聚羥基脂肪酸和聚乳酸膜在兔青光眼濾過手術(shù)和角膜層間移植手術(shù)中的探索應(yīng)用

周吉超，戴婉薇,2，張紹丹，郭寶華，曾心苗，張雅斕，張 純*

(1.北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科，眼部神經(jīng)損傷的重建保護(hù)與康復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191； 2.北京大學(xué)人口研究所，北京 100871； 3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325027； 4.清華大學(xué)化工系高分子研究所，北京 100084； 5.北京市射線應(yīng)用研究中心，北京 100012； 6.北京科技大學(xué)，北京 100083)

世界范圍內(nèi)，青光眼仍是第一位的不可逆致盲性疾病[1 - 3]。眼壓升高是最主要的危險因素，多中心研究證實(shí)降眼壓治療能有效控制青光眼進(jìn)程[4 - 5]，藥物不能有效降眼壓時，濾過手術(shù)已被廣泛實(shí)施。濾過手術(shù)長期效果失敗最主要的原因是濾過泡及其周圍組織的瘢痕化[6 - 7]，因此臨床上廣泛采用抗代謝藥物，例如5FU和MMC，來減少濾過手術(shù)區(qū)瘢痕組織的形成[8 - 10]，但抗代謝藥物存在嚴(yán)重的可致盲性并發(fā)癥，例如低眼壓性黃斑水腫、濾過泡漏、濾過泡感染和眼內(nèi)炎等[11 - 17]。近年來，研究者通過各種不同的方法來維護(hù)濾過泡功能。已有報道通過植入物來保持物理空間的方式有效控制眼內(nèi)壓[18 - 21]。但是，這些方法的效果還不確定。因此，我們有必要尋找新的生物或合成材料來作為臨床上可應(yīng)用的青光眼抗瘢痕方法。隨著高分子科學(xué)的發(fā)展，生物降解性高分子材料的研究和應(yīng)用的開發(fā)，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了條件，其中較有代表性的是聚羥基脂肪酸(polyhydroxyalkanoates，PHA)和聚乳酸(polylactic acid，PLA)。這些聚合物通過水解它們的酯鍵，降解成乳酸、糖酸和己酸，最終形成水和二氧化碳。由于人體可以有效地處理這些降解單體，因此在人體組織中使用的系統(tǒng)毒性非常小。因此，這些聚合物已在美國FDA批準(zhǔn)的植入式裝置或可注射藥物產(chǎn)品中使用。在之前的研究中，我們團(tuán)隊報告了PHA和PLA在兔眼具有良好的生物相容性[22]。在此前期研究的基礎(chǔ)之上，我們將PHA和PLA用于兔實(shí)驗(yàn)性青光眼濾過手術(shù)，以評估其在實(shí)驗(yàn)性青光眼濾過手術(shù)中應(yīng)用時維持眼壓的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用普通級新西蘭兔28只，體重(2.5±0.5) kg，4個月齡，雄性。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2015-0001]。無菌手術(shù)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部屏障動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK (京) 2016-0041]，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部負(fù)責(zé)喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作遵循眼科及視覺研究動物使用的ARVO宣言，由北京大學(xué)第三醫(yī)院動物管理委員會同意并接受其監(jiān)督。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

膜性聚羥基烷酸酯(PHA)、聚乳酸(PLA)，6 mm×4 mm大小，0.2 mm厚，由清華大學(xué)化工系高分子研究所和北京市射線應(yīng)用研究中心共同研制，按輻照時間長短分為低(low)聚合度和高(high)聚合度和兩種不同型號(鑒于專利申請原因暫不提供具體信息)；22-G/25 mm靜脈套管針，威海杰瑞醫(yī)用制品有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

選新西蘭兔28只，其中24只采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分成6組，分為實(shí)驗(yàn)組(PHA-high組、PHA-low組、PLA-high組、PLA-low組，n=4)，空白對照組(CON組，n=4)和陽性對照組(MMC組，n=4)。

(1)實(shí)驗(yàn)組：麻醉滿意后，制作以穹隆為基底的結(jié)膜瓣，角鞏膜緣后3 mm處制作4 mm×4 mm大小的矩形鞏膜瓣，將6 mm×8 mm大小實(shí)驗(yàn)材料膜橫軸平行于角鞏膜緣，植入鞏膜瓣下，三面各1 mm延伸于鞏膜瓣之外，縫合近角膜緣兩頂點(diǎn)，以22-G/25 mm靜脈套管針斜面朝向角膜內(nèi)皮面穿刺入前房，頂端至中央瞳孔區(qū)回撤至角膜緣與瞳孔緣中點(diǎn)位置，回撤針芯保留套管。將套管遠(yuǎn)端于角鞏膜緣后2 mm處剪斷，可見清亮液體流出，以10-0不可吸收尼龍線將套管末端固定于材料及鞏膜表面，鞏膜瓣兩尖端各帶材料膜縫合1針，于鞏膜上單層連續(xù)縫合結(jié)膜及Tennon氏囊。予1%阿托品、0.5%硫酸新霉素軟膏各一次(圖1)。

