先天性白內(nèi)障Rncat小鼠行為學(xué)檢測與分析

張 燕，王 瑩，馬 嵋，燕順生，陳欣如*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，烏魯木齊 830002； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院人類疾病動物模型研究實驗室，烏魯木齊 830054)

動物行為學(xué)是科研工作者評價實驗動物狀態(tài)的重要指標(biāo)，通過觀察檢測記錄動物自主活動(曠場實驗)、協(xié)調(diào)運(yùn)動(足跡分析、衣架實驗、網(wǎng)屏實驗、滾軸實驗等)、學(xué)習(xí)和記憶力(高架十字迷宮實驗)等方面的行為學(xué)實驗，評價實驗動物運(yùn)動功能、神經(jīng)功能[1]和肌肉發(fā)育等整體狀態(tài)[2]。新疆實驗動物研究中心挑選發(fā)生CRYGS基因突變的KM小鼠，經(jīng)過十余年的選種育種，采取全同胞兄妹交配方式，建立了先天性白內(nèi)障小鼠模型，并聯(lián)合中科院上海生物工程研究中心進(jìn)行品系的鑒定及實驗動物檢測，正式將其命名為Rncat小鼠[3]。本文以Rncat小鼠的近交后代和隨機(jī)交配后代為研究對象，觀察記錄其在自主活動度、協(xié)調(diào)運(yùn)動、體能檢測和激惹度檢測等方面的各項指標(biāo)，為其在毒理學(xué)、藥理學(xué)、神經(jīng)學(xué)等學(xué)科的應(yīng)用提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.1.1 實驗動物分組

所有實驗動物均由新疆實驗動物研究中心提供[SCXK (新) 2016-0001]，實驗在新疆實驗動物研究中心SPF級實驗室內(nèi)進(jìn)行[SYXK (新) 2015-0001]。實驗組一的先天性白內(nèi)障Rncat小鼠全部是Rncat小鼠全同胞兄妹近親交配后生產(chǎn)的小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為17～21 g。實驗組二的Rncat小鼠是來源于近親交配Rncat小鼠的血緣擴(kuò)大群，經(jīng)過5代隨機(jī)交配后生產(chǎn)的小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為17～22 g。實驗組三為BALB/c小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為16～20 g。實驗組四為KM小鼠，雌雄各半共40只，1.5月齡，體重為18～22 g。

1.1.2 動物實驗的環(huán)境及操作控制

實驗室溫度保持在20℃～24℃，相對濕度30%～50%，實驗定時開始于每天10～13時。實驗前一周，每天捉放撫摸實驗小鼠，讓其適應(yīng)實驗人員的移動及觸碰方式。實驗開始前，將各待測小鼠分籠飼養(yǎng)一夜，確保小鼠正常飲食體能充沛。操作人員確定不變，實驗時身穿白色隔離服，戴一次性口罩和手套。各項實驗每只小鼠測定前，實驗人員手套及各項實驗用具均用45%濃度酒精擦拭，待氣味完全揮發(fā)后，再進(jìn)行下一只小鼠的實驗。這些環(huán)境、人員及操作的控制是為了最大程度減少因人員變動、操作手法、動物氣味殘留等因素引起動物實驗數(shù)據(jù)的改變，實驗期間遵守3R原則，給予實驗動物人道關(guān)懷處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠自主活動度檢測：曠場實驗[4]

實驗室自制長寬高分別為50 cm×50 cm×40 cm的曠場實驗箱，將實驗箱內(nèi)部涂成黑色，將箱底正方形平均分為16小格，沿箱壁的12方格記為外周格，中心4小格為中央格。箱體正上方連接視頻記錄系統(tǒng)。實驗動物初始被放在中央格，記錄實驗5 min之內(nèi)實驗動物對各區(qū)域的探索表現(xiàn)。

1.2.2 小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動度檢測：衣架實驗[5]

