滅活仙臺(tái)病毒體內(nèi)外誘導(dǎo)順鉑耐藥性肺腺癌A549/DDP細(xì)胞凋亡

陳則東，沈曉鵬，穆洪云，張 泉

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000)

溶瘤病毒因其殺死腫瘤細(xì)胞的能力而被廣泛用于腫瘤治療研究中，一些天然的溶瘤病毒(包括新城疫病毒、腮腺炎病毒、呼腸孤病毒和麻疹病毒)在試驗(yàn)階段和臨床階段都表現(xiàn)出光明的前景[1-4]。目前使用的病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而，因?yàn)樗鼈內(nèi)匀淮嬖谟谡５慕M織中，這種活病毒感染對(duì)于癌癥患者是一個(gè)安全威脅，除非它們的基因組不完整[5]。而且，宿主的抗病毒免疫可能會(huì)限制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶瘤病毒的復(fù)制，減弱病毒的殺傷能力。近來(lái)，因?yàn)槟苷T發(fā)多種抗腫瘤免疫反應(yīng)而被廣泛認(rèn)可[6-9]的滅活仙臺(tái)病毒(HVJ-E)粒子被發(fā)現(xiàn)能夠通過凋亡途徑直接殺死人的腫瘤細(xì)胞。滅活的HVJ-E先后被報(bào)道能夠誘導(dǎo)人的前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145[10-11]及小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)的凋亡[12-13]。

肺癌是目前世界范圍內(nèi)癌癥高死亡率的一個(gè)主要原因，盡管在過去數(shù)十年內(nèi)各種治療方法(包括化療、放療和手術(shù))長(zhǎng)足發(fā)展，五年以上生存期的患者仍不足15%[14-15]。順鉑輔助化療極大地延長(zhǎng)了肺癌患者的生存期，然而順鉑抵抗性成為限制其使用的主要障礙。文獻(xiàn)報(bào)道新城疫病毒能夠誘導(dǎo)順鉑抵抗性人肺癌細(xì)胞的凋亡，然而作為活病毒可能會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生潛在威脅，因此急需尋找一種新的治療策略。

本實(shí)驗(yàn)擬將A549/DDP細(xì)胞與滅活的HVJ-E共培養(yǎng)，探討其是否能在體外誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡；將滅活的HVJ-E病毒直接注射到腫瘤內(nèi)，觀察其是否能在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和減緩腫瘤的生長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制提供現(xiàn)象依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，順鉑耐藥性A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)在含2 μg/mL順鉑(Sigma)的10% FBS 1640完全培養(yǎng)基以維持其抗性，在實(shí)驗(yàn)之前3 d將其培養(yǎng)在不含順鉑的1640完全培養(yǎng)基中；仙臺(tái)病毒收自10～14日齡雞胚的絨毛膜尿囊液，純化、濃縮、紫外線輻照滅活(99 mJ/cm2)(參考之前文獻(xiàn)報(bào)道，滅活仙臺(tái)病毒不能正常復(fù)制，但仍保留融合能力[16])；BALB/c裸鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供 [SCXK (蘇) 2017-0007]，5只/籠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境 [SYXK (蘇) 2016-0020]，自由飲水與取食，實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(SH30809.018)與胎牛血清(MZE145)購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；順鉑(P4394)購(gòu)自Sigma公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(MK1020)與DAB(AR1000)顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；FITC-annexin凋亡檢測(cè)試劑盒I(556547)購(gòu)自BD Biosciences公司。Biosciences FACSAria流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；獨(dú)立通風(fēng)籠盒(IVC)購(gòu)自蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；RM2235徠卡輪轉(zhuǎn)切片機(jī)購(gòu)自上海歐啟電子科技有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡使用annexin V和PI雙染技術(shù)，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸重排的方法加以檢測(cè)。1×105A549/DDP細(xì)胞分別接受對(duì)照或者感染復(fù)數(shù)400 MOI的滅活HVJ-E處理，每組做三個(gè)重復(fù)，分別于12 h、24 h、36 h后檢測(cè)凋亡率；右下象限的細(xì)胞群(PI陰性，annexin V陽(yáng)性)為早期凋亡細(xì)胞，右上象限的細(xì)胞群(PI陽(yáng)性，annexin V陽(yáng)性)為晚期凋亡細(xì)胞。

1.3.2 TUNEL實(shí)驗(yàn)

將2×106A549/DDP細(xì)胞接種到BALB/c裸鼠皮下，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到5 mm時(shí)，分別取100 μL HVJ-E溶液(內(nèi)含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。注射3 d以后，處死小鼠，分離腫瘤，按照石蠟切片制作程序制作切片。石蠟切片分別被用于HE染色或者TUNEL實(shí)驗(yàn)，操作方法如前所述[17]。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(棕染)被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。

