SSR分型技術(shù)研究進(jìn)展

方治偉，李論

（江漢大學(xué)，湖北武漢430056）

SSR（Simple Sequence Repeats）又稱作微衛(wèi)星序列、簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是一類廣泛存在于真核及原核生物體內(nèi)的一種具有高多態(tài)性的DNA片段，一般包含一個(gè)長(zhǎng)度為1～6bp不等的重復(fù)單元，重復(fù)次數(shù)不等。由于SSR的等位基因型眾多，且在基因組上廣泛分布，并且具有分散度高、多態(tài)性良好的特點(diǎn)[1-3]，因此被大量用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、指紋圖分析以及多樣性評(píng)價(jià)等研究中[4-7]。SSR兩側(cè)區(qū)域相對(duì)較為保守，因此可以在側(cè)翼區(qū)域設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，并通過常規(guī)的PCR擴(kuò)增對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)其進(jìn)行分型。本文總結(jié)了目前的常見分型方法以及分型難點(diǎn)，并對(duì)最新的分型技術(shù)進(jìn)行解析。

1 SSR分型的技術(shù)難點(diǎn)

SSR高度多態(tài)性是DNA復(fù)制過程中DNA聚合酶的滑脫造成的，這種滑脫會(huì)造成重復(fù)次數(shù)的增加或減少，從而產(chǎn)生與模板不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增子序列[8-9]。SSR長(zhǎng)度、重復(fù)次數(shù)以及重復(fù)單元的堿基組成均可影響滑脫的形成，且三堿基重復(fù)單元和四堿基重復(fù)單元的滑脫率低于二堿基重復(fù)單元的滑脫率[10]，這種滑脫現(xiàn)象在體外PCR過程中同樣存在。由于目前所有的SSR分型技術(shù)都是在提取基因組總DNA后采用特異的引物擴(kuò)增目標(biāo)SSR位點(diǎn)，然后基于擴(kuò)增產(chǎn)物做SSR分型，因而DNA聚合酶滑脫的影響無處不在[11-13]。PCR-free文庫可以大幅度減少滑脫的影響。在一次PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶即可以滑脫一個(gè)重復(fù)單元，也可以滑脫多個(gè)重復(fù)單元。因此PCR擴(kuò)增造成的虛假SSR基因型與模板真實(shí)基因型一起形成具有連續(xù)長(zhǎng)度差異的PCR產(chǎn)物。若PCR滑脫率過高，則會(huì)使真實(shí)的基因型僅占PCR總產(chǎn)物的一小部分，從而無法準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)SSR的真實(shí)基因型。目前已有的研究認(rèn)為，SSR重復(fù)單元的長(zhǎng)度、堿基組成、DNA聚合酶的保真性以及PCR反應(yīng)體系中的離子濃度均可影響滑脫的嚴(yán)重程度[14]。

2 傳統(tǒng)的SSR分型技術(shù)

早期的SSR分型技術(shù)多是基于凝膠電泳開展，包括瓊脂糖電泳[15]、聚丙烯酰胺凝膠電泳以及毛細(xì)管電泳[16]，這些方法通過檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小來確定目標(biāo)SSR位點(diǎn)的長(zhǎng)度信息。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、便捷，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)操作的要求低。理論上，聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳可以給出相對(duì)具體的SSR位點(diǎn)的長(zhǎng)度信息，且誤差較小，分型的準(zhǔn)確性相對(duì)很高，因而是目前廣泛采用的分型方法，如小麥、玉米、大豆等基因組上SSR標(biāo)記位點(diǎn)的開發(fā)等[17-19]。基于電泳的方法分型時(shí)有兩個(gè)問題無法避免：（1）凝膠電泳的方法無法獲得絕對(duì)的長(zhǎng)度信息；（2）由于凝膠電泳的分辨率較低，因而當(dāng)同一個(gè)SSR位點(diǎn)在兩個(gè)樣品間的差異較小時(shí)（如僅差一個(gè)2堿基重復(fù)單元），則電泳方法可能無法準(zhǔn)確鑒定出該差異。由于無法排除DNA聚合酶滑脫的影響，因此也不能用于雜合位點(diǎn)的SSR分型。

