幾種常用的氨基酸分析技術(shù)研究進(jìn)展

馬 璐,雷 祿,黃雪秋,凌紹明

(1.百色學(xué)院 預(yù)科教育學(xué)院，廣西 百色 533000； 2.百色學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣西 百色 533000)

氨基酸是重要的生命物質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)中既含有羧基又含有氨基，是蛋白質(zhì)的基本組成單元，也是肌酸、肽類激素、神經(jīng)遞質(zhì)等含氮類物質(zhì)的原料來源。氨基酸在自然界中的存在形式既有游離態(tài)又有結(jié)合態(tài)。氨基酸分析在生物、醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域都有重要的意義。本文對(duì)目前用于氨基酸分析的幾種常用方法進(jìn)行綜述。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高、分析快、適用性強(qiáng)，在定性定量檢測(cè)得到廣泛的應(yīng)用。氨基酸分析方法主要采用反相HPLC，反相HPLC常以C18鍵合硅膠為固定相。由于大多數(shù)氨基酸缺乏具有強(qiáng)紫外吸收或有熒光效應(yīng)的官能團(tuán)，需要借助衍生試劑將氨基酸轉(zhuǎn)化成能被靈敏檢測(cè)的衍生物。目前氨基酸檢測(cè)多以柱前衍生反相高效液相色譜法為主。

孫言春等[1]以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)為柱前衍生試劑，采用BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離柱，以乙腈 ( 含0.15% (v/v ) 甲酸及30 mmol/L 乙酸銨) 和30 mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，流速為0.7 mL/min，光電二極管陣列檢測(cè)史氏鱘 、達(dá)氏鰉和小體鱘卵中17種氨基酸的含量。熊少祥等[2]采用3-對(duì)羧基苯甲酰喹啉-2-甲醛(CBQCA)將一級(jí)氨基酸衍生為具有強(qiáng)熒光信號(hào)的7-氮雜-1-氰基苯并異吲哚，建立了分離檢測(cè)鼠腦微透析液中氨基酸的反相HPLC新方法，該研究采用自組裝的高效液相色譜-激光誘導(dǎo)熒光-增強(qiáng)型電荷耦合器件檢測(cè)器裝置，比常規(guī)的熒光檢測(cè)器具有更優(yōu)異的性能。白文莉等[3]采用反相HPLC梯度洗脫分離，異硫氰酸苯酯(PITC)為柱前衍生劑，以正纈氨酸為內(nèi)標(biāo)，紫外檢測(cè)器測(cè)定馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F (ab＇)2中甘氨酸的含量。

近年來，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)發(fā)展迅速，質(zhì)譜能提取和確證特征性離子，具有較高的選擇性和靈敏度，且一般無需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，簡(jiǎn)便、快捷，該技術(shù)在氨基酸分析中有重要的應(yīng)用。

Dietzen等[4]建立了LC-MS/MS法檢測(cè)血漿、血清和尿液中的氨基酸，30種氨基酸在20 min內(nèi)達(dá)到基線分離，并將該方法與陽離子交換法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明該方法耗時(shí)更少，選擇性更佳。鄧其馨等[5]建立LC-MS/MS法對(duì)煙草中的游離氨基酸進(jìn)行定量分析，18種氨基酸在20 min內(nèi)得到很好的分離和測(cè)定，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，檢出限為0.5×10-4～0.1 mol/L，加標(biāo)平均回收率為90.0%～106.0%。該方法簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好，靈敏度高，滿足分析要求，適合煙草中游離氨基酸的檢測(cè)。鄭重等[6]用甲醇為樣品的提取試劑，無需衍生步驟，利用LC-MS/MS直接檢測(cè)敖東植物酵素中16種氨基酸的含量。線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，樣品回收率為86%～110%。郭華等[7]以鄰苯二甲醛衍生珍珠粉酸解液，采用LC-MS/MS技術(shù)同時(shí)分析珍珠粉中的7種氨基酸，7種氨基酸在0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9928～0.9990范圍內(nèi)，檢出限在0.03～15 ng/mL之間，回收率為95%～105%。

隨著分析技術(shù)的不斷提高，在HPLC的基礎(chǔ)上又開發(fā)出了檢測(cè)性能更優(yōu)異的分析儀器-超高效液相色譜(UPLC)，UPLC比普通HPLC具有更好的分離度和更高的靈敏度，極大地縮短了分析的時(shí)間，使得UPLC-MS/MS方法在氨基酸分析領(lǐng)域表現(xiàn)出更為廣闊的應(yīng)用前景。