首先自制衣架狀器械，水平為長40 cm、直徑3 mm的細(xì)園桿，懸掛至距離實驗臺高約40 cm的半空。實驗動物初始時幫助小鼠以前爪抓住水平桿中部，同時開始計時觀察30 s。計分標(biāo)準(zhǔn)參照[6]：小鼠10 s內(nèi)從水平桿上掉落記為零分，小鼠前爪能抓住水平桿記為1分，小鼠嘗試攀爬水平桿記為2分，小鼠的3只爪子能抓住水平桿記為3分，小鼠4只爪子抓住水平桿并且尾巴纏繞在水平桿上記為4分，小鼠在水平桿上行走并嘗試在水平桿末端停留記為5分。記錄小鼠從水平桿上掉落的時間或在水平桿末端的停留時間。

1.2.3 小鼠體能檢測：強(qiáng)迫游泳實驗[7]

用有機(jī)玻璃自制長寬高為30 cm×30 cm×20 cm的小鼠游泳盒，水深約10 cm，水溫保持在21℃～23℃，強(qiáng)迫每只小鼠游泳6 min后觀察記錄小鼠接下來4 min內(nèi)小鼠累計不動時間。

1.2.4 小鼠激惹度檢測：懸尾實驗[8]

將小鼠尾部(距尾尖約1.5 cm)用醫(yī)用膠布固定在水平木板上，小鼠頭部距離實驗臺約10 cm左右，小鼠保持倒懸狀態(tài)2 min后，連續(xù)觀察4 min內(nèi)實驗小鼠倒懸活動狀態(tài)，記錄小鼠身體下垂、完全不動的總時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 曠場實驗結(jié)果

各組小鼠在曠場實驗的表現(xiàn)中，組一小鼠在中央格、外周格的停留時間為(8135.44±3264.15) s、(287998.10±3045.52) s，與組二小鼠停留時間(8023.18±3427.26) s、(287864.32±2999.61) s相比差異無顯著性，與組三小鼠停留時間(6182.69±3105.33) s、(289356.75±3112.85) s，組四小鼠停留時間(7471.56±2990.97) s、(289047.65±3013.74) s相比差異有顯著性(P< 0.01)。在實驗中，組一小鼠移動格子(188.04±17.46)次、站立(40.02±3.85)次，與組二小鼠(183.12±19.10)次、(39.13±3.72)次相比差異無顯著性，與組三小鼠(125.75±14.28)次、(31.64±6.37)次，組四小鼠(138.74±12.31)次、(32.23±6.69)次相比各項數(shù)值差異有顯著性(P< 0.01)。各組小鼠實驗結(jié)果詳見表1。

Tab.1Results of open field test in the mice

組別Groups中央格停留時間(ms)Residencetimeinthecentralgrid外周格停留時間(ms)Residencetimeintheperipherygrid移動格子數(shù)Timesofgridambulation站立次數(shù)Stand?uptimes組一Group1813544±32641528799810±30455218804±17464002±385組二Group2802318±34272628786432±29996118312±19103913±372組三Group3618269±310533??28935675±311285??12575±1428??3164±637??組四Group4747156±299097??28904765±301374??13874±1231??3223±669??

注：與組一相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,*P< 0.05,**P< 0.01.

Tab.2Results of coat-hanger test in the mice

組別Groups實驗得分Scores在水平桿末端停留時間(s)Residencetimeattheendofthehorizontalbar從水平桿上掉落的時間(s)Latencytimeoffallingfromthehorizontalbar組一Group146±034165±458183±301組二Group247±057168±503198±276組三Group345±092?160±622?174±313?組四Group448±038169±564198±289

注：與組一相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the group 1,*P< 0.05.

2.2 衣架實驗結(jié)果

在衣架實驗中，組一小鼠實驗得分為(4.6±0.34)，與組三小鼠得分(4.5±0.92)相比差異有顯著性(P< 0.05)；組一小鼠在水平桿末端停留時間為(16.5±4.5) s，與組三(16.0±6.22) s相比差異有顯著性(P< 0.05)；組一小鼠從水平桿上掉落的時間(18.3±3.01) s，組三小鼠(17.4±3.13) s，兩組數(shù)據(jù)相比差異有顯著性(P< 0.05)。組一小鼠各項結(jié)果與組二、組四小鼠相比差異無顯著性。詳見表2。

