白血病動物模型的研究進展

任汝靜 尹 婷 洪 坤 孫建輝 王麗芳 代寶強 朱亞英 譚余慶

（中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700）

白血病是一類嚴重的血液系統(tǒng)疾病，是由造血干細胞的惡性克隆引起的[1-2]。由于白血病細胞的無限增殖、分化障礙和凋亡受阻等原因，使得白血病細胞在造血系統(tǒng)尤其是骨髓中大量的聚集，并向其他組織和器官轉(zhuǎn)移，造成對全身器官和組織的感染與浸潤，嚴重影響正常造血功能。近年來，由于白血病的高發(fā)與難治愈等因素，眾多研究人員對白血病的研究工作不斷深入。模型動物實驗作為藥效學和藥理學研究的最直接手段，是研究腫瘤性疾病發(fā)病、轉(zhuǎn)移、藥物篩選的重要手段[3-5]，同時在白血病研究中也起著關(guān)鍵性作用。

基于小鼠獲取方便、飼養(yǎng)容易、成本低廉、發(fā)病時間長短適宜等[6]特點以及與人類在病理學、生物學、遺傳學方面較為相近，使其成為最常用的白血病建模動物。另外，由于小鼠造血系統(tǒng)與人類存在相似之處[7]，并且人類白血病細胞可在免疫抑制預(yù)處理的小鼠體內(nèi)增殖而引發(fā)小鼠白血病，因此國內(nèi)外眾多學者針對小鼠開發(fā)出不同的模型來研究白血病發(fā)病的病理病機及治療方法。

1 白血病的分型及流行病學

按照發(fā)病緩急程度，白血病可分為急性白血病與慢性白血病，急性白血病以原始細胞和早期幼稚細胞為主，發(fā)病較急，病情嚴重，病程較短；慢性白血病以幼稚或者較成熟細胞為主，發(fā)病緩慢，病程可達數(shù)年之久。按照病變細胞系列分類，主要可分為髓系和淋巴系，其中，髓系按照細胞類型分又可分為粒、單、紅、巨核系，淋巴系按細胞類型分又可分為T細胞系和 B細胞系[8-9]。同時每類白血病又分為更多不同亞型，例如急性髓系白血?。ˋcute Myelogenous Leukem ia，AML）按照 FAB的分類方法又可分為 M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M0 這八種不同亞型。據(jù)調(diào)查報道，白血病在我國惡性腫瘤的死亡率中居前列，男性居第六位，女性居第八位，而兒童和35歲以下成人則居第一位。在發(fā)達國家，白血病也是一種常見的致死疾病，其在美國、西歐等國家的發(fā)病率高于亞非洲國家。據(jù)美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute， NCI）統(tǒng)計[10]，2008到2012年這五年間，平均每十萬人新增 13.3例白血病患者，平均每十萬人有 7例患者死亡，患者還在不斷增加。每個人一生中大約有1.5%的可能性會被診斷出患有白血病，2005年至 2011年的五年存活率只有58.5%，目前存活率還不高。近十年的白血病病例以0.2%的年均增長率增加，年均死亡病例24 450起，約占所有癌癥死亡病例的4.1%，由此可見白血病仍然是一種對人類有著巨大威脅的疾病。

2 小鼠白血病模型的建立

2.1 自發(fā)模型

小鼠自發(fā)白血病模型的建立最為簡單，某些品系的小鼠在生長過程中會自發(fā)白血病，只需在小鼠進行飼養(yǎng)過程中定期觀察、篩選出發(fā)病的小鼠即可。常用的有C58小鼠、AKR小鼠，C58小鼠是在1921年MacDowell用 Abby Lathrop的近交系鼠配得到的，在6個月齡后大多數(shù)開始出現(xiàn)淋巴細胞白血病癥狀，發(fā)病率高達85%以上。AKR小鼠至6～9個月齡時[11]，白血病的發(fā)生率可達70% ～90%，多為胸腺來源的淋巴細胞白血病。AKR自發(fā)白血病小鼠，出生即帶有致癌的RNA病毒，對藥物的治療反應(yīng)類似兒童急性淋巴細胞白血病。

2.2 誘發(fā)模型

用來誘發(fā)動物白血病的化學致癌劑包括多環(huán)碳氫化合物如9，10-二甲苯并蒽和亞硝基脲類如丁基亞硝尿等。丁順利等[12]利用7，12-二甲基苯蒽誘發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生急性紅白血病。最早利用病毒誘發(fā)白血病的研究是1951年Gorss應(yīng)用AKR近交系白血病小鼠的無細胞提取液接種C3H近交系新生乳鼠誘發(fā)白血病，隨后病毒與白血病的關(guān)系引起了人們很大的關(guān)注。Macdonald等[13]用8～12周齡CBA/H鼠，暴露于X線1次劑量3.0Gy，誘導小鼠白血病的產(chǎn)生。