3 基于Sanger測(cè)序的方法

作為經(jīng)典的第一代測(cè)序方法，Sanger測(cè)序是目前所有測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的一種方法，常常被用于高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)的驗(yàn)證，被稱作測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)[20]。Sanger法采用邊合成邊測(cè)序的方法，通過熒光信號(hào)測(cè)定DNA上的每個(gè)堿基，由于反應(yīng)體系中的每個(gè)堿基都是被3’端修飾的，因而在PCR反應(yīng)中一次只能引入一個(gè)堿基，因而低復(fù)雜序列的測(cè)序準(zhǔn)確性依然很高，因而也非常適用于SSR的測(cè)序[21]。該方法雖然準(zhǔn)確性很高，但通量低、成本高，需要先挑選出單克隆的菌落，且難以進(jìn)行大規(guī)模的SSR分型。且當(dāng)滑脫率較高時(shí)，測(cè)得序列有可能是DNA聚合酶滑脫造成的虛假類型。

4 基于全基因組測(cè)序的SSR分型方法

目前二代測(cè)序通過對(duì)同一個(gè)位點(diǎn)的多次覆蓋來保證測(cè)序的準(zhǔn)確性，目前已知的測(cè)序錯(cuò)誤率僅為1%[22]。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，測(cè)序成本不斷下降，測(cè)序通量大幅度提高，測(cè)序周期大幅度縮短，因而其應(yīng)用范圍不斷拓寬，并被用于基因組水平的SSR鑒定和開發(fā)中。目前，已有多個(gè)物種的SSR標(biāo)記位點(diǎn)被開發(fā)出來，包括大麥、橡膠樹等[23-24]。隨著海量基因組測(cè)序數(shù)據(jù)不斷被公布，新的SSR鑒定和分型方法也被開發(fā)出來[10]。Carlson等報(bào)道了一種在全基因組水平上鑒定SSR的方法，且可鑒定出復(fù)合SSR位點(diǎn)。Gymrek等開發(fā)了一種基于短reads測(cè)序鑒定SSR的方法，該方法還可用于雜合位點(diǎn)的判斷[25]。目前，全基因組測(cè)序的方法更多的是用于SSR標(biāo)記的開發(fā)，以及全基因組水平SNP等變異的分析中，在基于SSR位點(diǎn)開展的樣品間差異分析中報(bào)道較少。

5 基于擴(kuò)增子測(cè)序的分型方法

多重PCR技術(shù)的發(fā)展使得一次擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)成為可能。而擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得大規(guī)模高通量的SSR分型成為可能。目前，擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)被大量用于遺傳病篩查、基因診斷等研究中[26-27]。最近，李論等采用多重PCR技術(shù)和擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)8個(gè)水稻品種中3000個(gè)SSR位點(diǎn)快速準(zhǔn)確分型，并開發(fā)出了一套名為AMP-SSR的軟件用于高通量SSR分型的研究[28]。該方法首先在全基因組水平篩選候選的SSR分子標(biāo)記位點(diǎn)，然后提交到網(wǎng)站做多重PCR引物的設(shè)計(jì)和合成。提取基因組總DNA后進(jìn)行多重PCR的擴(kuò)增并構(gòu)建測(cè)序文庫。采用S5等高通量測(cè)序儀完成DNA測(cè)序后，結(jié)合生物學(xué)信息分析技術(shù)對(duì)每個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)做SSR分型。這一研究大大突破了傳統(tǒng)分型方法的局限，并在單堿基水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)SSR的大規(guī)模分型，且具有快速，準(zhǔn)確，低成本的優(yōu)勢(shì)，有望在遺傳多樣性研究，高精準(zhǔn)的基因定位以及新品種的分子輔助選育方面廣泛應(yīng)用；同時(shí)，在水稻新品種審定、種子執(zhí)法等需要對(duì)大量樣品做快速準(zhǔn)確篩查的場(chǎng)合中將更具優(yōu)勢(shì)。同時(shí)該研究還比較了Illumina的MiSeq測(cè)序平臺(tái)和ptoton的S5測(cè)序平臺(tái)分型的準(zhǔn)確性，證明其有很好的平臺(tái)間的擴(kuò)展性。

6 結(jié)語

SSR分型技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了最初的凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、一代測(cè)序、二代測(cè)序以及高通量擴(kuò)增子測(cè)序階段，雖然基于電泳的分型方法依然是SSR分型領(lǐng)域的主流，但新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)將大大提高SSR分型的準(zhǔn)確性和速度，擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)以其高通量、高準(zhǔn)確性、方便快捷的特點(diǎn)必將成為SSR分型的主流方法，這也將大大促進(jìn)SSR的理論和應(yīng)用研究。

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