雷替曲塞介入途徑應(yīng)用對兔肝功能、組織學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)的影響

劉文貴， 戴國梁， 司海鵬， 汪有錦， 馬 坤， 沈湘蕾， 汪 維

介入治療肝臟惡性腫瘤中無論是經(jīng)肝動(dòng)脈給藥首過效應(yīng)，還是穿刺瘤體直接注射藥物，均旨在增加腫瘤局部藥物濃度，減少全身不良反應(yīng)［1-5］。有些藥物如氟尿嘧啶脫氧核苷經(jīng)肝動(dòng)脈灌注后除了首過效應(yīng)，還由于肝臟對此類藥物代謝特點(diǎn)而產(chǎn)生首過清除效應(yīng)。經(jīng)肝動(dòng)脈灌注氟尿嘧啶脫氧核苷后94%～99%滯留肝內(nèi)，使正常肝細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度分別相當(dāng)于外周靜脈同等量給藥后相應(yīng)細(xì)胞藥物濃度的15倍和近400倍［2-4］。雷替曲塞是一種喹唑啉葉酸鹽類似物，經(jīng)還原葉酸鹽載體系統(tǒng)攝入細(xì)胞，在葉酸多聚谷氨酸合成酶作用下迅速代謝為一系列多聚谷氨?；衔铮饔糜谛剀账岷铣擅福═S）靶點(diǎn)葉酸結(jié)合部位，特異性地抑制TS活性而發(fā)揮抗腫瘤作用［6-7］；其抑制作用是二氫葉酸還原酶的100倍，上市以來主要被推薦應(yīng)用于不耐受或不適用5-氟尿嘧啶聯(lián)用亞葉酸鈣的晚期結(jié)直腸癌治療，在肝癌治療領(lǐng)域研究甚少［8-9］，僅見少量關(guān)于介入途徑給藥治療肝臟腫瘤的回顧性研究［10-12］。尚未見經(jīng)多種介入途徑給予雷替曲塞對肝臟功能、肝臟組織學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)（藥動(dòng)學(xué)）影響的對照實(shí)驗(yàn)研究。臨床等效劑量雷替曲塞通過介入放射學(xué)方法給藥的效應(yīng)及安全性如何，經(jīng)靜脈、動(dòng)脈或直接穿刺注射各有哪些應(yīng)用優(yōu)勢，本研究就這些問題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

取飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通清潔級新西蘭大白兔25只（購自南京安立默科技公司，合格證號(hào)：SCXK蘇-2010-0002），雌雄不限，體質(zhì)量2.7～3.1 kg。實(shí)驗(yàn)兔符合國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)規(guī)范和管理?xiàng)l例，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究符合赫爾辛基宣言。實(shí)驗(yàn)器材包括自制木質(zhì)手術(shù)臺(tái)3張、靜脈留置針、常規(guī)開腹手術(shù)器械、精細(xì)手術(shù)器械（精細(xì)鑷子、手術(shù)剪、玻璃分針等）、介入穿刺套件、2.7 F Progret微導(dǎo)管套件等（日本Terumo公司）、GE128排螺旋CT機(jī)（美國通用公司）、平板DSA機(jī)（日本島津公司）、RM2235型切片機(jī)、ST 5020型自動(dòng)染色機(jī)、CV5030型封片機(jī)（德國Leica公司）、高效液相色譜儀等。實(shí)驗(yàn)藥物為2%戊巴比妥鈉溶液 （現(xiàn)場配制）、肝素（12 500 U/mL）、碘佛醇 300（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司）、雷替曲塞注射液（南京正大天晴制藥公司）、青霉素G鈉80萬U/支、4%甲醛、0.9%NaCl溶液等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分組給藥：所有操作均在介入DSA室或CT室進(jìn)行。將25只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為外周靜脈注射組（A組）、肝動(dòng)脈灌注組（B組）、肝動(dòng)脈碘化油栓塞組（C組）、肝動(dòng)脈明膠海綿顆粒栓塞組（D組）及肝臟直接穿刺注射組（E組），每組5只。實(shí)驗(yàn)前所有實(shí)驗(yàn)兔禁食、禁水12 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)予一側(cè)耳緣靜脈留置針（22 G），抽取1 mL血液用于檢測給藥前肝功能。以2%戊巴比妥鈉溶液經(jīng)留置針推注麻醉實(shí)驗(yàn)兔，并給予適量補(bǔ)液。A組經(jīng)此留置針注射雷替曲塞；B、C、D組肝動(dòng)脈插管采用股動(dòng)脈入路［13］（圖1），微導(dǎo)管到位后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求分別行經(jīng)動(dòng)脈灌注雷替曲塞、雷替曲塞+碘化油乳劑栓塞、雷替曲塞+明膠海綿顆粒栓塞；E組CT定位下肝臟穿刺（圖2），穿刺針到位后直接注射雷替曲塞。每只兔均經(jīng)不同途徑或方式在約6 min內(nèi)［14］接受臨床等效劑量雷替曲塞注射液（0.17 mg/kg體質(zhì)量）。

