水環(huán)境中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲檢測方法的研究進展

張澤清

（太原供水集團有限公司水質(zhì)監(jiān)測中心，山西太原030009）

隨著我國經(jīng)濟的不斷增長和人民生活水平的不斷提高，人們對飲用水的衛(wèi)生狀況越來越注重。病原微生物是威脅水環(huán)境衛(wèi)生狀況的一個非常大的因素，賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲則是其中的典型代表，其危害一直受到國際社會的關(guān)注和重視。兩蟲在感染人體后具有潛伏期長、個體小、致病率高等特點，當兩蟲感染人類后，常使患者人體出現(xiàn)發(fā)燒、腹瀉等癥狀，甚至?xí)?dǎo)致患者的死亡。通過優(yōu)化水處理工藝可以起到一定的去除效果，但由于其對傳統(tǒng)的氯消毒劑有較強的抗性，在水環(huán)境中存活時間長，因此并不能將其完全消除[1]。只有加強實時監(jiān)測，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果采取針對性的措施，才能有效降低兩蟲的危害。

1 賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的危害

兩蟲廣泛寄居在大自然的各類水體中，其蟲卵可以長期存在于水體中，人一旦飲用被兩蟲污染的水，就極有可能發(fā)病。兩蟲主要來自于養(yǎng)殖場、農(nóng)場和屠宰場，通過排放的受污染水，來對其他水環(huán)境造成污染。

賈第鞭毛蟲主要寄生在人體的腸道系統(tǒng)內(nèi)，兒童、老人、體弱多病人員是極易感染者。當人體感染該病原體后，會在人體內(nèi)繁殖出孢囊，可以隨人體的排泄過程而排出體外，并可能再次進入到水環(huán)境中。它們可以在水環(huán)境中存活較長的時間，當溫度適宜時，可以在水環(huán)境中存活超過3個月，并隨著人類飲用受到污染的水，而再次進入到人體。

隱孢子蟲屬于一種細胞內(nèi)的寄生蟲，人畜皆可患病，其傳播途徑較為廣泛，當人接觸到受污染的水源、食物、動物后，就有可能患上該病，它們還能以卵囊的形式被排出到體外，如果被排放進飲用水源內(nèi)，就有可能造成人類的循環(huán)感染。該蟲卵進入到水體后，雖然不能進行自我復(fù)制和繁殖，但對絕大多數(shù)的消毒劑都有免疫效果，且可以在水環(huán)境中存活很長的時間，有些蟲卵可以存活1年以上。

2 賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測方法研究

美國是最先開始進行兩蟲檢測的，其首先發(fā)明了硫酸鋅-羅果氏法，后經(jīng)過多代研究技術(shù)人員的努力，檢測方法越來越多，其中較為先進的檢測方法有ICR法、EPA1623法、聚合酶鏈式反應(yīng)法、反轉(zhuǎn)錄PCR法、嵌套PCR法和熒光雜交法等。其中免疫熒光法的應(yīng)用最為廣泛，目前成為國際上通用的兩蟲檢測方法[2-4]。

ICR法是應(yīng)用最早的一種兩蟲檢測方法，又稱為梯度分離法。蔗糖漂浮法和福爾馬林-乙酸乙酯法主要利用了各種組分比重不同的原理，從而實現(xiàn)了對孢囊和卵囊的分離和回收。但這種方法在實際應(yīng)用過程中，易被多種因素所干擾，從而導(dǎo)致該方法檢測結(jié)果準確性較低。

隱孢子蟲免疫分離法產(chǎn)生于美國，并取得了不錯的發(fā)展，后來將其應(yīng)用到賈第鞭毛蟲的檢測中，便形成了現(xiàn)在的EPA1623方法。其應(yīng)用的主要原理是帶有兩蟲抗體的磁珠可以專一地和兩蟲發(fā)生反應(yīng)，并形成兩蟲和磁珠的復(fù)合物，在經(jīng)過特殊處理的磁場中，可以有效地分離和提純該復(fù)合物。在酸性溶液中，可以重新將兩蟲和磁珠分離，然后對其熒光染色，最后通過顯微鏡計數(shù)。

碳酸鈣沉淀濃集法也是常用的兩蟲檢測方法，先在水樣中加入氯化鈣和碳酸鈉，并通過添加氫氧化鈉將溶液pH值提高到10左右，這時碳酸鈣會結(jié)晶，其結(jié)晶大小和蟲卵囊相近，并會產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，通過對沉淀物的收集，并加硫酸后的離心濃縮，最后對其進行染色檢測。