注：① 制作以角膜緣為基底的鞏膜瓣；② 翻轉(zhuǎn)鞏膜瓣高分子材料膜固定于鞏膜瓣下；③ 套管針穿刺進(jìn)入前房；④ 固定復(fù)位固定鞏膜瓣。圖1 實(shí)驗(yàn)組手術(shù)步驟示意圖Note. ① The scleral flap was made based on the limbus. ② The membrane was fixed under the scleral flap. ③ The trocar was punctured into the anterior chamber. ④ The scleral flap was resettled and fixed.Fig.1 Schematic diagram of surgical procedure in the experimental groups

(2)MMC組：制作鞏膜后將6×8 mm大小的0.02% MMC棉片置于鞏膜瓣下3 min，生理鹽水充分沖洗，替代植入實(shí)驗(yàn)材料的步驟，余步驟與實(shí)驗(yàn)組完全相同。

(3)空白對照組：制作鞏膜后直接進(jìn)行穿刺針套管的前房穿刺，余步驟與實(shí)驗(yàn)組完全相同。

1.3.2 眼內(nèi)壓測量

術(shù)前及術(shù)后第1、3、7、10、14、28天，由同一非術(shù)者以動物專用壓平眼壓計(Tono-Pen Avia)盲法測量眼內(nèi)壓IOP，測量三次取平均值記為眼壓。

1.3.3 兔角膜囊袋內(nèi)植入PHA膜

以角膜板層刀自角膜10 ～ 12鐘點(diǎn)位沿著1/3角膜厚度剝離板層角膜至距11點(diǎn)角鞏膜緣前4 mm，將直徑為2 mm×2 mm的PHA膜植入角膜層間，板層角膜復(fù)位，以10-0縫線間斷縫合角鞏膜緣。術(shù)后84 d取材，HE及天狼星紅染色，組織學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組眼壓隨時間變化趨勢

各組術(shù)后眼壓均有不同程度的下降，且維持低眼壓的時間點(diǎn)各有不同：空白對照組為術(shù)后14 d；MMC組為術(shù)后84 d；PHA-low組為術(shù)后84 d，PHA-high組為術(shù)后84 d，PLA-low組為術(shù)后3 d，PLA-high組為術(shù)后84 d，見表1、圖2。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組組間眼壓比較

術(shù)后84 d，MMC組眼壓與空白對照組相比差異有顯著性；PHA-low組(P=0.032)和PLA-high組(P=0.028)眼壓低于空白對照組，與MMC組相比差異無顯著性(P=0.75)。其余各實(shí)驗(yàn)組之間眼壓差異均無顯著性，見圖3。

2.3 PLA膜應(yīng)用于兔GFS后組織形態(tài)學(xué)描述

PLA-low組術(shù)后28 d裂隙燈照相顯示濾過泡隆起明顯，彌散。組織學(xué)觀察，HE染色可見濾過通道未被纖維組織充填，PLA膜未全部降解，成纖維細(xì)胞多見，偶見中性粒細(xì)胞；Masson染色顯示材料周圍未被膠原纖維充填；天狼星紅染色顯示材料PLA周圍各膠原纖維亞型大致平行排列。偏振光顯微鏡暗場下具有遮光性也間接證實(shí)了材料的存在。MMC組術(shù)后28 d裂隙燈照相顯示濾過泡隆起明顯，較彌散。組織學(xué)觀察，HE染色可見濾過通道內(nèi)可見少量纖維組織充填，濾過通道周圍組織可見成纖維細(xì)胞，偶見中性粒細(xì)胞；Masson染色顯示濾過通道內(nèi)有少量膠原纖維長入；天狼星紅染色顯示濾過通道周圍各膠原纖維亞型大致平行排列。見圖4。

表1 各組眼壓隨時間變化趨勢

注：單因素方差分析，組內(nèi)術(shù)后眼壓與術(shù)前眼壓相比，aP< 0.05；多因素方差分析，與空白對照組眼壓相比，bP< 0.05；多因素方差分析，與MMC組眼壓相比，cP< 0.05。

Note. Using one-way ANOVA analysis, postoperative IOP compared with preoperative IOP within the same group,aP< 0.05. Using multivariate analysis, compared with the blank control group,bP< 0.05. Using multivariate analysis, compared with the MMC group,cP< 0.05.

