circRNA研究進(jìn)展*

陸彩霞 代解杰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118）

環(huán)狀 RNA（circRNA）是一類不同于線性 RNA的特殊的非編碼RNA分子，來(lái)源于基因的外顯子或內(nèi)含子區(qū)域，是近年來(lái)在RNA分子生物學(xué)領(lǐng)域冉冉升起的一顆新星。circRNA以共價(jià)鍵形成封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定。20世紀(jì)70年代 H.L.Sanger等[1]首次在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)了 circRNA。1979年 Hsu和 Coca-Prados在電子顯微鏡下觀察到環(huán)狀RNA也存在于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。1993年在小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)由性別決定基因Sry轉(zhuǎn)錄而來(lái)的circRNA。2006年又在果蠅中發(fā)現(xiàn)來(lái)自于盲肌的未知環(huán)狀 RNA。2012年，Salzman等利用RNA-Seq方法研究癌癥相關(guān)的染色體重排或基因融合，首次報(bào)道了環(huán)狀RNA不但在癌細(xì)胞樣本中存在，而且在人正常細(xì)胞系、小鼠腦組織中也大量存在，在細(xì)胞中的總量約占線性 RNA的1%，部分環(huán)狀RNA的豐度超過(guò)了對(duì)應(yīng)等位基因位點(diǎn)的線性RNA[2-3]。最新的研究表明，circRNA在疾病發(fā)生和發(fā)展階段發(fā)揮重要作用，可以作為潛在的分子生物學(xué)標(biāo)記。circRNA一開始被認(rèn)為是RNA異常剪接的產(chǎn)物[4]，加上表達(dá)豐度一直很低，又受限于當(dāng)時(shí)的檢測(cè)技術(shù)，并未引起研究者的注意。近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量的 circRNA分子，環(huán)狀 RNA開始正式進(jìn)入科研視界，開啟了circRNA快速研究發(fā)展的黃金時(shí)代。

1 circRNA的分子特征

circRNA與線性RNA結(jié)構(gòu)不同，沒(méi)有5'-3'的極性，也沒(méi)有 polyA尾巴，是封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此比線性RNA穩(wěn)定，不容易被 RNA核酸外切酶或者RNaseR降解。circRNA表達(dá)豐度差異大，在有些組織中，比對(duì)應(yīng)線性 RNA多10倍以上[5]。circRNA大部分由外顯子組成，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，由內(nèi)含子組成的circRNAs則存在于細(xì)胞核中，具有組織和時(shí)空特異性。比如hsa_circRNA_2149只在CD19+白細(xì)胞而不是 CD34+白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞或者HEK293中表達(dá)[6]。一些線蟲circRNA在卵母細(xì)胞中表達(dá)，在1-或者2-細(xì)胞胚胎中不表達(dá)。絕大部分的circRNA是內(nèi)源非編碼RNAs，只有一小部分是外源的 circRNA，如 HDV，含有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRESs）的人工circRNA[7]。不同物種間的circRNA大部分是進(jìn)化保守的，也有部分是進(jìn)化不保守的[5]。Gao等[8]對(duì)環(huán)形RNA外顯子結(jié)構(gòu)和可變剪接事件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)可變剪接事件在環(huán)形RNA內(nèi)部普遍存在，在定位上具有明顯的核內(nèi)傾向，同時(shí)表現(xiàn)出組織和發(fā)育階段特異的表達(dá)模式。

2 circRNA的形成機(jī)制

circRNA的產(chǎn)生方式不同于線性RNA的標(biāo)準(zhǔn)剪切模式，是通過(guò)反向剪切形成。現(xiàn)有的 circRNA形成機(jī)制有外顯子跳躍、直接反向剪切、環(huán)狀內(nèi)含子RNA（ciRNAs）形成模式、依賴于 RBPs環(huán)化模式、類似于可變剪切的可變環(huán)化模式[9]。

