蛹蟲草浸提液的抗菌作用初步探究

馬新宇，李欣南，韓鐫竹，徐方旭，王升厚?，葉 齊

（1.沈陽師范大學(xué)，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北蟲草，為子囊菌門[1]，肉座目，麥角菌科、蟲草屬的模式種[2]。由子座（即草部分，又稱子實體）與菌核（即昆蟲的尸體部分）兩部分組成的復(fù)合體。1950年，德國科學(xué)家Cunningham從中分離出一種抗菌性物質(zhì)，3'-脫氧腺苷，定名為蟲草素。蛹蟲草中除蟲草素外，還含有蟲草酸、蟲草多糖、腺苷等多種生物活性成分[3]。研究表明，蛹蟲草具有消炎[4]、抗菌抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、提高人體免疫力等作用[5]。

很多學(xué)者在蛹蟲草的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了抗菌活性物質(zhì)，如高燕燕等[6]在蛹蟲草中提取到了水溶性和脂溶性的抗菌物質(zhì)，這種抗菌物質(zhì)初步斷定為蛋白質(zhì)。秦建春等[7]對蛹蟲草中的乙酸乙酯萃取物質(zhì)和正丁醇萃取物質(zhì)進(jìn)行對比研究其抗菌作用，結(jié)果表明乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，而正丁醇萃取物對其無抑菌作用，但文獻(xiàn)中沒有涉及到蛹蟲草浸提液對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌抑菌作用的對比。本試驗選用蛹蟲草子實體粉的水提液和乙醇提取液作為研究對象，并通過薄層色譜法分析，初步得到使用不同濃度乙醇對蟲草粉進(jìn)行提取而獲得的活性成分不同的結(jié)論，接著采用管碟法和微量稀釋法，分別對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行敏感性試驗，為進(jìn)一步研究蛹蟲草的抗菌作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 標(biāo)準(zhǔn)菌株：ATCC25922大腸桿菌（E.coli）；ATCF29213金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)箱 memmert 260 INplus；高壓滅菌鍋SANYU MLS-3780；氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；EFAA-DC12-RT；麥?zhǔn)媳葷醿xDensimat bioMerieux France；恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司DKS-12；分析天平METTLER TOLEDO AG285；牛津杯放置器，北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司 2Y-300G。

1.1.3 藥品 新霉素（1 mg含645個單位）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所130309-200811；黏菌素（1 mg含22782個單位）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所K0271305；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司20160318。無水乙醇、NaCl、乙酸乙酯、正丁醇、二甲亞砜均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 生理鹽水：稱取0.85 g的NaCl，加入100 mL無菌水。新霉素工作液：準(zhǔn)確稱取1 mg新霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用3%NaCl定容到50 mL容量瓶中，配置為12.9 U/mL的金黃色葡萄球菌陽性對照藥品。黏菌素工作液：準(zhǔn)確稱取1 mg黏菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用3%NaCl定容至25 mL容量瓶中，配置為911.28 U/mL的大腸桿菌陽性對照藥品[8]。

1.2.2 蛹蟲草活性物質(zhì)的提取與制備 提?。悍Q取干燥的蛹蟲草子實體干粉20 g共6份，分別加入200 mL無菌水及50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，4℃浸提16～20 h，過濾分裝到離心管中，得到水提液和醇提液，使用氮吹儀分別氮吹，將浸提液濃縮為干粉合并，再用10 mL提取溶劑復(fù)溶，制備成抑菌活性物質(zhì)含量為0.001 g/mL浸提液。

使用乙酸乙酯和正丁醇作為提取劑，利用秦建春等文獻(xiàn)方法[7]，分別進(jìn)行蟲草粉中抑菌活性物質(zhì)的提取，經(jīng)氮吹濃縮，乙酸乙酯浸提物用二甲亞砜助溶后用無菌水配成0.001 g/mL提取物的溶液。

1.2.3 薄層色譜法分離抑菌物質(zhì) 使用毛細(xì)管分別吸取蛹蟲草水提液以及50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取液并進(jìn)行點(diǎn)樣，晾干后備用。使用無水乙醇、甲醇、丙酮分別作為展開劑，取20 mL左右展開劑于層析缸內(nèi)，將晾干的硅膠板輕放在層析缸中，約40 min后將硅膠板取出晾干，在366 nm紫外燈下驗視[9]。