注：A：PHA-low組至術(shù)后84 d；B：PHA-high組至術(shù)后84 d；C：PLA-low組至術(shù)后3 d；D：PLA-high組至術(shù)后84 d。圖2 各實(shí)驗(yàn)組維持低眼壓的時間Note. A: PHA-low group to 84 d after GFS. B: PHA-high group to 84 d after GFS. C: PLA-low group to 3 d after GFS. D: PLA-high group to 84 d after GFS.Fig.2 Low IOP maintenance time of each experimental groups after GFS

注：A：CON組與MMC組各時間點(diǎn)眼壓比較；B：PHA亞組各時間點(diǎn)眼壓比較；C：PLA亞組各時間點(diǎn)眼壓比較。圖3 術(shù)后不同時間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)亞組間眼壓比較Note. A: Comparison of IOP between the CON group and the MMC group at different time points. B: Comparison of IOP between the PHA subgroups at different time points. C: Comparison of IOP between the PLA subgroups at different time points.Fig.3 Comparison of IOP between different experimental subgroups at different time points after surgery

注：圖a ～ d分別為PLA-low組裂隙燈照相(×4)、HE染色(×10)、Masson染色(×10)和天狼星紅染色(×10)；圖a1 ～ d1分別為MMC組裂隙燈照相(×4)、HE染色(×10)、Masson染色(×10)和天狼星紅染色(×10)。箭頭標(biāo)識濾過泡；“*”標(biāo)識濾過通道；“S”標(biāo)識鞏膜；“C”標(biāo)識角膜。圖4 PLA-low組和MMC組術(shù)后28 d裂隙燈照相和組織學(xué)觀察Note. a-d indicate the slit lamps (×4), HE staining (×10), Masson staining (×10) and Sirius red staining (×10) respectively in the PLA-low group. a1-d1 indicate the counterpart in the MMC group respectively. Arrows mark the blebs; “*” identifies the filtered channel; “S” indicates the sclera; “C” indicates the cornea.Fig.4 Photos of slit lamps and histological observation in the PLA-low group and MMC group at 28 d after surgery

2.4 兔角膜層間植入PHA膜84 d組織形態(tài)學(xué)觀察

植入兔角膜層間84 d后，PHA膜仍未見明顯吸收，原角膜膠原纖維仍緊密平行排列，保持原有結(jié)構(gòu)無明顯變化。見圖5。

注：A、C：分別為兔角膜層間植入PHA膜術(shù)后1 d和術(shù)后84 d裂隙燈照相(×4)；B、D：分別為兔角膜層間植入PHA膜術(shù)后84 d天狼星紅-苦味酸染色(×10)。“*”標(biāo)識PHA膜。圖5 兔角膜層間植入PHA膜84 d后組織形態(tài)學(xué)觀察Note. A, C: Rabbit corneal interlaminar implantation of PHA membrane postoperative 1 d and 84 d, respectively. Slit lamp photography (×4). B, D: Rabbit corneal layers implantation of PHA membrane postoperative 84 d, respectively. Sirius red-picric acid staining (×10). “*” identifies the PHA membrane.Fig.5 Slit lamps and histological observations of the PHA membrane 84 d after implantation in rabbit corneal layer

3 討論

本研究應(yīng)用不同劑量輻照的兩種高分子材料PHA和PLA應(yīng)用于兔抗青光眼濾過手術(shù)，觀察其維持低眼壓的效果，結(jié)果顯示術(shù)后84 d各實(shí)驗(yàn)組眼壓均低于空白對照組，部分實(shí)驗(yàn)組眼壓水平與陽性對照組MMC組眼壓水平相似。通過組織學(xué)觀察，我們推測PLA在兔青光眼濾過術(shù)后的作用可能是通過機(jī)械性阻隔纖維組織長入濾過通道實(shí)現(xiàn)的。

