作用類型

表3數(shù)據(jù)表明，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑?qū)λ镜厩【腅C50分別為44.111、1.743 mg·L-1，氟環(huán)唑?qū)λ镜厩【氖覂?nèi)生物活性明顯高于聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑配比為25∶1的SR值為1.43，二者混配表現(xiàn)為相加作用。二者配比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的SR值分別為1.56、1.64、1.66、1.52，均大于1.5，表明上述4種混配組合對(duì)水稻稻曲病菌都表現(xiàn)為增效作用，配比為10∶1、15∶1時(shí)，SR值大，增效作用明顯。

3 討論與結(jié)論

不同作用位點(diǎn)的藥劑混配能增強(qiáng)對(duì)病菌生長(zhǎng)的干擾而具有增效作用，是藥劑復(fù)配的基本原則之一。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽是一種高分子聚合物，其中的陽(yáng)離子與微生物細(xì)胞表面的陰離子部位形成靜電吸附，阻礙細(xì)胞溶菌酶作用，使細(xì)胞表層結(jié)構(gòu)變性破壞，從而殺死細(xì)菌或抑制細(xì)菌繁殖[19，20]。氟環(huán)唑是一種新型的三唑類殺菌劑，作用機(jī)制主要是抑制真菌中麥角甾醇的生物合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁不可修復(fù)的損傷[21]。聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑作用位點(diǎn)不同，符合藥劑復(fù)配的基本原則。另外，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞基本無(wú)影響，對(duì)各種材料也無(wú)侵蝕作用，可自然降解[22，23]。氟環(huán)唑與其混配，提高了藥劑的安全性，符合綠色植保的理念。

本研究結(jié)果表明，氟環(huán)唑?qū)λ镜厩【氖覂?nèi)生物活性明顯強(qiáng)于聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽；聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽與氟環(huán)唑以10∶1和15∶1配比混配，SR值分別為1.64和1.66，增效作用明顯，為復(fù)配制劑的研發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

在自然條件下，由于藥劑對(duì)病害的作用效果還要受田間環(huán)境因素和其他病蟲害發(fā)生情況等因素的影響，室內(nèi)測(cè)定結(jié)果與田間實(shí)際防治效果可能存在一定差異，本研究為自然條件下試劑防效提供了參考，田間防效還需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)一步驗(yàn)證。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 季宏平，張勻華，王芉，等. 水稻稻曲病發(fā)生為害調(diào)查及藥效防治研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2001，17（4）：37-38.