2.3 強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果

強(qiáng)迫游泳實驗中，組一小鼠的累計不動時間最短，為(137.38±10.66) s，組二小鼠與其相比時間稍長(140.43±11.24) s但差異無顯著性，組三、組四小鼠的累計不動時間明顯長于組一，分別是(171.63±16.75) s和(182.62±12.53) s，與組一相比差異有顯著性(P< 0.01)。詳見表3。

2.4 懸尾實驗結(jié)果

各組實驗小鼠懸尾實驗結(jié)果見表4。組一小鼠在懸尾實驗中，累計不動時間是(104.83±11.22) s，與組二小鼠的累計不動時間(115.29±9.76) s相比差異無顯著性，與組三、組四小鼠累計不動時間相比差異有顯著性(P< 0.01)。詳見表4。

3 討論

先天性白內(nèi)障Rncat小鼠，是以KM小鼠的基因突變小鼠為親本，經(jīng)過新疆實驗動物研究中心十年以上的近交選育，建立的先天性白內(nèi)障模型小鼠。作者在十余年的飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，無論是以近交繁殖或者是隨機(jī)交配繁殖的方式，該種群小鼠均能很好地保持其先天性白內(nèi)障特質(zhì)。

Tab.3Results of forced swimming test in the mice

組別Groups累計不動時間(s)Immobilitytime組一Group113738±1066組二Group214043±1124組三Group317163±1675??組四Group418262±1253??

注：與組一相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,**P< 0.01.

Tab.4Results of tail suspension test in the mice

組別Groups累計不動時間(s)Immobilitytime組一Group110483±11．22組二Group211529±9．76組三Group315542±12．58??組四Group416063±12．69??

注：與組一相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,**P< 0.01.

本實驗通過對先天性白內(nèi)障Rncat小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，對比同月齡的Rncat小鼠與正常的近交系BALB/c小鼠及KM小鼠在自主活動度、協(xié)調(diào)運(yùn)動、體能和激惹度等方面的行為數(shù)據(jù)，檢測到Rncat小鼠在行為學(xué)上與其他近交系或封閉群小鼠的不同，這些數(shù)據(jù)的差異，可能與實驗小鼠月齡相同但體重差異有關(guān)，也可能與白內(nèi)障小鼠病理改變導(dǎo)致的行為學(xué)改變有關(guān)。

曠場實驗用于評價實驗動物在新環(huán)境的自主活動度與緊張度，以小鼠的水平活動次數(shù)評價小鼠活動的強(qiáng)弱。此次曠場實驗中，在相同的環(huán)境條件下，Rncat小鼠在中央格停留的時間和穿越格子的次數(shù)明顯高于其他小鼠，客觀地反映Rncat小鼠的自主活動量高于其他小鼠，可能因為該小鼠先天性白內(nèi)障病理學(xué)改變，引起的焦慮相關(guān)行為學(xué)變化。此次實驗中所有小鼠在四周格的時間明顯高于其在中央格的時間，這可能與小鼠對空曠環(huán)境的恐懼感及沿壁活動的天性有關(guān)。

衣架實驗主要評價小鼠腦對肢體的肌力和協(xié)調(diào)的控制功能[9]，強(qiáng)迫游泳實驗直接用于測試小鼠體能，同時也反映小鼠在強(qiáng)迫游泳實驗時，產(chǎn)生“行為絕望”的表現(xiàn)[10]。此次實驗中Rncat小鼠與KM小鼠在衣架實驗及強(qiáng)迫游泳實驗中結(jié)果相近，但與BALB/c小鼠差異有顯著性，可能是由于Rncat小鼠來源于KM小鼠，相同月齡小鼠腦對肢體的控制和體能等表現(xiàn)相似，而由于BALB/c小鼠的近交繁殖特性導(dǎo)致其體形較小、體能較弱，所以其與Rncat小鼠及KM小鼠在衣架實驗中結(jié)果相比差異有顯著性。

懸尾實驗則反映實驗動物激惹程度，該項實驗評價指標(biāo)為累計不動時間，實驗結(jié)果顯示Rncat小鼠與BALB/c小鼠或KM小鼠相比，累計不動時間短，為Rncat小鼠可能成為小鼠絕望模型的實驗動物提供科學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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