傳統(tǒng)的兔濾過手術(shù)方法多是先制作鞏膜隧道，經(jīng)隧道將套管針插入前房而不切除小梁組織[23]。國內(nèi)沙倩等[24]采用與人小梁切除術(shù)方式相同的術(shù)式來剝離鞏膜瓣，然后行小梁切除，而不用套管針。本實(shí)驗(yàn)中兔濾過術(shù)手術(shù)方法與傳統(tǒng)方法有所不同，具體操作為：本實(shí)驗(yàn)首先制作以角鞏膜緣為基底的鞏膜瓣，然后再在鞏膜瓣下固定高分子材料膜，在鞏膜瓣之間行套管針前方穿刺，而不切除小梁組織。之所以采用此種方式是由研究的目的和材料的特點(diǎn)決定的：制作鞏膜瓣是在鞏膜之間固定高分子材料的需要，同時能與臨床手術(shù)情況保持一致，而植入套管針是盡量使房水自前房至鞏膜瓣下的起始段流量保持一致，盡量減小人為手術(shù)操作造成的誤差。

研究顯示，MMC組和空白對照組眼壓在觀察時限內(nèi)的變化趨勢基本相同，術(shù)后84 d MMC組眼壓值明顯低于空白對照組，與現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[25]和臨床資料基本保持一致。該結(jié)果表明，一方面，MMC能在該實(shí)驗(yàn)手術(shù)方式中起到降眼壓的效果，另一方面該實(shí)驗(yàn)手術(shù)方式的人為操作誤差較小，可以用來評估高分子材料在抗青光眼手術(shù)中的應(yīng)用。從各實(shí)驗(yàn)亞組情況來看，PHA-low組和PHA-high組術(shù)前眼壓與空白對照組和MMC組相比差異均無顯著性(P> 0.05)，術(shù)后84 d PHA-low組明顯低于空白對照組(P=0.007)，與MMC組相比差異無顯著性。PHA的兩組在觀察終點(diǎn)的眼壓值均未回到術(shù)前的眼壓水平；而PLA材料組，PLA-low組和PLA-high組術(shù)前眼壓與空白對照組和MMC組術(shù)前眼壓相比差異均無顯著性(P> 0.05)，術(shù)后84 d PLA-low組眼壓介于空白對照組和MMC組之間，而PLA-high組眼壓明顯低于空白對照組(P=0.026 < 0.05)，與MMC組眼壓相比差異無顯著性(P=0.923)。PLA的兩實(shí)驗(yàn)組在觀察終點(diǎn)84 d的眼壓值也均未回到術(shù)前的眼壓水平。更有意義的是，PHA-low組和PLA-high組與MMC組在眼壓水平幾乎是等效的。隨著時間的延長，高分子材料的降解和吸收量的增加，眼壓并沒有上升。據(jù)此，是否可以推測，高分子材料有可能是通過機(jī)械性支架作用來維持濾過通道起作用的呢？

高分子材料應(yīng)用于兔抗青光眼手術(shù)濾過術(shù)后84 d的眼壓提示，濾過通道仍然起到引流房水的功能。究竟是通過什么方式維持濾過通道的功能呢？羅謙等人的研究[26]提示PLA應(yīng)用于兔GFS能維持低眼壓的機(jī)制是PLA機(jī)械性阻擋了瘢痕組織長入濾過通道，從而起到了維持濾過通道的作用。本文的研究是否支持這種理論呢？通過組織學(xué)觀察，HE染色可見濾過通道未被纖維組織充填，PLA膜未全部降解，成纖維細(xì)胞多見，偶見中性粒細(xì)胞；Masson染色顯示材料周圍未被膠原纖維充填；天狼星紅染色顯示材料PLA周圍各膠原纖維亞型大致平行排列。偏振光顯微鏡暗場下具有遮光性也間接證實(shí)了材料的存在。因此我們可以推測PLA在兔青光眼濾過術(shù)后的作用可能是通過機(jī)械性阻隔纖維組織長入濾過通道實(shí)現(xiàn)的。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示，膜性高分子材料PHA和PLA應(yīng)用于兔青光眼濾過手術(shù)具有中長期降低眼壓的效果，與MMC降眼壓效果類似。但是由于樣本數(shù)較少，未完全做到盲法研究等，所以結(jié)論的信服力尚不足夠。此外，本文對材料作用機(jī)制研究很表淺，其作用機(jī)制尚不完全明了，僅能推測可能是機(jī)械性阻隔纖維組織長入濾過通道而起作用的，因此下一步我們的研究方向應(yīng)同時側(cè)重于降低眼壓的機(jī)制的研究，比如說濾過泡的形態(tài)學(xué)研究、濾過通道瘢痕組織學(xué)觀察等。

[1] Roodhooft JM. Leading causes of blindness worldwide [J]. Bull Soc Belge Ophtalmol, 2002(283): 19-25.

[2] Coleman AL, Brigatti L. The glaucomas [J]. Minerva Med, 2001, 92(5): 365-379.