外顯子環(huán)狀RNA（circular exonic RNA）主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，由 pre-mRNA的索尾插接產(chǎn)生，即由下游外顯子的剪接供體連接到上游外顯子的剪接受體上的[10]。外顯子環(huán)化有2種模式[5]：模式1定義為外顯子跳躍，pre-mRNA的下游外顯子SD的3‘端連接到上游外顯子的SA的5'端，拉近了原本非相鄰的外顯子，形成套索，再切除內(nèi)含子，形成由2外顯子組成的 circRNA。模式2定義為內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化，pre-mRNA中的2個(gè)內(nèi)含子通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成套索，再切除內(nèi)含子，形成circRNA。William等[5]發(fā)現(xiàn)這兩種環(huán)化模型有一個(gè)共同特點(diǎn)，二者均包含互補(bǔ)性的ALU重復(fù)序列的長(zhǎng)側(cè)翼內(nèi)含子。當(dāng)兩個(gè)以上的外顯子在環(huán)化時(shí)，它們之間的內(nèi)含子可能滯留其中，最終形成既有外顯子又有內(nèi)含子的EIciRNA[11]。 ecircRNA和 EIciRNA由 3′-5′磷脂鍵連接環(huán)化。

內(nèi)含子環(huán)狀RNA（ciRNA）主要存在細(xì)胞核中，研究發(fā)現(xiàn)，部分內(nèi)含子在剪接作用中形成套索結(jié)構(gòu)，但是很快被脫分支降解[12]。而Zhang等[13]在Hela細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一些含關(guān)鍵核酸序列的內(nèi)含子能躲避分支酶降解，形成內(nèi)含子來(lái)源的環(huán)狀RNA.

3 circRNA的分類

3.1 ecircRNA（Exonic circRNA）

由外顯子構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄本的反向剪切形成，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中[14]。

3.2 ciRNAs

由內(nèi)含子形成，剪切于pre-mRNA，ciRNAs的形成依賴于一個(gè)在5'端含有7個(gè)富集GU的基序和分支點(diǎn)含有11個(gè)富集C的基序，在剪接作用后不被脫分支酶降解從而加工形成ciRNAs，主要存在于細(xì)胞核中[13]。

3.3 EIciRNA

內(nèi)含子保留的轉(zhuǎn)錄本反向剪切，當(dāng)兩個(gè)以上的外顯子在環(huán)化時(shí)，它們之間的內(nèi)含子可能滯留其中，最終形成既有外顯子又有內(nèi)含子的 EIcirRNA，主要存在于細(xì)胞核中[11]。

3.4 tricRNA（tRNA in tronic circRNA）

由pre-tRNA剪切后形成的tricRNA[15]。

4 circRNA的功能

4.1 m icroRNA海綿

目前已發(fā)現(xiàn)7種circRNA具有microRNA海綿作用：ciRS-7/CDR1as、Sry circRNA（circ-Sry）、 circ-ITCH、 circ-Foxo、 circRNA HRCR、circHIPK353 和hsa_circ_00156954[16]

CDR1as是小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物，是一種ecircRNA，其長(zhǎng)度約為1.5 kb，定位于細(xì)胞質(zhì)中，主要在人和小鼠的腦中表達(dá)。CDR1as含有超過(guò)70個(gè)能和m iR-7結(jié)合的位點(diǎn)，能吸附miR-7降低其活性，因此，CDR1as被稱為 miR-7的circRNA海綿[17]

Sry是性別決定基因，高表達(dá)于成年小鼠睪丸內(nèi)[18]，由Sry基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的 circRNA含有16個(gè)miR-138結(jié)合的保守位點(diǎn)，并作為miR-138的海綿發(fā)揮作用[17]。雖然這兩個(gè)circRNA都含有與之對(duì)應(yīng)的miRNA大量的結(jié)合位點(diǎn)是比較特殊的，但越來(lái)越多的研究表明circRNA在真核生物中作為miRNA海綿的功能是一個(gè)普遍的現(xiàn)象[16]。

4.2 調(diào)控母本基因表達(dá)

由于circRNA與其相同來(lái)源的線性miRNA的序列高度相似，可以通過(guò)cis或trans調(diào)控其母基因的表達(dá)。ciRNAs定位于細(xì)胞核中，通過(guò)與Pol II相互作用活化其母基因的轉(zhuǎn)錄[13]。EIcirRNA通過(guò)互補(bǔ)序列與U1snRNP和PolII結(jié)合，與U1 snRNP形成復(fù)合體，增強(qiáng)其母基因的轉(zhuǎn)錄[11]。