1.2.4 菌懸液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株（E.coli、Staphylococcus aureus）接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h[10]。用無菌棉簽挑取新鮮單菌落（E.coli、Staphylococcus aureus）置于生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌懸液的濃度為1麥?zhǔn)希F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.5 平皿的制備 將1.2.4兩種菌懸液分別與48℃的營養(yǎng)瓊脂按1:50比例混合均勻，制備好的上層在48℃水浴鍋中恒溫備用。定量平皿中加入15 mL營養(yǎng)瓊脂作為下層，待冷卻后，加入5 mL上層，備用。

1.2.6 管碟法藥物敏感性試驗 將制備好的水提液（50%、60%、70%、80%、90%乙醇的浸提液）（1.2.2）、新霉素工作液（1.2.1）、無菌水（50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液）試樣各200 μL加入放置于金黃色葡萄球菌檢驗用平板上的4個牛津杯中（提取液加入2個）；水提液（50%、60%、70%、80%、90%乙醇的浸提液）（1.2.2）、黏菌素工作液（1.2.1）、無菌水（50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液）試樣各200 μL加入放置于大腸桿菌檢驗用平板上的4個牛津杯中（無菌水等加入2個）；將平皿放入恒溫培養(yǎng)箱，蓋好陶瓦蓋，37℃培養(yǎng)16～18 h[11]。

將制備好的乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液、80%乙醇提取液、二甲亞砜試樣各200 μL加入放置于金黃色葡萄球菌檢驗用平板上的4個牛津杯中，將平皿放入恒溫培養(yǎng)箱，蓋好陶瓦蓋，37℃培養(yǎng)16～18 h。

1.2.7 微量稀釋法藥物敏感性試驗 取空白無菌96孔板，第一排加入1 000 μg/mL的蛹蟲草粉浸提物（水提液，50%、60%、70%、80%、90%乙醇的浸提液）（1.2.2），用無菌水依次向右倍半稀釋，配置成濃度為 1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.3、 15.6、7.8 μg/mL提取物的浸提液。

用無菌棉簽挑取新鮮單菌落（E.coli、Staphylococcus aureus）置于生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌懸液的濃度為0.5麥?zhǔn)希?00 μL菌液加入已有10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的V型無菌槽中（1:100稀釋），用微量移液器吸取混有菌液的營養(yǎng)肉湯50 μL加入到96孔板中，將96孔板置于37℃培養(yǎng)24 h[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法分離結(jié)果 不同的展開劑分離物質(zhì)的效果不同，經(jīng)多次試驗得出乙醇作為展開劑展開效果最好，如圖2所示。不同濃度乙醇提取液在薄層色譜板上以無水乙醇作為展開劑，分離出物質(zhì)的比移值（Rf）不同，說明提取得到的抑菌活性物質(zhì)不同，但抑菌活性物質(zhì)的具體成分有待進(jìn)一步考查。

2.2 蛹蟲草浸提液的抗菌活性 圖3～14分別為蛹蟲草不同濃度乙醇提取液和水提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈試驗結(jié)果，由圖可見，水提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無明顯抑菌作用，50%、60%、70%、80%、90%乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用均大于對大腸桿菌的抑菌作用。

又由表1可知，80%乙醇提取得到的抑菌活性物質(zhì)對于金黃色葡萄球菌的抑菌作用最大。

圖 2 薄層色譜法分離結(jié)果Fig.2 Thin layer chromatography separation results

圖 3 金黃色葡萄球菌Fig.3 Staphylococcus aureus

圖 4 大腸桿菌Fig.4 Escherichia coli

圖 5 金黃色葡萄球菌Fig.5 Staphylococcus aureus

圖 6 大腸桿菌Fig.6 Escherichia coli

圖 7 金黃色葡萄球菌Fig.7 Staphylococcus aureus

圖 8 大腸桿菌Fig.8 Escherichia coli

圖 9 金黃色葡萄球菌Fig.9 Staphylococcus aureus

圖 10 大腸桿菌Fig.10 Escherichia coli

圖 11 金黃色葡萄球菌Fig.11 Staphylococcus aureus

圖 12 大腸桿菌Fig.12 Escherichia coli

圖 13 金黃色葡萄球菌Fig.13 Staphylococcus aureus

圖 14 大腸桿菌Fig.14 Escherichia coli

2.3 乙酸乙酯、正丁醇和8800%%乙醇提取液抑菌活性物質(zhì)對比 由圖15和表2可看出，乙酸乙酯和正丁醇提取到的抑菌活性物質(zhì)小于80%乙醇提取到的抑菌活性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，說明80%乙醇提取液提取到的抑菌活性物質(zhì)能更好地抑制金黃色葡萄球菌的生長。

