山東栽培豆與野生豆抗裂莢基因SHAT1—5的克隆及序列分析

林延慧 李偉 張彥威 劉赟 王彩潔 徐冉 張禮鳳

摘要：大豆的裂莢性是影響其產(chǎn)量的重要因素之一，因此栽培豆中豆莢開裂特性的遺傳學(xué)機(jī)制成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究以山東栽培豆（山寧11、山寧17、齊黃34、齊黃35和魯0305-1）及山東野生豆（東營(yíng)野生豆1、2號(hào)和山東野生豆1、2號(hào)）作為試驗(yàn)材料，根據(jù)已有報(bào)道，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆了一個(gè)大豆抗裂莢基因SHAT1-5，并對(duì)該基因的序列進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示，山東栽培豆和野生豆在SHAT1-5基因區(qū)約1 599 bp位置處，各自出現(xiàn)不同倍數(shù)的TAA重復(fù)。山東栽培豆與野生豆在SHAT1-5基因啟動(dòng)子上游4 kb關(guān)鍵調(diào)控區(qū)極度保守，栽培豆中不存在20 bp的缺失，這些結(jié)果與前人報(bào)道的東北栽培豆和野生豆中的情況有所不同。這表明，山東栽培豆與野生豆的裂莢性可能受其他基因的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：栽培豆；野生豆；裂莢；基因；多態(tài)性分析；啟動(dòng)子

中圖分類號(hào)：S565.103.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）02-0001-06

Abstract Pod shattering is one of the important factors affecting soybean yield. Therefore， the genetic mechanism of pod shattering trait in cultivated soybean has become a hot spot at domestic and overseas. In this research， the cultivars including Shanning 11， Shanning 17， Qihuang 34 and Lu 0305-1， and the wild germplasms including Dongying wild soybean 1 and 2 and Shandong wild soybean 1 and 2 were used as experimental materials. According to the previous reports， we cloned a pod shattering resistant gene SHAT1-5 through PCR amplification， and analyzed its DNA polymorphism. The results showed that SHAT1-5 appeared different multiples of TAA repeats at 1599 bp location in Shandong cultivated and wild soybeans， respectively. The key regulation region of about 4 kb in upstream of SHAT1-5 promoter was extremely conservative， and no deletion of 20 bp was found in Shandong cultivated soybean. These results are different from the previous reports， indicating that the pod shattering trait of Shandong cultivated soybean and wild soybean may be regulated by other genes.

Keywords Cultivated soybean； Wild soybean； Pod shattering； Gene；Polymorphism analysis； Promoter

大豆原產(chǎn)于中國(guó)，已有五千多年的栽培歷史，現(xiàn)已廣泛栽培于世界各地。大豆是中國(guó)重要的糧食、油料作物，但是中國(guó)大豆的產(chǎn)量一直處于較低的狀態(tài)，生產(chǎn)總量滿足不了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求。

栽培豆是由一年生野生豆馴化而來(lái)這一說(shuō)法被廣泛認(rèn)同[1]。種子的散播或者果實(shí)開裂是大多數(shù)作物馴化過(guò)程中重要的農(nóng)藝性狀[2，3]。大豆的裂莢性是影響其產(chǎn)量的重要因素之一，因此，栽培豆中豆莢開裂特性的遺傳學(xué)機(jī)制成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4-8]。

有報(bào)道顯示，東北栽培豆和野生豆中的抗裂莢基因?yàn)镾HAT1-5[8]。本研究以山東栽培豆和野生豆作為試驗(yàn)材料，克隆抗裂莢基因SHAT1-5并對(duì)該基因及其蛋白序列進(jìn)行分析，與前人報(bào)道結(jié)果進(jìn)行比較，尋找山東大豆野栽和東北大豆野栽之間抗裂莢基因SHAT1-5的差異，為進(jìn)一步挖掘控制山東大豆裂莢性基因提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以山東野生豆（東營(yíng)野生豆1、2號(hào)和山東野生豆1、2號(hào)）及山東栽培豆品種（山寧11、山寧17、齊黃34、齊黃35和魯0305-1）為試驗(yàn)材料。

試劑：CTAB、氯仿+異戊醇（24∶1）、異丙醇、乙醇、TE、TAE緩沖液、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根）、pEASY-Blunt3 Cloning Kit、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、 LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素、KOD FX酶。

1.2 DNA提取

取大豆苗期葉片，按照Rogers和Bendich（1998）的CTAB法（cetyltriethyl ammonium bromide），略作修改，進(jìn)行DNA的提取。