1.3.3 體內(nèi)溶瘤實(shí)驗(yàn)

注：A：A549細(xì)胞凋亡隨時(shí)間變化的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果；B：A549細(xì)胞凋亡隨時(shí)間變化的統(tǒng)計(jì)分析圖。感染復(fù)數(shù)為400 MOI。與24 h相比，**P < 0.01.圖1 滅活仙臺(tái)病毒體外誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡Note. A: Apoptosis in A549 cells over time detected by flow cytometry. B: Statistics of apoptosis of A549 cells over time. MOI=400∶1. Compared with 24 h,**P < 0.01.Fig.1 Inactivated Sendai virus induces apoptosis of A549/DDP cells in vitro

取20只6周齡BALB/c裸鼠隨機(jī)分成兩組，每組10只(雌雄各半)，分別指定為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠于背部分別接種A549/DDP細(xì)胞(2×106)與HVJ-E(2×1010病毒粒子)混合液；對(duì)照組則只接種A549/DDP細(xì)胞(2×106)。每日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，并按下述公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=長(zhǎng)×寬2/2[12]。同時(shí)將2×106A549/DDP接種到BALB/c裸鼠皮下，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到5 mm時(shí)，分別取100 μL HVJ-E溶液(內(nèi)含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，連續(xù)注射三次，每次間隔2 d，首次注射后每隔5 d測(cè)量一次腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 滅活的HVJ-E在體外能夠誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡

為了判斷滅活的仙臺(tái)病毒能否在體外誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡，1×105A549/DDP細(xì)胞分別接受對(duì)照(PBS)或者感染復(fù)數(shù)400 MOI的滅活HVJ-E處理，于12 h、24 h、36 h后收集細(xì)胞，annexin V/PI雙染法分析不同感染時(shí)間下的細(xì)胞凋亡率。如圖1A、1B所示，隨著感染時(shí)間的遞增，A549/DDP的凋亡率逐漸增加，且12 h與24 h、24 h與36 h的晚期凋亡率相比差異均有顯著性(P< 0.01)。

2.2 滅活的HVJ-E對(duì)A549/DDP小鼠肺癌模型表現(xiàn)出良好的溶瘤作用

為了評(píng)價(jià)滅活的HVJ-E在A549/DDP小鼠肺癌模型中的溶瘤能力，BALB/c裸鼠皮下接種A549/DDP細(xì)胞，然后采用瘤內(nèi)注射的方式對(duì)荷瘤小鼠接種一次滅活的HVJ-E或者PBS。3 d之后處死小鼠，通過HE染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢查腫瘤切片。HE染色顯示滅活的HVJ-E處理組小鼠的腫瘤切片呈現(xiàn)出特征性的凋亡細(xì)胞，如染色體深染、凝集，甚至表現(xiàn)出鐮刀狀染色質(zhì)固縮(圖2A)。除此之外，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出較多的棕染細(xì)胞(圖2C)。相反，在PBS對(duì)照組中則很少出現(xiàn)自溶或者凋亡的細(xì)胞(圖2B、2D)。

注：A：A549/DDP + HVJ-E組(HE染色)；B：A549/DDP + PBS組(HE染色)；C：A549/DDP + HVJ-E組(TUNEL染色)；D：A549/DDP + PBS組(TUNEL染色)。圖2 滅活仙臺(tái)病毒體內(nèi)溶瘤效果(× 400)Note. A: A549/DDP + HVJ-E group, HE staining. B: A549/DDP + PBS group, HE staining. C: A549/DDP + HVJ-E group, TUNEL staining. D: A549/DDP + PBS group, TUNEL staining.Fig.2 Oncolytic effect of inactivated Sendai virus in vivo

2.3 滅活的HVJ-E對(duì)A549/DDP小鼠肺癌模型腫瘤體積-時(shí)間變化曲線的作用

將2×106A549/DDP細(xì)胞與400 MOI的滅活HVJ-E共培養(yǎng)，24 h后接種到裸鼠皮下，并測(cè)量腫瘤體積變化情況。如圖3A所示，隨著接種時(shí)間的延續(xù)，對(duì)照組腫瘤體積不斷增大，在第16天時(shí)體積達(dá)到400 mm3，而實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積出現(xiàn)增大-減小-消失的變化，由此也可說(shuō)明滅活的仙臺(tái)病毒能夠誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞的凋亡。

將2×106A549/DDP細(xì)胞接種到BALB/c裸鼠皮下，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到5 mm時(shí)，分別取100 μL HVJ-E溶液(內(nèi)含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液對(duì)荷瘤鼠進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，連續(xù)注射三次，每次間隔2 d。使用游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤的長(zhǎng)與寬，并通過公式：腫瘤體積(mm3)=長(zhǎng)×寬2/2計(jì)算腫瘤體積。如圖3B所示，與PBS對(duì)照組相比，滅活的HVJ-E具有抑制順鉑耐藥性的肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，差異有顯著性(P< 0.05)。

