PCR技術在食品藥品檢測中的應用

胡孔興，董菁，陳佳峰，劉麗

(1.蕪湖市食品藥品檢驗中心，安徽 蕪湖 241000； 2.蕪湖市食品藥品稽查支隊，安徽 蕪湖 241000)

PCR技術(即聚合酶鏈式反應技術)的原理是首先讓雙鏈DNA 變性成單鏈，接著將其與特定引物結合，使單鏈DNA在聚合酶的促使下向3′末端延伸合成，進而產生新的雙鏈，新產生的雙鏈將作為模板，循環(huán)重復以上反應，不斷擴增出所需DNA雙鏈，最終使目的片段實現指數倍的增加[1]。由于PCR技術靈敏性高、特異性強，且操作簡單，因此在應用范圍上得到不斷延伸。隨著PCR技術的迅猛發(fā)展，近些年來，基于常規(guī)PCR技術不停地衍生發(fā)展出很多新的技術，如：多重PCR、實時熒光定量PCR、PCR Array技術等。本文就近些年來PCR檢測技術在食品和藥品檢測領域中的應用進行綜述，以期促進PCR技術的進一步普及推廣，并為食品和藥品的快速鑒定、檢測提供參考。

1 PCR技術在食品檢測中的應用

近些年來，國內的食品安全問題日益凸顯，食物中毒事故時有發(fā)生，食品安全形勢愈發(fā)嚴峻，給國人的身心健康與飲食安全帶來嚴重威脅。除此之外，食品安全問題還影響和制約了食品工業(yè)的發(fā)展，因此食品質量的檢測環(huán)節(jié)就顯得尤為重要。由于PCR技術具有快捷、準確等優(yōu)點，被廣泛應用于食源性致病菌、非致病菌、食品成分等檢測當中。

1.1 PCR技術在食源性致病菌檢測中的應用

食品中的致病菌是導致食物中毒的主要原因之一，人類的食物鏈中，最為主要的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等[2]。傳統(tǒng)的食源性致病菌的檢測方法大多耗時長、步驟多，已無法滿足當前食品安全領域對檢測技術的要求。而使用PCR技術，能夠大幅提高食源性致病菌檢測的靈敏性與特異性，并具有成本低、速度快、準確度高等優(yōu)點，因此PCR技術在食品檢測領域有著廣泛的應用前景[3]。

1.1.1 PCR技術在大腸桿菌檢測中的應用

大腸桿菌在人或動物的腸道內一般都有附著，故屬于正常菌群，在衡量食品受糞源性污染與否時，大腸桿菌是目前國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌[4]。為了保證食品的衛(wèi)生性與食用的安全性，檢測食品中的大腸桿菌是不可缺少的一個環(huán)節(jié)。但傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測方法具有耗費時間較長、檢測靈敏度較低等一系列問題，而PCR技術可以很好地解決這些問題。有研究人員采用常規(guī)PCR技術檢測受到大腸桿菌污染的牛乳，在不增菌的情況下，全脂乳、脫脂乳的檢出限均為104 CFU/mL，在增菌后檢出限達到了1 CFU/mL，檢出限較傳統(tǒng)方法有了明顯提高；另外，整套檢測過程僅需12 h，而國標法卻需要72 h，與國標法相比，該方法大大減少了檢測所需時間[5]。雖然大多數時候，大腸桿菌危害性不大，但有些亞型仍然會引發(fā)嚴重的疾病，如腸出血性大腸桿菌。不過,傳統(tǒng)的單一常規(guī)PCR方法也很難準確檢查出腸出血性大腸桿菌，主要原因是大腸桿菌菌株產生的毒素具有一致性，這就需要用到一些新的方法。Cho等[6]選取了調控編碼蛋白的DNA序列作為靶序列，建立了一種能根據特異性鑒定大腸桿菌O157血清型的新方法，相對于以往選取傳統(tǒng)目的基因當作模板的方法，該方法具有更好的特異性與靈敏度。