1.3 基因克隆

PCR反應(yīng)體系50 μL：DNA模板30 ng，dNTPs（2 mmol/L）10 μL， 2× KOD FX PCR buffer 25 μL，上游引物（10 μmol/L）1.5 μL，下游引物（10 μmol/L）1.5 μL，KOD FX（1 U/μL）1 μL，補(bǔ)水至50 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 min，58℃退火30 s，68℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min；4℃保存。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳

稱取瓊脂糖1 g，加入1×TAE緩沖液100 mL，加熱，待瓊脂糖完全溶解后，稍微放涼，加入Goldview搖勻，倒膠，插上梳子，放置20 min，待膠凝固之后開始點(diǎn)樣，120 V電泳20 min。

1.5 目標(biāo)片段的回收

利用天根公司的普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（DP204）進(jìn)行目的片段的回收。

1.6 載體連接

反應(yīng)體系參照pEASY-Blunt3 Cloning Kit試劑盒。

1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，搖菌富集，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上、37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.8 挑取單克隆及菌液PCR

在超凈工作臺(tái)中，向1.5 mL離心管內(nèi)加入LB液體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素）500 μL，用滅菌的槍頭挑取單克隆，放入離心管中，置于搖床上，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40 min。

菌液PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板 30 ng，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq buffer（10×）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.2 μL，補(bǔ)水至20 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.9 生物信息學(xué)分析

利用軟件DNAMAN進(jìn)行基因序列比對(duì)；利用軟件InterProScan對(duì)SHAT1-5蛋白的結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料裂莢性的調(diào)查

在大豆成熟期對(duì)栽培豆和野生豆的裂莢性進(jìn)行觀察記錄（表1）。結(jié)果顯示：山寧11、山寧17、魯0305-1、山東野生豆1號(hào)和山東野生豆2號(hào)裂莢，齊黃34、齊黃35、東營(yíng)野生豆1號(hào)和東營(yíng)野生豆2號(hào)不裂莢。

2.2 引物序列信息

根據(jù)已知的裂莢基因SHAT1-5序列（SoyBase數(shù)據(jù)庫(kù)https：//www.soybase.org/），利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增SHAT1-5基因啟動(dòng)子上游關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的引物序列SHAT1-5 P4-F/R；根據(jù)已有的報(bào)道獲得擴(kuò)增SHAT1-5基因區(qū)的引物序列SHAT1-5 gene-F/R[8]；利用M13通用引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)（表2）。

2.3 SHAT1-5基因啟動(dòng)子上游關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的克隆及序列分析

利用引物SHAT1-5 P4-F/R克隆山東栽培豆和野生豆9個(gè)品種中SHAT1-5基因的啟動(dòng)子上游關(guān)鍵調(diào)控區(qū)序列，獲得了約1 kb大小的目的片段，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)（圖1）。

利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，SHAT1-5基因啟動(dòng)子上游的關(guān)鍵性調(diào)控區(qū)序列在山東野生豆和栽培豆之間、裂莢和不裂莢材料之間是非常保守的，沒有差異性（圖2）。

2.4 SHAT1-5基因的克隆及序列分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的擴(kuò)增SHAT1-5基因區(qū)的引物序列SHAT1-5 gene-F/R[8]，對(duì)山東栽培豆和野生豆9個(gè)品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了SHAT1-5基因區(qū)約1.8 kb大小的目的片段，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)（圖3），然后切膠回收。

將回收產(chǎn)物連接pEASY-Blunt3 克隆載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，通過(guò)載體上的通用引物M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖4），根據(jù)菌液PCR結(jié)果挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)結(jié)果顯示，不同品種在SHAT1-5基因區(qū)約1 599 bp位點(diǎn)上存在差異，TAA呈現(xiàn)出不同的重復(fù)，山寧11、山寧17和魯0305-1是11個(gè)TAA重復(fù)；齊黃34、齊黃35是9個(gè)TAA重復(fù)；東營(yíng)野生豆1、2號(hào)是6個(gè)TAA重復(fù)；山東野生豆1號(hào)是9個(gè)TAA重復(fù)，山東野生豆2號(hào)是10個(gè)TAA重復(fù)（圖5）。