Armenta等[8]建立了一種快速、重現(xiàn)性好、靈敏的UPLC-MS/MS法分析了惡性瘧原蟲和人體紅細(xì)胞中氨基酸的含量。Helmond等[9]使用酰胺型固定相，建立UPLC-MS/MS法用于檢測(cè)指紋樣品中的氨基酸，樣品無需衍生，可直接檢測(cè)。黃鑫等[10]建立了檢測(cè)大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)物質(zhì)的UPLC-三重四極桿質(zhì)譜法，不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化和固相萃取等復(fù)雜處理，10 min內(nèi)即可完成樣品中17 種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分離及確證，該方法檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性良好。李好麗等[11]為了分析烤煙中氨基酸含量與烤煙香型、產(chǎn)地的關(guān)系，以AQC為柱前衍生試劑，建立了UPLC-單重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定烤煙中20種游離氨基酸的分析方法。王星等[12]采用PITC為衍生化試劑，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS方法解析中藥材天南星中20個(gè)成分，其中包括2個(gè)胺類化合物和18個(gè)氨基酸，為中藥材中氨基酸類極性非紫外活性成分的分析方法的建立提供依據(jù)。

2 氣相色譜

氣相色譜是在氨基酸分析領(lǐng)域有較早應(yīng)用歷史的分析技術(shù)，由于氨基酸沸點(diǎn)較高，在測(cè)定前需將氨基酸衍生化為易汽化的衍生物。氣相色譜具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、易于與質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，不足之處在于衍生化過程易產(chǎn)生干擾物。

Persson等[13]將氨基酸進(jìn)行叔丁基二甲基硅烷化，并用13C、15N標(biāo)記方法，采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)對(duì)植物中的氨基酸進(jìn)行定量分析。張紅漫等[14]先用鹽酸水解沙苑子樣品，再對(duì)其水解液進(jìn)行酯化和酰化處理，采用GC-MS/MS共鑒定出15種氨基酸，其中7種為人體必需氨基酸，再由外標(biāo)法對(duì)每種氨基酸進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明沙苑子中氨基酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.32 %。侯捷等[15]建立了固相萃取-硅烷化衍生-氣相色譜質(zhì)譜法聯(lián)用分析精氨酸發(fā)酵液中的15種氨基酸，并計(jì)算15N標(biāo)記精氨酸發(fā)酵液中的氨基酸同位素豐度。楊芹等[16]用甲基叔丁基醚-甲醇-水體系提取蝎子樣品后，對(duì)提取液上層有機(jī)相物質(zhì)進(jìn)行甲酯化處理，對(duì)下層水相進(jìn)行硅烷化處理，再經(jīng)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析，研究發(fā)現(xiàn)在有機(jī)相中檢測(cè)到 30 種脂肪酸，在水相中檢測(cè)到氨基酸類、糖類及有機(jī)酸類等化合物，其中檢測(cè)到的氨基酸有18種。黃志等[17]以N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺為衍生化試劑，對(duì)萃取過的煙葉樣品進(jìn)行硅烷化衍生，再利用GC-MS/MS測(cè)定煙草中18種游離氨基酸，結(jié)果表明18種氨基酸的加標(biāo)回收率為97.4%～114.1%，RSD在0.17%～3.4%范圍內(nèi)，該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于煙草中氨基酸含量分析。

3 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳(CE)是以高壓直流電場(chǎng)為推動(dòng)力，毛細(xì)管為分離通道建立起來的分離技術(shù),不僅具有樣品用量少、分離效率高、分析速度快、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，且還能分離手性氨基酸。氨基酸樣品經(jīng)毛細(xì)管電泳儀分離后，能被相應(yīng)的檢測(cè)器識(shí)別，實(shí)現(xiàn)氨基酸的定性和定量分析。

Qi等[18]建立了手性配體電泳法對(duì)丹?；被徇M(jìn)行手性分離和檢測(cè)，該方法成功分離了17對(duì)氨基酸對(duì)映體，還能用于測(cè)定米醋中氨基酸的含量。Lorenzo等[19]建立了一種以4-氟-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑?yàn)檠苌噭┑拿?xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法成功測(cè)定了16份不同尿液樣品中7種氨基酸的含量。胡月芳等[20]建立了毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)(CE-ED)法測(cè)定淮山中8種必需氨基酸含量。先用乙醇處理淮山樣品，再用鄰苯二甲醛對(duì)樣品進(jìn)行衍生處理，采用CE-ED測(cè)定，8種氨基酸在12 min內(nèi)達(dá)到了基線分離，檢出限為0.01～0.05 μg/L。周賢婧等[21]基于樣品注入后背景吸收添加劑吸光度的減小，建立了毛細(xì)管電泳-間接紫外檢測(cè)法用于檢測(cè)蜂蜜中 9 種游離氨基酸，蜂蜜無需衍生，經(jīng)陽離子交換樹脂除去糖類物質(zhì)后直接進(jìn)樣分析，9 種氨基酸于11 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分離，檢出限最低達(dá)到0.3 mg /L，該方法已成功應(yīng)用于不同蜜源植物和產(chǎn)地的蜂蜜的測(cè)定。任挺鈞等[22]建立了毛細(xì)管電泳-電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法同時(shí)分析運(yùn)動(dòng)員營養(yǎng)補(bǔ)劑中的支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)，3種氨基酸在以乙酸為背景電解質(zhì)下，在20 min內(nèi)得到了基線分離，該方法避免了樣品衍生化處理，操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高。