1.1.2 PCR技術在沙門氏菌檢測中的應用

沙門氏菌是腸桿菌科中導致人畜共患病的一種十分多見的致病菌，目前食物受到沙門氏菌污染的狀況，在肉類和蛋奶類食物中較為常見。在國外的食物中毒案例中，由沙門氏菌所導致的食物中毒往往占據了較大的比例。當然在我國也不例外，致病菌引起的食物中毒案例中有70%到80%和沙門氏菌有關。但沙門氏菌在食品中的含量往往比較低，因為在加工制造食品等過程中會對沙門氏菌造成損傷，所以其含量會大大降低，而這會影響沙門氏菌檢測的精準性。為了更好地防止食源性疾病的發(fā)生，保障食品安全，建立一套快速、敏感且特異性強的沙門氏菌檢測方法是很有必要的。有研究人員以invA基因作為靶序列，并設計了一對引物，能在沙門氏菌中擴增出198 bp的片段，但是在大腸桿菌、單增李斯特氏菌等菌中均不擴增，表現出極好的特異性；另外對標準沙門氏菌菌種純培養(yǎng)液PCR方法的靈敏性進行檢測，發(fā)現其檢測的極限為72個菌；最后研究人員用該方法對樣品進行檢測，檢測得到的結果與傳統(tǒng)鑒定方法的結果完全相符，因此可以將PCR作為沙門氏菌快速檢測方法[7]。當然，PCR技術除了可以用于快速檢測沙門氏菌是否存在外，還可以用于沙門氏菌血清型的鑒定。方婷子等[8]分別基于O抗原、H1以及H2抗原中選取的基因，設計得到引物進行PCR擴增，且與測序相結合，然后測定實驗選取的沙門氏菌株的血清型，最終顯示假陽性結果的只有一株傷寒沙門氏菌的H2抗原，準確率高達98.7%，表明該方法能夠精確、迅速鑒定沙門氏菌株的血清型，因此PCR技術可以作為沙門氏菌血清型鑒定的一種新方法。

1.1.3 PCR技術在金黃色葡萄球菌檢測中的應用

金黃色葡萄球菌系微球菌科，屬兼性厭氧菌，在水、大氣、塵埃、人畜排泄物等中廣泛存在。蔬菜、肉類等食品中金黃色葡萄球菌極為常見，是引起食物中毒的常見致病菌之一。馮可等[9]建立了一種PCR方法，可應用于鮮切果蔬中金黃色葡萄球菌的檢測，該方法基于金黃色葡萄球菌的nuc基因，根據此基因設計篩選出引物，優(yōu)化多重PCR的反應體系以及反應條件，使用優(yōu)化過后的多重PCR方法對不同接種量進行富集，然后進行驗證，最后結果表明經過9 h的富集，該方法的檢出限可以達到1 CFU/g；相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，使用PCR技術可以節(jié)省勞動力、試劑和時間等，對于大批量樣品的微生物檢測來說，更是具有重要的指導意義。

在很多時候，金黃色葡萄球菌不僅僅會在食物中大量繁殖，而且會產生腸毒素SE，而腸毒素SE是造成食物中毒的重要因素之一。目前已發(fā)現的腸毒素有20多種血清型[10]，常見的SE有11種，分別為SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SER、SES和SET[11-15]，其中以SEA最為常見(約占78%)，然后是SED。一般認為，SEA的毒性最強，由它引起的食物中毒的報道也最多[16-17]。目前，檢測腸毒素SE的常用基因型有SEA、SEB、SED、SEH和SEI等，隨著PCR技術的成熟，研究人員已能對金黃色葡萄球菌所產腸毒素進行有效鑒定與分型，葉素貞等[18]采集8類食物共454份樣品，按照國家標準上的方法對樣品中的金黃色葡萄球菌進行培養(yǎng)、分離和鑒定，用Real-time PCR法對菌株中攜帶腸毒素SEA—SEE的情況進行檢測，結果檢出產生腸毒素陽性的有8株，攜帶的主要是SEA、SEB和SED。