2.5 SHAT1-5蛋白的理化性質(zhì)分析

對(duì)SHAT1-5蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，SHAT1-5蛋白由443個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為49 kD，理論等電點(diǎn)pI為6.35。在組成SHAT1-5蛋白的18種氨基酸中，天冬酰胺（Asn）所占比例最高，達(dá)到10.8%，色氨酸（Trp）所占比例最低，僅為1.6%（表3）。SHAT1-5蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.38，表明該蛋白不穩(wěn)定。

2.6 SHAT1-5蛋白的結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用InterProScan軟件對(duì)SHAT1-5蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域（圖6），并對(duì)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如下：SHAT1-5蛋白中包含4個(gè)α-螺旋（紫色圓柱），7個(gè)β-折疊（黃色箭頭），其余部分為不規(guī)則卷曲（黑色直線）（圖7）。

3 討論與結(jié)論

在禾谷類作物中，落粒性與離層的消失有關(guān)，即花梗與外稃之間相連接處發(fā)生改變[9-13]。然而，單子葉植物（谷類）和雙子葉植物（豆類）在果實(shí)結(jié)構(gòu)上的差異暗示著種子落粒和豆莢開裂的機(jī)制有所不同[14-16]。

擬南芥、水稻和高粱中，已經(jīng)成功克隆與落粒性相關(guān)的基因。在擬南芥中，SHP1和SHP2是兩個(gè)與裂莢性狀相關(guān)的MADS-box基因，SHP1和SHP2編碼重復(fù)的蛋白，可以促進(jìn)IND和ALC編碼轉(zhuǎn)錄因子bHLH，進(jìn)而促使離區(qū)的發(fā)育[17-19]。水稻中，通過(guò)QTL定位成功分離了與種子落粒相關(guān)的基因，如sh4、qSH1、OsCPL1和SHAT1等[20-23]。高粱中克隆的第一個(gè)落?；蚴荢h1[13]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆裂莢性狀的研究大多處在分析其QTL 的水平。一個(gè)裂莢性狀的主效 QTL （qPDH1） 位于J連鎖群上Sat_093和 Sat_366這兩個(gè)標(biāo)記之間，并在不同的遺傳背景下證明該位點(diǎn)控制大豆裂莢的表型[24，25]。Funatsuki等通過(guò)圖位克隆的方法分離了一個(gè)裂莢抗性基因Pdh1，該基因在豆莢壁富含木質(zhì)素內(nèi)側(cè)厚壁組織中，尤其在木質(zhì)素沉積的初期高強(qiáng)度表達(dá)，從而增加干豆莢壁的扭曲度，促使裂莢[7]。還有報(bào)道稱，從野生大豆到栽培大豆的馴化過(guò)程中，受到強(qiáng)烈人工選擇的NAC基因家族SHAT1-5基因，其啟動(dòng)子上游約4 kb處的一個(gè)20 bp的抑制子缺失，導(dǎo)致SHAT1-5在栽培大豆纖維帽細(xì)胞中的表達(dá)量與野生豆相比提高了15倍，致使次生壁增厚，從而有效阻止了豆莢的自然開裂過(guò)程，該機(jī)制與禾谷類作物由于離層的失去導(dǎo)致落?？剐缘姆肿訖C(jī)制完全不同。該研究還對(duì)17種栽培豆和野生豆進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栽培豆在SHAT1-5基因區(qū)約1 599 bp的位點(diǎn)處都呈現(xiàn)11個(gè)TAA重復(fù)，野生豆在該位點(diǎn)處呈現(xiàn)6、7、9和10個(gè)TAA重復(fù)[8]。

本研究以山東本地的野生豆和栽培豆作為試驗(yàn)材料，克隆了SHAT1-5基因，并對(duì)其基因和蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山東栽培豆和野生豆在SHAT1-5基因啟動(dòng)子上游20 bp抑制子處極度保守，野栽之間不存在差異；進(jìn)而對(duì)山東栽培豆和野生豆的SHAT1-5基因序列進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)山東栽培豆在SHAT1-5基因區(qū)約1 599 bp的位點(diǎn)處存在9和11個(gè)TAA重復(fù)，而野生豆在該區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)出不同的TAA重復(fù)，分別為6、9和10個(gè)TAA重復(fù)。本研究結(jié)果與前人報(bào)道的結(jié)果不同，因此，山東大豆的裂莢性不受SHAT1-5基因的調(diào)控，可能受其他基因的控制。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Purugganan M D， Fuller D Q. The nature of selection during plant domestication [J]. Nature， 2009， 457（7231）：843-848.