4 離子交換色譜

陽離子交換色譜法是基于氨基酸在酸性條件下變成陽離子并經(jīng)陽離子交換色譜柱分離后，再與茚三酮發(fā)生衍生化反應(yīng)，產(chǎn)生能被紫外-可見光檢測(cè)器檢測(cè)的紫色或深藍(lán)色或黃色衍生物。以此為原理，科學(xué)家研發(fā)出了能使氨基酸分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的氨基酸分析儀，氨基酸分析儀極大縮短分析的時(shí)間。該方法具有分析快速、重現(xiàn)性好、自動(dòng)化程度高、準(zhǔn)確度高、能檢測(cè)多數(shù)氨基酸等優(yōu)點(diǎn)，但存在儀器造價(jià)高、靈敏度不高且需雙波長(zhǎng)檢測(cè)等不足。

馮志強(qiáng)等[23]建立采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定醬油中氨基酸的含量的方法，結(jié)果表明釀造醬油和配制醬油中氨基酸的種類及含量存在一定的差異，分析結(jié)果為釀造醬油和配制醬油的鑒別提供了一定的依據(jù)。苗雨田等[24]將黃酒經(jīng)氮?dú)獯蹈蓮?fù)溶后、過膜,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)黃酒中的游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，方法檢出限最低可達(dá)到0.01 mg/100 mL,回收率為90.1%～101.2%,該方法具有可靠、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量樣品的分析。黃永連等[25]利用鹽酸水解藻類后，采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析不同藻類樣品中氨基酸的組成及含量。

陰離子交換色譜-積分脈沖安培(HPIC-IPAD)法是一種最近發(fā)展起來的氨基酸檢測(cè)方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、選擇性高等特點(diǎn)，且無需對(duì)樣品進(jìn)行柱前或柱后衍生處理，能對(duì)氨基酸進(jìn)行直接分析。

李國強(qiáng)等[26]建立分析人血漿中16種游離氨基酸的HPIC-IPAD法，檢出限為0.11～3.3 μg/L,樣品回收率為 87%～117%，該方法操作簡(jiǎn)單，樣品無需衍生。Rombouts等[27]建立了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的HPIC-IPAD測(cè)定小麥蛋白、麥膠蛋白、麥谷蛋白中的氨基酸，樣品經(jīng)鹽酸水解后直接分析，無需衍生化或氧化處理。吳伶俐等[28]以AminoPac PAl0 為氨基酸分析柱，水、250 mmol/L NaOH和1 mol/L NaAc 為流動(dòng)相，采用HPIC-IPAD法對(duì)榴蓮中的17種氨基酸進(jìn)行定性和定量分析，方法檢出限為0.0028～0.0136 μmol/L，樣品加標(biāo)回收率在80.0%～112.9%之間，為榴蓮的食用和藥用價(jià)值的深入研究提供了參考。于宏曉等[29]采用AminoPac PA10陰離子交換柱，用HPIC-IPAD法測(cè)定煙草中18種氨基酸的含量，最低檢出限為0.03～0.75 μg/mL，利用該方法還對(duì)比了3種不同類型單料煙和國內(nèi)外不同卷煙中游離氨基酸的含量。

5 小結(jié)

氨基酸分析已成為食品、生命、醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域的重要內(nèi)容，其分析方法的研究與改進(jìn)也受到越來越多的關(guān)注。在衍生方法、柱載體化學(xué)和自動(dòng)化技術(shù)發(fā)展的驅(qū)動(dòng)下，涌現(xiàn)出一系列氨基酸分析技術(shù)，但這些分析方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。HPLC是氨基酸分析常用的方法，但易受衍生技術(shù)的限制。HPLC與能提取特征性離子的MS聯(lián)用，一般無需衍生處理可直接檢測(cè)氨基酸，在氨基酸檢測(cè)領(lǐng)域有重要應(yīng)用。UPLC-MS/MS不僅分析效率比常規(guī)HPLC高，且還能對(duì)氨基酸樣品進(jìn)行直接測(cè)定。GC雖與MS聯(lián)用，但該技術(shù)會(huì)受到衍生副產(chǎn)物的干擾。氨基酸分析儀自動(dòng)化程度高，但儀器多為國外進(jìn)口品牌，在成本上受到一定的限制。CE技術(shù)在手性氨基酸分析中有重要應(yīng)用。HPIC-IPAD能直接檢測(cè)氨基酸，避免樣品衍生步驟，有望成為氨基酸分析方法改進(jìn)和完善的新方向。經(jīng)過不斷改進(jìn)和完善，前處理簡(jiǎn)單、分析速度更快、選擇性好、準(zhǔn)確度高的氨基酸分析技術(shù)將會(huì)不斷涌現(xiàn)，為氨基酸分析領(lǐng)域打開新局面。