4.3 與RNA結(jié)合蛋白相互作用

目前研究發(fā)現(xiàn)有多種RNA結(jié)合（RNA-binding protein，RBP）可與 circRNA結(jié)合形成 RNA-蛋白質(zhì)復(fù) 合 體 （RNA-protein comp lex，RPC），調(diào) 控circRNA的形成。盲?。╩uscleblind，MBL）就是一種 RBP，可結(jié)合其親本基因第2外顯子，促進(jìn)其環(huán)化形成circMbl；同時(shí)，circMbl與 MBL相互作用，平衡circMbl和mblmRNA的生成[19]，外顯子來(lái)源的circRNA（ecircRNA）可以穩(wěn)定地與細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)分子特異性結(jié)合，作為骨架再通過(guò)互補(bǔ)序列與RNA或DNA結(jié)合。如ecircRNA可以與AGO蛋白和RNA聚合酶II相互作用進(jìn)而發(fā)揮 miRNA海綿參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用[20]。

4.4 circRNA編碼蛋白

盡管circRNA被定義為非編碼 RNA，但有研究報(bào)道真核核糖體可以啟動(dòng)含有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的 circRNA進(jìn)行翻譯。1995年 Chen和Sarnow[21]發(fā)現(xiàn)合成含IRES的circRNA可以招募核糖體啟動(dòng)翻譯機(jī)制，而不含 IRES的circRNA則不能。HDV是目前發(fā)現(xiàn)的一個(gè)環(huán)狀RNA分子，它可以編碼病毒相關(guān)蛋白質(zhì)，與肝炎發(fā)生有關(guān)[7]。Chen等[22]對(duì)有潛在編碼蛋白質(zhì)的circRNA進(jìn)行了IRES和開放閱讀框（ORF）的注釋，并用質(zhì)譜儀驗(yàn)證了蛋白的表達(dá)，建立了首個(gè)匯總可編碼蛋白的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)。

5 研究circRNA常用的數(shù)據(jù)庫(kù)

5.1 circBase

是一個(gè)通過(guò)收集和整合已經(jīng)發(fā)布的circRNA數(shù)據(jù)構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)。目前該數(shù)據(jù)庫(kù)收集包括以下6個(gè)物種的 circRNA信息：人（hg19）、小鼠（mm9）、秀麗線蟲（ce6）、黑腹果蠅（dm3）、矛尾魚（latCha1）、腔棘魚（latCha1）[23]。 網(wǎng)址：http：//www.circbase.org/

5.2 circRNABase

該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了108個(gè)高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)CLIPSeq（或稱為 HITS-CLIP，PAR-CLIP， iCLIP， CLASH）和mRNA降解組測(cè)序數(shù)據(jù)支持的m icroRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)整合已發(fā)表的 circRNA數(shù)據(jù)，構(gòu)建m iRNA與circRNA以及circRNA與RNA結(jié)合蛋白（RBP）的互作網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了最全面的靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件的交集和調(diào)控關(guān)系，但查閱不了circRNA的基因組信 息[24]。 網(wǎng) 址：http：//starbase.sysu.edu.cn/m irCircRNA.php。

5.3 Circ2Traits

是一個(gè)收集與人類疾病或性狀潛在關(guān)聯(lián)的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)預(yù)測(cè)miRNAs和人類的蛋白質(zhì)編碼基因、長(zhǎng)鏈非編碼基因及環(huán)狀RNA間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建了相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)m iRNAs-circRNA相互作用中的蛋白編碼基因進(jìn)行了GO富集分析，此外，將與疾病相關(guān)的 SNPs位點(diǎn)定位到circRNA基因座上，并鑒定了環(huán)狀RNAs上的 Ago相互作用位點(diǎn)[25]。網(wǎng)址：http：//gyanxetbeta.com/circdb/。

5.4 circNet

來(lái)源于464個(gè)RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步聯(lián)合m icroRNA等信息進(jìn)行了整合分析，并對(duì)新circRNA預(yù)測(cè)及基因組注釋，并計(jì)算已知的及新預(yù)測(cè)的circRNA表達(dá)情況，構(gòu)建circRNA-miRNA-genet調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。數(shù)據(jù)庫(kù)中含有circRNA分子序列、circRNA與 m iRNA及靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、circRNA分子的表達(dá)譜及circRNA分子的基因組注釋等信息[26]。 網(wǎng)址：http：//circnet.mbc.nctu.edu.tw/。

5.5 CircInteractom e

該數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了已知的109個(gè)RNA結(jié)合蛋白數(shù)據(jù)集與circbase中的circRNA的結(jié)合位點(diǎn)，并利用Targetscan軟件預(yù)測(cè)了m iRNAs與circRNA的潛在結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)可以進(jìn)行circRNA分子檢索，circRNA的PCR引物設(shè)計(jì)，circRNA的siRNA干擾序列 設(shè) 計(jì)[27]。 網(wǎng) 址：http：//circinteractome.nia.nih.gov/。