血液及組織學(xué)取材：經(jīng)實(shí)驗(yàn)兔頸靜脈［13］抽取給藥后 5、15、30、60、120、180 min 靜脈血 1 mL，離心后取上清液用于檢測血藥濃度；給藥后6 h，抽取實(shí)驗(yàn)兔1 mL靜脈血用于肝功能檢測，然后以空氣栓塞法處死每組2只實(shí)驗(yàn)兔，摘取其肝臟制作組織學(xué)標(biāo)本。剩下實(shí)驗(yàn)兔送動(dòng)物房飼養(yǎng)，1周后以同樣方法檢測肝功能及制作肝臟組織學(xué)標(biāo)本。

圖1 經(jīng)股動(dòng)脈途徑行肝動(dòng)脈插管造影

圖2 CT掃描定位行肝臟穿刺

血藥濃度檢測由本院臨床藥理基地具有多年工作經(jīng)驗(yàn)的藥理研究員（D.G.L）完成；所有組織學(xué)取材及分析均由同一位病理科副主任醫(yī)師（S.H.P）完成：將肝臟組織用4%甲醛溶液充分固定后，切開組織，目視下切取感興趣區(qū)組織塊（大小約2 cm×1.5 cm），經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后切片（厚度3 μm），放入自動(dòng)染色機(jī)完成染色、封片，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel工作表，對其中連續(xù)性變量進(jìn)行均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述性統(tǒng)計(jì)分析，對分類數(shù)據(jù)以百分?jǐn)?shù)表達(dá)。采用SPSS軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

組間實(shí)驗(yàn)兔在性別、體質(zhì)量等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組1只實(shí)驗(yàn)兔在動(dòng)脈插管過程中行補(bǔ)充麻醉后意外死亡；C組1只兔術(shù)后第2日死亡，無其它兔死亡。

2.2 給藥前后肝功能變化

給藥前后肝功能變化見表1，C、D、E組實(shí)驗(yàn)兔給藥后6 h血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）與給藥前相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），以C組為著，給藥后1周時(shí)這些指標(biāo)大部分恢復(fù)接近正常；A組或B組實(shí)驗(yàn)兔相應(yīng)指標(biāo)與給藥前相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)兔給藥前后血清肝功能變化 U/L