注：A：A549/DDP細(xì)胞與滅活HVJ-E共培養(yǎng)24 h后接種裸鼠的腫瘤體積-時(shí)間變化曲線；B：瘤內(nèi)注射HVJ-E后腫瘤體積-時(shí)間變化曲線。圖3 肺腺癌腫瘤體積-時(shí)間變化曲線Note. A: Tumor volume-time curves of A549/DDP cells co-cultured with inactivated HVJ-E for 24 h and then inoculated into nude mice. B: Tumor volume-time curves after intratumoral injection with HVJ-E.Fig.3 Tumor volume-time curves of lung adenocarcinoma

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞活動(dòng)過程中的一種重要改變，細(xì)胞凋亡的失調(diào)可破壞細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡之間的平衡進(jìn)而誘發(fā)多種人類疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病和許多類型的癌癥等[18]。因此，細(xì)胞凋亡被廣泛認(rèn)為具有巨大的治療癌癥的潛能。靶向細(xì)胞凋亡也逐漸成為癌癥藥物發(fā)現(xiàn)的研究熱點(diǎn)，通過抗腫瘤藥物來(lái)誘導(dǎo)凋亡以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[19]。而固有的或獲得性的耐藥性嚴(yán)重阻礙了癌癥的治療。因此，解決耐藥性造成的困擾受到越來(lái)越多的關(guān)注。

有研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯作為天然化合物就具有廣譜抗腫瘤效應(yīng)，它在A549/DDP細(xì)胞中通過下調(diào)P-gp蛋白(P-gp蛋白能使抗腫瘤藥物從細(xì)胞內(nèi)外排，從而減少細(xì)胞內(nèi)藥物的累積)發(fā)揮強(qiáng)烈的逆轉(zhuǎn)作用，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的化療敏感性[20]。近年來(lái)，隨著溶瘤病毒研究的不斷深入，利用病毒治療癌癥已經(jīng)取得巨大進(jìn)步。在新城疫病毒(NDV)誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)NDV主要通過caspase途徑尤其是caspase-9途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且MAPK和AKT途徑對(duì)A549/DDP的凋亡也具有一定的作用[17, 21]。然而利用活病毒治療癌癥顯然對(duì)病人有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。

越來(lái)越多的研究表明，滅活的仙臺(tái)病毒(HVJ-E)具有殺傷腫瘤細(xì)胞的潛能。HVJ-E首次被報(bào)道以劑量依賴方式在人的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145中直接誘導(dǎo)凋亡[12-13]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，HVJ-E來(lái)源的大約300 bp的RNA片段與腫瘤細(xì)胞的選擇性凋亡有關(guān)。人的RIG-I能夠識(shí)別HVJ-E來(lái)源的300 bp左右的RNA片段并與IFN-β啟動(dòng)子相互作用，啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，促使I型IFN產(chǎn)生[22]。這種I型IFN通過JAK-STAT途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞選擇性凋亡[23]。通過使用JAK-STAT抑制劑并不能完全阻止HVJ-E誘導(dǎo)PC3細(xì)胞的凋亡，提示I型IFN介導(dǎo)的JAK-STAT途徑并非是HVJ-E誘導(dǎo)凋亡的唯一途徑[12]。在小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞中，HVJ-E還通過MAPK途徑誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡。有報(bào)道指出，HVJ-E能夠通過誘導(dǎo)免疫反應(yīng)尤其是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用選擇性殺死腫瘤細(xì)胞[24]，然而BALB/c裸鼠缺乏T細(xì)胞從而排除了HVJ-E誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，BALB/c裸鼠皮下接種A549/DDP細(xì)胞，然后采用瘤內(nèi)注射的方式對(duì)荷瘤小鼠接種HVJ-E，HVJ-E表現(xiàn)出了良好的溶瘤作用。因此，HVJ-E所誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)存在錯(cuò)綜復(fù)雜的機(jī)制。

HVJ-E不僅可以作為載體遞送抗腫瘤藥物，激活抗腫瘤免疫，同時(shí)還能直接殺傷腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究清楚HVJ-E作用腫瘤細(xì)胞的機(jī)制將加深我們對(duì)HVJ-E抗腫瘤效應(yīng)的認(rèn)識(shí)。本次實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)和組織切片TUNEL法分別證明了HVJ-E具有在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)順鉑耐藥性A549/DDP細(xì)胞凋亡的作用，通過誘導(dǎo)凋亡減緩腫瘤生長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究HVJ-E誘導(dǎo)順鉑耐藥性A549/DDP的凋亡機(jī)制提供現(xiàn)象依據(jù)。

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