5.6 circRNADb

是首個(gè)匯總可編碼蛋白的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)。收錄了32 914條人類外顯子circRNA記錄，包括其基因組信息，外顯子剪切，所對(duì)應(yīng)基因組序列，對(duì)具有蛋白編碼潛能的 circRNA進(jìn)行了 IRES和 ORF注釋[22]。 網(wǎng)址：http：//reprod.njmu.edu.cn/circrnadb

其他的數(shù)據(jù)庫(kù)還有deepBase v2.0平臺(tái)（網(wǎng)址：http：//deepbase.sysu.edu.cn/）、 TSCD 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//gb.whu.edu.cn/TSCD）、CIRCpedia數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.picb.ac.cn/rnom ics/circpedia/）等，數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富方便了研究者對(duì)circRNA功能的進(jìn)一步研究。

6 circRNA與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

目前有許多研究表明circRNA在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了極其重要的作用，有在未來(lái)成為疾病新的檢測(cè)標(biāo)志物的潛力。已有研究表明circRNA與腫瘤[28]、動(dòng)脈粥樣硬化[29]、糖尿病[30]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病相關(guān)。也有大量研究表明circRNA在哺乳動(dòng)物腦中高表達(dá)[31-33]，尤其集中于突觸神經(jīng)小體中[34]，中腦，大腦的新皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)、胚胎的新皮質(zhì)區(qū)都存在不同種類的環(huán)狀RNA，一般來(lái)說(shuō)，神經(jīng)元越多的部位，環(huán)狀 RNA的含量也越多[35]。Zhang等[36]研究提示環(huán)形RNA在生理過(guò)程中同樣發(fā)揮重要功能，如在神經(jīng)分化過(guò)程中，大量環(huán)形RNA分子表達(dá)水平升高，提示環(huán)形RNA有可能在此過(guò)程中發(fā)揮作用。

小腦退化相關(guān)蛋白1/2（CDR1/2）是浦肯野氏細(xì)胞抗原，CDR1as是 CDR1的環(huán)狀天然反義轉(zhuǎn)錄物，在神經(jīng)組織中高表達(dá)，Ghosal等[25]預(yù)測(cè)其可能與帕金森有關(guān)，因?yàn)樯窠?jīng)元中m iR-7高表達(dá)，m iR-7可下調(diào)α-突觸核蛋白（α-synuclein）的表達(dá)，導(dǎo)致多巴胺生成細(xì)胞的損害，導(dǎo)致帕金森病。luKiw檢測(cè)到ciRS-7表達(dá)水平在散發(fā)型AD病人中顯著性降低，miR-7可以直接調(diào)節(jié)泛素化蛋白連接酶（UBE2A），UBE2A是一種有自體吞噬作用的噬菌蛋白，可以清除AD的淀粉酶和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性退化[37]。Westholm等研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅衰老過(guò)程中circRNA的水平相對(duì)于其線性miRNA持續(xù)增加，可以作為果蠅衰老的分子生物學(xué)標(biāo)記[38]。

朊病毒病（prion disease）是人類和動(dòng)物致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，Yamamura[39]報(bào)道在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPC）可促進(jìn) CDR1as的表達(dá)，說(shuō)明 PrPC可能參與了 CDR1as的調(diào)控，提示CDR1as在朊病毒病中可能發(fā)生作用。

7 展望

環(huán)形RNA是一類通過(guò)反向剪接，即下游剪接位點(diǎn)反向與上游剪接位點(diǎn)連接所形成的閉合環(huán)狀RNA分子，是非編碼RNA家族里一顆冉冉升起的新星，盡管大多數(shù)的環(huán)形RNA功能未知，但已有的研究顯示其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要功能。circRNA的這種特性預(yù)示著它在未來(lái)可能成為一種新型的生物標(biāo)志物，為疾病治療提供新的潛在的治療靶點(diǎn)。雖然circRNAs是目前研究的焦點(diǎn)，但該領(lǐng)域仍處于起步階段，還需要進(jìn)一步深入研究和探索circRNAs分子形成、降解機(jī)制及生物功能，其參與疾病發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組的世界可能比之前人們認(rèn)為的更加復(fù)雜。隨著目前研究工具的不斷完善，相信在不久的將來(lái)，科研工作者們將揭開circRNA的面紗，在后基因組時(shí)代開啟一扇基因及疾病研究的大門。