2.3 藥動(dòng)學(xué)變化

給藥后 5、15、30、60、120、180 min 時(shí)實(shí)驗(yàn)兔外周血藥濃度（μg/mL）在 A 組分別為 0.91、0.46、0.33、0、0、0，B 組分別為 1.73、1.27、0.86、0.62、0.53、0.37，C 組分別 為 0.82、0.48、0.37、0.24、0.10、0.08，D 組分別為 0.94、0.49、0.36、0.18、0.15、0.08，E 組分別為0.39、0.25、0.18、0.13、0、0。 各組實(shí)驗(yàn)兔給藥后外周血藥濃度變化趨勢見圖3。實(shí)驗(yàn)兔肝臟組織學(xué)變化顯示，給藥6 h后A組肝細(xì)胞在光鏡下表現(xiàn)為輕度水腫變性（圖4②），1周后鏡下見匯管區(qū)小膽管輕度增生，伴少量炎性細(xì)胞浸潤，而肝細(xì)胞形態(tài)已恢復(fù)正常；B組肝臟可見少量灶性壞死，肝細(xì)胞明顯水腫（圖4③），1周后鏡下見匯管區(qū)小膽管增生及炎性細(xì)胞浸潤程度也明顯強(qiáng)于外周靜脈組，但肝細(xì)胞形態(tài)已基本恢復(fù)正常；C組肝組織呈多灶、小片狀凝固性壞死，肝細(xì)胞明顯水腫（圖4④），1周后小膽管增生及炎性細(xì)胞浸潤明顯強(qiáng)于B組，并出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞水腫已消退，但仍見壞死灶（圖4⑦）；D組肝細(xì)胞急性水腫及壞死程度輕于C組（圖4⑤），1周后匯管區(qū)小膽管增生、炎性細(xì)胞浸潤及脂肪變性程度也弱于C組，栓塞區(qū)仍見片狀凝固性壞死區(qū)（圖4⑧）；E組肝組織呈大片狀凝固性壞死，肝細(xì)胞呈氣球樣水腫 （圖4⑥），1周后匯管區(qū)小膽管增生、炎性細(xì)胞浸潤及脂肪變性弱于C、D組，肝細(xì)胞水腫與凝固性壞死并存（圖4⑨）。

3 討論

圖3 給藥后實(shí)驗(yàn)兔血藥動(dòng)學(xué)變化（頸靜脈取血）

經(jīng)肝動(dòng)脈灌注化療是利用肝臟對某些藥物的首過效應(yīng)或首過清除效應(yīng)［2-5］。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）已成為治療不可切除肝臟惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法，術(shù)中常用碘化油除作為栓塞劑栓塞腫瘤血管，還作為化療藥物載體起到靶向、緩釋化療的作用［2-5］。藥物洗脫微球（DEM）TACE同樣是通過對富血供病灶超選擇插管和栓塞，使微球攜帶藥物緩釋后顯著延長與病變接觸時(shí)間，減少全身藥物總劑量［1-4，14-15］。 然而對乏血供、無法行超選擇插管的腫瘤，介入法局部穿刺注射給藥不失為一種理想手段［3-5，15］。

圖4 給藥后實(shí)驗(yàn)兔肝臟組織學(xué)變化

雷替曲塞療效與藥物濃度呈正相關(guān)。該藥通過細(xì)胞膜還原型葉酸/甲氨蝶呤載體被細(xì)胞主動(dòng)攝取后，在細(xì)胞內(nèi)被葉酸基聚谷氨酸合成酶代謝為一系列多聚谷氨酸類化合物，并能在細(xì)胞內(nèi)潴留，特異性地抑制TS活性并具有超長作用時(shí)間（半衰期長達(dá) 198 h）［6-7，10-12］。如果雷替曲塞和氟尿嘧啶脫氧核苷一樣經(jīng)肝動(dòng)脈灌注后具有顯著的首過效應(yīng)和首過清除效應(yīng)，將是治療肝臟腫瘤的理想藥物，但也不得不關(guān)注其對正常肝組織的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)雷替曲塞經(jīng)靜脈注射5 min后已分布全身循環(huán)，全身細(xì)胞主動(dòng)攝取后頸靜脈血藥濃度迅速降低（本研究檢測血中雷替曲塞原藥，非細(xì)胞內(nèi)代謝后成分），而經(jīng)肝動(dòng)脈灌注同等劑量雷替曲塞5 min后頸靜脈內(nèi)血藥濃度約為靜脈注射的2倍，說明肝臟對此藥無首過清除效應(yīng)，但由于藥物首過效應(yīng)，肝區(qū)藥物不斷隨循環(huán)到達(dá)頸靜脈，3 h后血藥濃度仍與靜脈給藥后30 min藥物濃度相當(dāng)。碘化油或明膠海綿顆粒混合雷替曲塞后栓塞，顯示有明顯緩釋效應(yīng)，給藥后5 min時(shí)血藥濃度僅為肝動(dòng)脈灌注組50%，且給藥后3 h仍可檢測到緩釋藥物。肝臟直接穿刺注射藥物則明顯提高了局部藥物濃度，因?yàn)樗幬餄B入血液循環(huán)很慢，60 min后同樣也難以檢測藥物濃度。