2.3 移植模型

2.3.1 同源移植：同系動物腫瘤移植不產(chǎn)生免疫排斥現(xiàn)象。如可移植性小鼠白血病模型L615，先用T638病毒給新生的615近交系小鼠皮下或腹腔接種，發(fā)生白血病后，取白血病小鼠的脾或骨髓制成單細胞懸液給正常成年615小鼠皮下或腹腔接種，發(fā)病后再以同樣的方法在615小鼠中連續(xù)傳代建模[14]。研究人員把來源于 BABL/c小鼠的粒單細胞WEHI-3白血病細胞株通過靜脈接種等注射途徑均能在 BABL/c小鼠體內(nèi)成功建模[15-17]。姚苗苗等[18]通過DBA/2小鼠腹腔注射P388細胞，抽取發(fā)病小鼠腹水后移植到其他正常DBA/2小鼠腹腔內(nèi)，成功建立淋巴細胞白血病模型。何宏星等[19]將小鼠急性淋巴細胞白血病細胞L1210采用靜脈、皮下及腹腔注射三種方式接種于DBA小鼠體內(nèi)建立白血病動物模型，考察不同接種方法建立L1210白血病動物模型的成模情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方式均能100%成功建立模型，可以根據(jù)實驗指標的不同需求選擇相應(yīng)的移植方式。DBA小鼠是P388及L1210的特異宿主小鼠，是建立急性淋巴細胞白血病最理想的動物[20]。上世紀美國國家癌癥研究所曾用此兩種模型篩選了40萬種化合物。另外，移植時可結(jié)合注射腎上腺皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物和適量放射等方法，降低宿主免疫排斥反應(yīng)，提高建模成功率。

2.3.2 異源移植：異源移植常用于人源腫瘤移植于動物體內(nèi)表達，所建成的模型即為人源腫瘤移植模型（PDX模型）[21]。傳統(tǒng)異源移植是指將人源細胞在體外經(jīng)過篩選建立穩(wěn)定細胞株后，再移植入動物體內(nèi)。PDX模型是近來研究人員發(fā)現(xiàn)的異源移植的新移植方式，通過將臨床獲取的新鮮腫瘤組織或細胞原位或者異位接種于動物來建立模型。這種模型充分保留的原發(fā)腫瘤的生物學特性以及生長環(huán)境，因此最為接近臨床[22]。但血液系統(tǒng)腫瘤由于多數(shù)無實體腫瘤，因此很難建立PDX模型。異源移植多發(fā)生免疫排斥現(xiàn)象，可能會導致白血病異種移植失敗，可通過化療藥物和照射等的預(yù)處理抑制小鼠免疫功能，但建模較為麻煩。免疫缺陷小鼠的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用大大提高了該類動物模型建立的成功率。1983年 Bosma等[23]首先發(fā)現(xiàn)了 C.B-17純系小鼠16號染色體上的重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunod-eficiency，SCID）基因隱性突變后，小鼠T淋巴細胞和 B淋巴細胞功能缺失，因此得到SCID小鼠。由于SCID小鼠體內(nèi)尚存在部分非特異性免疫功能，造模過程中可能出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象。1992年 Prochazka等將 SCID小鼠與非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/Lt）回交得到非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠[24]，該小鼠的NK細胞功能也是缺陷的[25-26]，使得建模成功率大幅提升。國外有研究人員將K562細胞植入NOD/SCID小鼠后，成功建立紅白血病模型[27-28]。魏玉娜[29]通過 NOD/SCID小鼠尾靜脈注射 HL-60細胞的方法，成功建立了急性早幼粒細胞白血病模型。隨著科研人員的不斷探索NOD/SCID IL-2 receptor gamma null（NSG）小鼠成為了目前為止免疫缺陷程度最高的小鼠。開始在腫瘤性動物模型建立的科學實驗中推廣應(yīng)用。Saland等[30]研究人員將人源AML細胞株通過尾靜脈注射到經(jīng)全身照射或20 mg/kg腹腔注射馬利蘭預(yù)處理的NSG小鼠體內(nèi)，成功建立起一種高效和快速的異種移植動物模型來進行白血病的相關(guān)研究工作。

2.4 遺傳修飾小鼠模型

2.4.1 轉(zhuǎn)基因模型：1976年美國科學家 Jaenisch等利用反轉(zhuǎn)錄病毒把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因組，建立了世界上第一個白血病轉(zhuǎn)基因小鼠品系，隨后又有研究將vtAT與強力霉素結(jié)合，從而抑制四環(huán)素操縱子調(diào)控基因的時相表達，由此成功構(gòu)建了Bcr-Abl陽性的 CML模型[31-32]。Carron等[33]將TEL基因與胞漿激酶JAK2融合的基因（TELJAK2）的cDNA置于EmuSRalpha增強子/啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠白血病模型，將TEL-JAK2白血病細胞移植到小鼠體內(nèi)仍具有致瘤性。Ohtaki等[34]用人 T細胞白血病病毒-1型（HTLV-1）基因，成功建立了轉(zhuǎn)基因小鼠。TCL-1轉(zhuǎn)基因小鼠是目前應(yīng)用最為廣泛的CLL動物模型，McClanahan等[35]通過構(gòu)建TCL-1小鼠來模擬 CLL患者體內(nèi)的免疫缺陷，并采用過繼轉(zhuǎn)移PD-L1封閉性抗體治療發(fā)生CLL的TCL-1小鼠，最終成功阻止了CLL的發(fā)展，同時觀察到免疫效應(yīng)功能的重新激活。MiRNA29也是CLL的預(yù)后指標之一，它在CLL患者中高于正常，且惰性CLL中高于侵襲性 CLL。Pekarsky和 Croce[36]為進一步研究 MiRNA29的作用，在2010年構(gòu)建了MiR-NA29轉(zhuǎn)基因小鼠模型，這些小鼠的B細胞中過表達MiRNA29。他們通過該模型研究發(fā)現(xiàn)MiRNA29的作用靶點可能是腫瘤抑制因子-過氧蛋白。

