鯽魚水霉病病原的分離培養(yǎng)

劉云鵬 程子騫 賈港 徐孟杰

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北滄州 061100)

鯽魚是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種之一，在我國大部分地區(qū)都有大規(guī)模養(yǎng)殖，主要集中在東部、中部和南部地區(qū)，在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中具有重要地位。長期以來，人們在魚類水霉病的防治 研究中開展了大量的工作取得了許多成就。20世紀(jì)60年代，我國學(xué)者曾將水霉 (Proletarian)劃入藻狀菌綱、水霉目、水霉科。在鯽魚養(yǎng)殖過程中，感染水霉病的概率相當(dāng)高，水霉病是最常見的病害之一。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

100%乙醇,感染水霉病的鯽魚,紗布,脫脂棉,土豆,瓊脂,葡萄糖。

1.2 實驗儀器及設(shè)備

玻璃棒，恒溫培養(yǎng)箱，鑷子,解剖剪，研砵，顯微鏡，接種針，酒精燈，電爐,1000 mL燒杯，1000 mL錐形瓶，試管15個，培養(yǎng)皿，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，載玻片,蓋玻片。

1.3 實驗所需試液的配制

1.3.1 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基的配制

將馬鈴薯洗凈、去皮，用電子天平稱取200g，均勻切碎，加入到1000 mL無菌水中煮沸，沸騰30 min，再分別加入15g葡萄糖和20g瓊脂，攪拌使其充分溶解，紗布過濾入錐形瓶，使用脫脂棉和牛皮紙封口備用。

1.3.2 75%酒精溶液的配制

用無水乙醇與水比例為3∶1配制酒精溶液。

1.4 實驗操作

1.4.1配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，75%酒精溶液待用

1.4.2實驗材料及用具的消毒

準(zhǔn)備75%酒精，將病魚全面消毒，之后使用無菌水沖洗干凈。在干凈的培養(yǎng)皿中放一層紗布，并用少量無菌水浸濕，把洗好后的病魚放在紗布上，蓋好后室溫保濕1～2h。

將試管用脫脂棉塞好，用牛皮紙封口、包好，將鑷子、解剖剪、接種針培養(yǎng)皿等實驗器材用牛皮紙包扎好，將其與培養(yǎng)基移入高壓滅菌鍋中，運行30min。

1.4.3水霉菌的培養(yǎng)

(1)馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面的制備。滅菌后馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45℃，在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入試管中，每支試管倒1/3左右，之后用脫脂棉塞好試管擺成斜面，冷卻凝固后貯存?zhèn)溆谩?/p>

(2)接種。在超凈工作臺內(nèi)將解剖剪和接種針放在酒精燈火焰上燒烤消毒，取5個提前做好的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面，分別標(biāo)記1、2、3、4、5號，待解剖剪和接種針冷卻后，用解剖剪剪下少量病魚身上的菌絲，之后用接種針在無菌條件下送到5個培養(yǎng)基斜面上，之后用脫脂棉塞好試管。

(3)恒溫培養(yǎng)。將5個試管放到恒溫培養(yǎng)箱里面，設(shè)定溫度為25℃，培養(yǎng)5天。

(4)鏡檢。培養(yǎng)5天后，取出5個試管，觀察菌落生長情況，并用消毒后的鑷子在每個試管內(nèi)各取少量菌絲，做成裝片，在顯微鏡下觀察菌絲及動孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1)，之后取孢子囊數(shù)量最多的2號試管備用。

圖1 菌絲及動孢子囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)

(5)研磨和離心。用鑷子從2號試管內(nèi)取出適量菌絲，放入研砵里研磨，破開孢子囊；之后加適量無菌水一起放入離心管內(nèi)，離心20 min，靜置備用。

(6)稀釋分離。準(zhǔn)備五支滅菌試管依次編號1～5，分別裝入9 mL無菌水，用1 mL滅菌吸管，嚴(yán)格無菌操作，從靜置后的離心管內(nèi)分別吸取1 mL上清液注入1～5號管中，搖勻。

(7)提純培養(yǎng)。從試管中各吸取1 mL懸浮液，將其分別注入到滅菌培養(yǎng)皿中，再加入馬鈴薯培養(yǎng)基15 mL，充分搖勻后靜置，使之冷凝;然后倒置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d。之后從中挑取單個菌落，接種于斜面上，放入恒溫箱中培養(yǎng)5 d。

(8)確定種類。觀察菌絲形態(tài)及動孢子囊特征確定其屬，觀察有性生殖器官確定其具體種類。

2 結(jié)果

提純培養(yǎng)的菌絲如圖2所示。

圖2 顯微鏡下提純培養(yǎng)的菌絲

3 分析討論

霉菌的菌絲較為粗長，菌落相對較大，部分霉菌菌絲呈蔓延式生長，可在整個培養(yǎng)基斜面上觀察到其菌落，部分種生長具有一定的局限性，直徑1～2 cm及以下，生長區(qū)域較小。5放線菌比較霉菌菌落質(zhì)地通常較為疏松，表面干燥，不透明，顯現(xiàn)為蛛網(wǎng)狀或絨毛狀。霉菌菌落緊密連接在培養(yǎng)基上，不容易挑??；菌落正反面的色彩、邊沿與中心的色彩基本不一致。

水霉的菌絲呈管形，內(nèi)菌絲較為發(fā)達(dá)，表現(xiàn)為纖細(xì)而分支繁多；外菌絲中等粗壯，無分隔[3]。根據(jù)圖2判斷，鯽魚水霉病病原為水霉目水霉科中的水霉屬(ProletarianC.G.Gees)。