肝功能和肝臟組織學(xué)變化同樣可反映經(jīng)不同途徑給予雷替曲塞后對肝臟產(chǎn)生的效應(yīng)。動(dòng)脈灌注無明顯首過清除效應(yīng)，肝臟內(nèi)首過效應(yīng)帶來藥物濃度增加，主要以導(dǎo)致肝細(xì)胞炎性水腫為主，肝細(xì)胞壞死少見，因此肝酶譜升高不顯著，但碘化油或明膠海綿栓塞肝臟血管，導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血，加上其緩釋作用導(dǎo)致局部持續(xù)高濃度藥物，使大量肝細(xì)胞凝固性壞死，肝酶譜升高。局部穿刺注射藥物僅在肝臟局部滲透，導(dǎo)致局部藥物濃度很高，肝細(xì)胞水腫壞死顯著，但損傷范圍較局限，因此釋放入循環(huán)的轉(zhuǎn)氨酶不多。

需要特別提出的是，碘化油為末梢性永久栓塞劑，其栓塞有效管徑為50 μm，而明膠海綿顆粒粒徑多在350～800 μm，因此C組實(shí)驗(yàn)兔肝細(xì)胞壞死程度要比D組嚴(yán)重。此外，本實(shí)驗(yàn)為非荷瘤預(yù)實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)驗(yàn)兔需要存活、肝動(dòng)脈超選擇插管困難等因素，均將微導(dǎo)管選擇性插至肝固有動(dòng)脈，對肝臟行彌漫性栓塞，因此栓塞劑劑量比臨床治療腫瘤超選擇插管后所用劑量保守得多。人體血管相對兔血管，超選擇插管栓塞要容易得多，且通常追求致密栓塞，使腫瘤壞死效應(yīng)更加顯著。但如果臨床治療過程中不能超選擇插管，將等劑量藥物灌注或栓塞至較小肝區(qū)，由于首過效應(yīng)，肝細(xì)胞得以較長時(shí)間主動(dòng)攝取雷替曲塞并在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，加上其超長半衰期，對正常肝組織損傷效應(yīng)值得關(guān)注。本研究通過肝功能、組織學(xué)及藥動(dòng)學(xué)變化檢測已能提示這種效應(yīng)。本研究認(rèn)為，可根據(jù)插管程度及腫瘤大小適當(dāng)調(diào)整雷替曲塞及栓塞劑用量，尤其以雷替曲塞總劑量小于靜脈給藥推薦量為宜。

本研究不足之處：①未用其它藥物作對照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)初期已設(shè)計(jì)雷替曲塞與欖香烯脂質(zhì)體平行對照，但研究經(jīng)費(fèi)等原因，實(shí)驗(yàn)被分拆進(jìn)行，有待今后在荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對照進(jìn)行。②樣本量不足、未行超選擇插管、未行致密栓塞，使得肝功能和組織學(xué)變化間不匹配、未設(shè)立單純碘化油及明膠海綿栓塞組、未設(shè)計(jì)正常肝組織對雷替曲塞濃度耐受梯度等。

綜上所述，經(jīng)動(dòng)脈灌注臨床等效劑量雷替曲塞顯示有明顯的首過效應(yīng)。臨床上經(jīng)肝動(dòng)脈或直接穿刺注射雷替曲塞，應(yīng)根據(jù)插管程度及腫瘤大小調(diào)整應(yīng)用劑量。

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