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    鯽魚水霉病病原的分離培養(yǎng)

    2018-03-29 11:19:08劉云鵬程子騫賈港徐孟杰
    江西水產(chǎn)科技 2018年6期
    關(guān)鍵詞:脫脂棉霉病斜面

    劉云鵬 程子騫 賈港 徐孟杰

    (河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北滄州 061100)

    鯽魚是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種之一,在我國大部分地區(qū)都有大規(guī)模養(yǎng)殖,主要集中在東部、中部和南部地區(qū),在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中具有重要地位。長期以來,人們在魚類水霉病的防治 研究中開展了大量的工作取得了許多成就。20世紀(jì)60年代,我國學(xué)者曾將水霉 (Proletarian)劃入藻狀菌綱、水霉目、水霉科。在鯽魚養(yǎng)殖過程中,感染水霉病的概率相當(dāng)高,水霉病是最常見的病害之一。

    1 實驗材料及方法

    1.1 實驗材料

    100%乙醇,感染水霉病的鯽魚,紗布,脫脂棉,土豆,瓊脂,葡萄糖。

    1.2 實驗儀器及設(shè)備

    玻璃棒,恒溫培養(yǎng)箱,鑷子,解剖剪,研砵,顯微鏡,接種針,酒精燈,電爐,1000 mL燒杯,1000 mL錐形瓶,試管15個,培養(yǎng)皿,高壓滅菌鍋,超凈工作臺,載玻片,蓋玻片。

    1.3 實驗所需試液的配制

    1.3.1 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基的配制

    將馬鈴薯洗凈、去皮,用電子天平稱取200g,均勻切碎,加入到1000 mL無菌水中煮沸,沸騰30 min,再分別加入15g葡萄糖和20g瓊脂,攪拌使其充分溶解,紗布過濾入錐形瓶,使用脫脂棉和牛皮紙封口備用。

    1.3.2 75%酒精溶液的配制

    用無水乙醇與水比例為3∶1配制酒精溶液。

    1.4 實驗操作

    1.4.1配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基,75%酒精溶液待用

    1.4.2實驗材料及用具的消毒

    準(zhǔn)備75%酒精,將病魚全面消毒,之后使用無菌水沖洗干凈。在干凈的培養(yǎng)皿中放一層紗布,并用少量無菌水浸濕,把洗好后的病魚放在紗布上,蓋好后室溫保濕1~2h。

    將試管用脫脂棉塞好,用牛皮紙封口、包好,將鑷子、解剖剪、接種針培養(yǎng)皿等實驗器材用牛皮紙包扎好,將其與培養(yǎng)基移入高壓滅菌鍋中,運行30min。

    1.4.3水霉菌的培養(yǎng)

    (1)馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面的制備。滅菌后馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45℃,在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入試管中,每支試管倒1/3左右,之后用脫脂棉塞好試管擺成斜面,冷卻凝固后貯存?zhèn)溆谩?/p>

    (2)接種。在超凈工作臺內(nèi)將解剖剪和接種針放在酒精燈火焰上燒烤消毒,取5個提前做好的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面,分別標(biāo)記1、2、3、4、5號,待解剖剪和接種針冷卻后,用解剖剪剪下少量病魚身上的菌絲,之后用接種針在無菌條件下送到5個培養(yǎng)基斜面上,之后用脫脂棉塞好試管。

    (3)恒溫培養(yǎng)。將5個試管放到恒溫培養(yǎng)箱里面,設(shè)定溫度為25℃,培養(yǎng)5天。

    (4)鏡檢。培養(yǎng)5天后,取出5個試管,觀察菌落生長情況,并用消毒后的鑷子在每個試管內(nèi)各取少量菌絲,做成裝片,在顯微鏡下觀察菌絲及動孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1),之后取孢子囊數(shù)量最多的2號試管備用。

    圖1 菌絲及動孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)

    (5)研磨和離心。用鑷子從2號試管內(nèi)取出適量菌絲,放入研砵里研磨,破開孢子囊;之后加適量無菌水一起放入離心管內(nèi),離心20 min,靜置備用。

    (6)稀釋分離。準(zhǔn)備五支滅菌試管依次編號1~5,分別裝入9 mL無菌水,用1 mL滅菌吸管,嚴(yán)格無菌操作,從靜置后的離心管內(nèi)分別吸取1 mL上清液注入1~5號管中,搖勻。

    (7)提純培養(yǎng)。從試管中各吸取1 mL懸浮液,將其分別注入到滅菌培養(yǎng)皿中,再加入馬鈴薯培養(yǎng)基15 mL,充分搖勻后靜置,使之冷凝;然后倒置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d。之后從中挑取單個菌落,接種于斜面上,放入恒溫箱中培養(yǎng)5 d。

    (8)確定種類。觀察菌絲形態(tài)及動孢子囊特征確定其屬,觀察有性生殖器官確定其具體種類。

    2 結(jié)果

    提純培養(yǎng)的菌絲如圖2所示。

    圖2 顯微鏡下提純培養(yǎng)的菌絲

    3 分析討論

    霉菌的菌絲較為粗長,菌落相對較大,部分霉菌菌絲呈蔓延式生長,可在整個培養(yǎng)基斜面上觀察到其菌落,部分種生長具有一定的局限性,直徑1~2 cm及以下,生長區(qū)域較小。5放線菌比較霉菌菌落質(zhì)地通常較為疏松,表面干燥,不透明,顯現(xiàn)為蛛網(wǎng)狀或絨毛狀。霉菌菌落緊密連接在培養(yǎng)基上,不容易挑??;菌落正反面的色彩、邊沿與中心的色彩基本不一致。

    水霉的菌絲呈管形,內(nèi)菌絲較為發(fā)達(dá),表現(xiàn)為纖細(xì)而分支繁多;外菌絲中等粗壯,無分隔[3]。根據(jù)圖2判斷,鯽魚水霉病病原為水霉目水霉科中的水霉屬(ProletarianC.G.Gees)。

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