在以上三種方法中，ICR和免疫磁分離法比較成熟，目前免疫磁分離法發(fā)展較為迅速，且很好地克服了ICR法所存在的不足，因此在實際檢測中，EPA1623法被越來越廣泛地應(yīng)用，筆者將在下文中簡要介紹其實際檢測中的關(guān)鍵步驟。

2.1 EPA1623免疫磁分離法的關(guān)鍵步驟

由于實際水環(huán)境中的兩蟲數(shù)量較少，因此在得到水樣本后，需選擇1μm的濾囊過濾水樣，將其緊密連接到采樣接口處，并保證在加壓后不會脫開。在過濾過程中，將泵流量控制在2 L/min，在采集到足夠的水樣后，立即關(guān)閉蠕動泵。

在濾囊使用完畢后，及時將濾囊放空，并盡量排空濾囊中的水分，一定要盡量保證水從下口排出。在排水完畢后，淘洗濾囊，在淘洗過程中，將搖臂的擺角控制在90°左右，充分將包囊和卵囊從濾囊上分離下來。

將采集得到的過濾液放入到錐形離心管內(nèi)，并進行1 500 g的離心分離，在離心完成后，小心移除上清液，此過程一定要小心謹慎，避免將溶液弄混。如果所得的沉淀物小于或等于0.5mL，可一次將其轉(zhuǎn)移到側(cè)平面管中，如果體積超過0.5mL，需要分次轉(zhuǎn)移，保證每次轉(zhuǎn)移的量不超過0.5mL，在轉(zhuǎn)移完畢后，做好對沉淀物的標記。

先將Buffer-A溶液和Buffer-B溶液各1mL加入到側(cè)平面管，再加入離心溶液加入，并將兩次潤洗離心管后液體也一并轉(zhuǎn)入，然后分別加入DynabeadsGiardia-Combo和DyanabeadsCrypto-Combo各100μL。將上述混合液放在25 r/min的攪拌器上旋轉(zhuǎn)1 h后，再將其放入到磁濃縮器MPC-1中90°旋動2 min，倒出上清液后，再加入1 mLBuffer-A溶液，隨后輕柔地將其轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管內(nèi)，再放入另一個磁粒子濃縮器MPC-M中，搖動1 min后，吸出上清液，隨之對溶液加酸酸化，并放置在載玻片上，采用二次酸化的方法，來提高其回收率。

此時應(yīng)該進行對樣本的染色工作。先在樣本上滴一滴甲醇，并在干燥后，加入熒光染色液，靜置30 min后，再加入DAPI染色劑，2 min后清洗，然后加入一滴固劑封片。

按一定的順序在鏡片上進行掃讀，此時，就可以利用熒光反應(yīng)、DAPI染色特性、DIC觀測鏡片。在藍光激發(fā)下，賈地鞭毛蟲孢囊會呈現(xiàn)帶明亮蘋果綠色的橢圓形，在紫外光下，孢囊內(nèi)部還會呈現(xiàn)出藍色的核。還可以通過DIC觀察到刺突、柄、附屬物等典型結(jié)構(gòu)。隱孢子蟲的卵囊在藍光熒光的激發(fā)下，則呈現(xiàn)出明亮蘋果綠的微橢圓的圓形，在紫外光下，卵囊還會呈現(xiàn)出藍色的核。

在試驗過程中，要嚴格控制各種檢測工藝的時間，并做好試驗的防護工作，防止受到病原體的感染。

3 結(jié)語

隨著人們生活水平的不斷提升，人們對飲水的衛(wèi)生情況提出了更高的要求。賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲在進入到人體后，會對人體健康產(chǎn)生很大的威脅，因此對其防范工作十分重要。為了對兩蟲進行有效的防范，必須做好水環(huán)境中的檢測工作。目前對兩蟲的檢測方法較多，其中免疫磁分離法發(fā)展較快，并取得了不錯的應(yīng)用效果。但該方法的操作較為復(fù)雜，想要得到更準確、更高效的試驗結(jié)果，還需要檢測人員不斷提高自己的檢測技能。

[1]崔福義,左金龍,趙志偉,等.飲用水中賈地鞭毛蟲和隱孢子蟲研究進展[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,38(9):1487-1491.

[2]張致一,李聞,于凌琪,等.天津和沈陽末梢水中賈地鞭毛蟲和隱孢子蟲調(diào)查[J].環(huán)境與健康雜志,2009,26(1):52-53.

[3]韓范,譚渭仙,周性蘭.南京地區(qū)人體隱孢子蟲病2例報告[J].江蘇醫(yī)藥,1987(13):692.

[4]鄧明俊,肖西志,孫濤,等.藍氏賈地鞭毛蟲檢測技術(shù)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33(12):168-173.