圖 15 三種不同浸提液抑菌作用對比Fig.15 Comparison of bacteriostatic action of three different extracts

表 1 抑菌活性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌抑菌性的測定結(jié)果Table 1 The results of staphylococcus aureus bacteriostasis by antibacterial active substance

表 2 三種不同浸提液抑菌圈的測定結(jié)果Table 2 The results of three different kinds of antibacterial rings were obtained

2.4 微量稀釋法藥物敏感性試驗結(jié)果 使用微量稀釋法對不同提取液的藥物敏感性進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示，可看出80%醇提液對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力最強(qiáng)，水提液對其抑菌能力較弱，且80%乙醇提取液對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為250 μg/mL、500 μg/mL提取物。

2.5 提取方法的優(yōu)化 在蟲草粉活性物質(zhì)提取工藝中，主要影響因素是乙醇濃度、提取時間、提取方式和提取溫度。通過篩選確定提取溶解為80%乙醇。因此，進(jìn)一步對提取時間、提取溫度和提取方式進(jìn)行考察，以提取抑菌活性物質(zhì)濃度為指標(biāo)，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。提取溫度分別考察了4℃和20℃，結(jié)果顯示4℃條件下提取抑菌圈直徑平均值為12.69 mm，20℃條件下提取抑菌圈直徑平均值為12.52 mm，因此4℃溫度下進(jìn)行提取效果最佳；提取方式分別考察了搖床震蕩提取和靜置提取，結(jié)果顯示靜止條件提取抑菌圈直徑平均值為12.46 mm，震蕩條件提取抑菌圈直徑平均值為12.78 mm，因此震蕩提取的效果更佳；提取時間分別考察了16 h和24 h，結(jié)果表明16 h就可以達(dá)到最佳提取效果。初步確定最佳的抑菌活性物質(zhì)提取方案為：80%乙醇提取，4℃環(huán)境下震蕩提取16～24 h。

表 3 微量稀釋法藥物敏感性試驗Table 3 Drug sensitivity test of microdilution method

表 4 提取條件對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響Table 4 The effect of extraction conditions on the diameter of staphylococcus aureus mm

3 討論與結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，80%乙醇提取到的抑菌活性物質(zhì)對革蘭氏陽性菌的抑菌作用最大，使用報道中乙酸乙酯和正丁醇提取到的抑菌活性物質(zhì)分別與80%乙醇提取物進(jìn)行對比，前兩者的抑菌作用均小于80%乙醇提取物。

通過微量稀釋法試驗也得到證明，80%乙醇提取得到的抑菌活性物質(zhì)對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用均最大。同時證明使用80%乙醇提取到的抑菌活性物質(zhì)對于革蘭氏陽性菌的抑菌效果大于革蘭氏陰性菌。通過提取條件優(yōu)化，初步確定最佳提取條件為：80%乙醇提取，4℃環(huán)境下震蕩提取16～24 h。

本試驗從抑菌方面證明，蛹蟲草子實體中存在多種抑菌活性物質(zhì)，使用無菌水對蛹蟲草粉進(jìn)行提取，無法提取到抑菌活性物質(zhì)；但使用不同濃度乙醇對蛹蟲草粉進(jìn)行提取，獲得的抑菌活性成分不同，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有不同的抑菌效果。因此對蛹蟲草粉不同濃度乙醇提取液的應(yīng)用具有廣闊的前景，其抑菌活性物質(zhì)的成分在后續(xù)的研究中會加以關(guān)注。

現(xiàn)如今，抗生素的濫用情況十分嚴(yán)重，抗生素不僅會造成環(huán)境的污染，也對人體有一定的危害作用[13]，一些抗生素已經(jīng)被禁用，亟需研發(fā)純天然、綠色、環(huán)保的抗生素替代品。經(jīng)過多年的研究，蛹蟲草具有消炎、抗菌抗病毒等優(yōu)點(diǎn)。同時，蛹蟲草栽培方法簡單，出草時間快，成本低，是活性物質(zhì)篩選的較為理想的原料之一。但目前尚未從中提取有效的抗菌活性物質(zhì)，如果能從蛹蟲草中提取到天然、綠色、環(huán)保的抑菌物質(zhì)，對于發(fā)揮蛹蟲草的醫(yī)療價值和更大的經(jīng)濟(jì)價值作用將具有非凡的意義。

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