[2] Hymowitz T. On the domestication of soybean [J]. Economic Botany， 1970， 24（4）：408-421.

[3] Diamond J. Evolution， consequences and future of plant and animal domestication [J]. Nature， 2002， 418（6898）：700-707.

[4] Petersen M， Sander L， Child R， et al. Isolation and characterisation of a pod dehiscence zone-specific polygalacturonase from Brassica napus[J]. Plant Molecular Biology， 1996， 31 （3）：517-527.

[5] Suzuki M， Fujino K， Funatsuki H. A major soybean QTL， qPDH1， controls pod dehiscence without marked morphological change[J]. Plant Production Science， 2009，12（2）：217-223.

[6] Yamada T， Funatsuki H， Hagihara S， et al. A major QTL， qPDH1， is commonly involved in shattering resistance of soybean cultivars[J]. Breeding Science， 2009， 59（4）：435-440.

[7] Funatsuki H， Suzuki M， Hirose A， et al. Molecular basis of a shattering resistance boosting global dissemination of soybean [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2014， 111（50）：17797-17802.

[8] Dong Y， Yang X， Liu J， et al. Pod shattering resistance associated with domestication is mediated by a NAC gene in soybean [J]. Nature Communications， 2014， 5（2）： 3352.

[9] Olsen K M， Wendel J F. A bountiful harvest： genomic insights into crop domestication phenotypes [J]. Annual Review of Plant Biology， 2013， 64（1）：47-70.

[10]Doebley J F， Gaut B S， Smith B D. The molecular genetics of crop domestication [J]. Cell， 2006， 127（7）：1309-1321.

[11]Li C， Zhou A， Sang T. Rice domestication by reducing shattering [J]. Science， 2006， 311（5769）：1936-1939.

[12]Simons K J， Fellers J P， Trick H N， et al. Molecular characterization of the major wheat domestication gene Q[J]. Genetics， 2006， 172（1）：547-555.

[13]Lin Z， Li X， Shannon L M， et al. Parallel domestication of the Shattering1 genes in cereals [J]. Nature Genetics， 2012， 44（6）：720-724.

[14]Lenser T， Theien G. Molecular mechanisms involved in convergent crop domestication [J]. Trends in Plant Science， 2013， 18（12）：704-714.

[15]Tiwari S P， Bhatia V S. Characters of pod anatomy associated with resistance to pod-shattering in soybean [J]. Annals of Botany， 1995， 76（5）：483-485.

[16]Christiansen L C， Dal D F P， Borkhardt B. Examination of the dehiscence zone in soybean pods and isolation of a dehiscence-related endopolygalacturonase gene [J]. Plant Cell & Environment， 2002， 25（4）：479-490.

[17]Liljegren S J， Ditta G S，Eshed Y， et al. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis[J]. Nature， 2000， 404（6779）：766-770.

[18]Liljegren S J，Roeder A H，Kempin S A，et al. Control of fruit patterning in Arabidopsis by INDEHISCENT [J]. Cell， 2004， 116（6）：843-853.

[19]Rajani S， Sundaresan V. The Arabidopsis myc/bHLH gene ALCATRAZ enables cell separation in fruit dehiscence [J]. Current Biology， 2001， 11（24）：1914-1922.

[20]Konishi S， Izawa T， Lin S Y， et al. An SNP caused loss of seed shattering during rice domestication [J]. Science， 2006， 312（5778）：1392-1396.

[21]Li C， Zhou A， Sang T. Rice domestication by reducing shattering [J]. Science， 2006， 311（5769）：1936-1939.

[22]Zhou Y， Lu D， Li C， et al. Genetic control of seed shattering in rice by the APETALA2 transcription factor SHATTERING ABORTION1[J]. Plant Cell， 2012， 24（3）：1034-1048.

[23]Ji H， Kim S R， Kim Y H， et al. Inactivation of the CTD phosphatase-like gene OsCPL1 enhances the development of the abscission layer and seed shattering in rice [J]. Plant Journal， 2010， 61（1）：96-106.

[24]Funatsuki H， Hajika M， Hagihara S， et al. Confirmation of the location and the effects of a major QTL controlling pod dehiscence， qPDH1， in soybean [J]. Breeding Science， 2008， 58（1）：63-69.

[25]Funatsuki H， Ishimoto M， Tsuji H， et al. Simple sequence repeat markers linked to a major QTL controlling pod shattering in soybean [J]. Plant Breeding， 2006， 125（2）： 195-197.