2.4.2 基因敲除模型：1987年，Thomas和Capecchi的研究小組根據(jù)同源重組的原理試驗了哺乳動物細胞中導入基因的定點整合[37]，即基因打靶技術(shù)。而利用胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）同源重組的傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)在目前基因敲除研究中仍然重要[38]。Khanna通過胚胎干細胞打靶技術(shù)建立的ATM（A-T突變基因）白血病淋巴瘤動物模型[39]。Kawagoe等成功敲除 MN1-TEL融合基因，構(gòu)建成AML小鼠模型，用于研究MN1-TEL對白血病的作用機制。Carella構(gòu)建了 CBFβ-SMMHC基因敲除小鼠，并用于研究 CBFβ-SMMHC致 AML發(fā)生的機制。Fedorchenko等[40]為了研究 CD44在CLL中的作用，將 TCL-1小鼠與 CD44基因敲除小鼠雜交，得到 Eu-TCL-1：CD44-/-小鼠，這些小鼠表達低水平的抗凋亡基因MCL-1以及減弱的BCR激酶反應(yīng)。

2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的骨髓移植模型

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組含有編碼病毒功能蛋白的結(jié)構(gòu)基因及復制、整合、RNA轉(zhuǎn)錄及包裝所必需的順式作用區(qū)。將編碼病毒功能蛋白的結(jié)構(gòu)基因切除，插入白血病基因即構(gòu)成了完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將該載體導入包裝細胞，培養(yǎng)出具有感染能力的高效價逆轉(zhuǎn)錄病毒，用該病毒感染小鼠骨髓造血干細胞，移植到經(jīng)免疫抑制處理的同種小鼠體內(nèi)，通過綜合小鼠多項指標判定小鼠發(fā)病情況。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒法建立的模型嚴格上講也屬于基因修飾模型，但該方法既包括了準基因技術(shù)，也包括了移植技術(shù)，故本文將其單獨分為一類。

最早用該方法的是1990年，Daley等[41]利用BCR-ABL基因建立了發(fā)病率較低的CML模型。隨后研究人員通過優(yōu)化實驗條件[42]建立了眾多 AML相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的小鼠模型，2002年Guzman等[43]建立了 AML1-ETO模型，2006年以來眾多研究人員用該方法建立模型，Yan等[44]建立了AML1-ETO9a模型，Palmqvist等[45]建立了 NUP98-HOX，以及MLL相關(guān)融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的小鼠模型等。Hasegawa等[46]通過該方法成功建立了穩(wěn)定的MLL/AF9白血病模型。

采用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將某些致病基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，并在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達，建立起來的動物模型更為典型的代表了臨床白血病患者的真實情況，對優(yōu)化治療方案，研發(fā)更具療效的新藥提供了有利的工具。

3 白血病動物模型檢測技術(shù)的發(fā)展

目前常用的檢測小鼠白血病的方法有動物一般生活情況觀察，系統(tǒng)解剖學和病理學觀察組織器官病變程度，小鼠外周血象、骨髓像及脾臟細胞形態(tài)學檢查，還可用流式細胞儀分析小鼠骨髓和脾臟細胞表面抗原的改變，Cheng等用流式細胞術(shù)證明了AML患者骨髓細胞存在 CD33、CD123[48]。隨著技術(shù)水平的不斷提高，白血病模型動物建立的方法越來越多，傳統(tǒng)的鑒定成模的試驗方法和指標已經(jīng)不能完全代表小鼠發(fā)生白血病的真實情況，尤其是基因修飾建立的動物模型，并且有些傳統(tǒng)鑒定方法相對落后。為了更直觀、準確地判斷動物模型是否成功，在某些基因修飾模型中，采用RT-PCR檢測目的基因的表達和Western Blot檢測移植目的蛋白的表達的方法，能夠準確說明白血病基因在小鼠體內(nèi)是否存在和表達，此方法也成為目前為止基因修飾小鼠模型中最可靠的檢測手段。

4 結(jié)語

在白血病的研究工作中，采用小鼠白血病模型，既能在很大程度上說明研究成果，又避免了人體試驗所承受的巨大風險，為白血病的研究工作提供了安全可靠的手段。另外小鼠造血系統(tǒng)和遺傳學特性與人類存在相似性，在探究白血病的發(fā)病規(guī)律、治療方案、預(yù)后判斷等方面，使研究結(jié)果能夠接近于人。小鼠價格低廉，易于飼養(yǎng)，操作方法成熟，使得其成為理想的模型動物之一。