[3] Taylor HR, Keeffe JE. World blindness: a 21st century perspective [J]. Br J Ophthalmol, 2001, 85(3): 261-266.

[4] The AGIS Investigators. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration [J]. Am J Ophthalmol, 2000, 130(4): 429-440.

[5] Heijl A, Leske MC, Bengtsson B, et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial [J]. Arch Ophthalmol, 2002, 120(10): 1268-1279.

[6] Addicks EM, Quigley HA, Green WR, et al. Histologic characteristics of filtering blebs in glaucomatous eyes [J]. Arch Ophthalmol, 1983, 101(5): 795-798.

[7] Hitchings RA, Grierson I. Clinico pathological correlation in eyes with failed fistulizing surgery [J]. Trans Ophthalmol Soc U K, 1983, 103(Pt 1): 84-88.

[8] Lama PJ, Fechtner RD. Antifibrotics and wound healing in glaucoma surgery [J]. Surv Ophthalmol, 2003, 48(3): 314-346.

[9] Skuta GL. Antifibrotic agents in glaucoma filtering surgery [J]. Int Ophthalmol Clin, 1993, 33(4): 165-182.

[10] Rockwood EJ, Parrish RK 2nd, Heuer DK, et al. Glaucoma filtering surgery with 5-fluorouracil [J]. Ophthalmology, 1987, 94(9): 1071-1078.

[11] White TC. Hypotonous maculopathy after trabeculectomy with subconjunctival 5-fluorouracil [J]. Am J Ophthalmol, 1993, 115(4): 547.

[12] B Scoralick AL, Almeida I, Ushida M, et al. Hypotony management through transconjunctival scleral flap resuturing: analysis of surgical outcomes and success predictors [J]. J Curr Glaucoma Pract, 2017, 11(2): 58-62.

[13] Greenfield DS, Liebmann JM, Jee J, et al. Late-onset bleb leaks after glaucoma filtering surgery [J]. Arch Ophthalmol, 1998, 116(4): 443-447.

[14] Van Bergen T, Vandewalle E, Moons L, et al. Complementary effects of bevacizumab and MMC in the improvement of surgical outcome after glaucoma filtration surgery [J]. Acta Ophthalmol, 2015, 93(7): 667-678.

[15] Ticho U, Ophir A. Late complications after glaucoma filtering surgery with adjunctive 5-fluorouracil [J]. Am J Ophthalmol, 1993, 115(4): 506-510.

[16] Waheed S, Liebmann JM, Greenfield DS, et al. Recurrent bleb infections [J]. Br J Ophthalmol, 1998, 82(8): 926-929.

[17] Jampel HD, Quigley HA, Kerrigan-Baumrind LA, et al. Risk factors for late-onset infection following glaucoma filtration surgery [J]. Arch Ophthalmol, 2001, 119(7): 1001-1008.

[18] Novak-Lau? K, Herman J, Prskalo M, et al. Initial clinical experience with Ahmed Valve implantation in refractory pediatric glaucoma [J]. Acta Clin Croat, 2016, 55(4): 555-559.

[19] Minckler DS, Vedula SS, Li TJ, et al. Aqueous shunts for glaucoma [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2006(2): CD004918.

[20] Hodkin MJ, Goldblatt WS, Burgoyne CF, et al. Early clinical experience with the Baerveldt implant in complicated glaucomas [J]. Am J Ophthalmol, 1995, 120(1): 32-40.

[21] Wang S, Gao X, Qian N. The Ahmed shunt versus the Baerveldt shunt for refractory glaucoma: a meta-analysis [J]. BMC Ophthalmol, 2016, 16: 83.

[22] 周吉超, 張紹丹, 戴婉薇, 等. 膜性高分子材料在兔眼部的生物相容性 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報, 2011, 19(4): 277-281.

[23] Wong TT, Mead AL, Khaw PT. Matrix metalloproteinase inhibition modulates postoperative scarring after experimental glaucoma filtration surgery [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003, 44(3): 1097-1103.

[24] 沙倩, 喬喜珍, 聶慶珠, 等. 不同高分子生物材料抑制小梁切除后瘢痕的形成 [J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(8): 1513-1516.

[25] Suh W, Han KE, Han JR. Safety of using matrix metalloproteinase inhibitor in experimental glaucoma filtration surgery [J]. J Korean Med Sci, 2017, 32(4): 666-671.

[26] 羅謙, 黎靜, 樊映川. 聚乳酸膜防止小梁切除術(shù)后濾過道粘連的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 實(shí)用醫(yī)院臨床雜志, 2004, 30(1): 33-34.