1.1.4 PCR技術在其他病原微生物檢測中的應用

除以上3種主要食源性致病菌外，單增李斯特菌、志賀菌、副溶血性弧菌、耐藥球菌、彎曲菌等也是食品微生物檢測中不可忽視的病菌。近年來，采用多重PCR技術檢測食品中這些重要致病菌的案例，在國內外都有很多報道。多重PCR技術相對于常規(guī)PCR技術而言，具有更簡便、更高效、費用相對較低等優(yōu)點，能夠同步進行多種病原微生物的檢測。隨著對食品檢測快速性要求的提高，采用多重PCR技術同時檢測多種病原微生物必將成為一種趨勢。林碧蓮等[19]通過先篩選設計出目標菌株的探針和引物，然后對反應體系進行優(yōu)化，建立了多重qPCR的穩(wěn)定反應體系，再通過加標陽性菌株的方式檢驗體系的特異性，確定出檢出限，最終結果顯示，此方法可高效率地檢測出嬰幼兒奶粉樣品中的3種致病菌。而李慶超[20]則從查到的7種病原菌(包括乙型副傷寒沙門氏菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等)的共18個基因中，驗證篩選出目標菌的特異性基因，并將其作為目的基因設計出特異性較好的引物，然后優(yōu)化其反應條件，最終得到的反應體系具有較高穩(wěn)定性，其檢出限更是達到了1.2 CFU/mL，此方法的檢出限較已有方法有了大幅度的提高。

1.2 PCR技術在食源性非致病菌檢測中的應用

PCR技術除在食源性致病菌的檢測中廣泛應用外，亦經常應用于食源性非致病菌的檢測。食品中非致病菌雖然對人體危害不大，但通過檢測非致病菌在食品中的含量可以判斷食品是否變質、食品營養(yǎng)價值如何以及發(fā)酵程度等等。比如泡菜中大多具有乳酸菌，這是一種非致病菌，可生長在缺氧的環(huán)境中，通過檢測乳酸菌可以輔助判斷泡菜當前的發(fā)酵情況等。石慧等[21]建立了一種EMA-qPCR方法，用來檢驗泡菜中乳酸菌活菌的數量，該方法中EMA能夠抑制乳酸菌死細胞的PCR擴增，但不影響乳酸菌活菌的PCR擴增，實驗最終成功檢測并比較出發(fā)酵時間不同的泡菜乳酸菌活菌數量的差異。而盛雅萍[22]則采用PCR擴增法及HPLC法，從38株乳酸菌中篩選出不產生生物胺的乳酸菌，將篩選得到的不產生生物胺的乳酸菌菌株加入到正在發(fā)酵的羊肉臘腸中，經過實驗發(fā)現，加入該菌株的發(fā)酵羊肉臘腸的組胺及酪胺含量均有明顯的下降，此方法可為開發(fā)優(yōu)良肉制品發(fā)酵劑提供重要參考依據。由于食品檢測的復雜性，采用一種檢測方法往往具有一定的局限性，研究人員將EMA和HPLC與PCR技術配合使用，大大提高了實驗結果的準確性。

1.3 PCR技術在食品檢測中其他方面的應用

近年來，隨著PCR技術的快速普及與發(fā)展，一些新型的PCR理論與技術層出不窮，PCR技術不再僅僅應用于食品中微生物的檢測，在食品檢測的其他方面也有了具體的應用，如：食品的成分檢測、轉基因食品的檢測、食品摻假檢測等。在轉基因食品檢測中，PCR技術的應用近幾年尤為熱門，由于轉基因食品往往含有新的蛋白質及DNA，轉基因食品是否安全目前爭議較大，所以轉基因食品需要經過嚴格檢驗之后才能讓人們放心大膽地食用。目前，使用比較多的轉基因食品檢測方法主要有蛋白質或蛋白酶活性檢測法以及PCR法等，在這些方法中，使用PCR技術進行檢測是最為準確高效的。當前較為熱門的qPCR技術靈敏程度較高、特異性較強，因此含量極低的轉基因成分也能被檢測出來。熒光定量PCR是另一種新型PCR技術，該技術其實是加入了一種熒光基因，這種熒光信號會被應用于整個PCR檢測過程，成功解決了以往PCR檢測方法中存在的準確度低和假陽性問題[23]，但是此方法也存在一定的不足，比如：儀器昂貴、使用成本高、檢測目標單一等，這些不足增加了該技術普及推廣的難度。張海波等[24]則使用了Taqman探針實時熒光PCR方法檢測轉基因玉米，該方法通過檢測玉米樣品中的CaMV35S啟動子與NOS終止子，實現對現有玉米轉化體的快速篩查，靈敏度可以達到0.1%，檢測時間較傳統(tǒng)PCR方法也有顯著的縮短，實驗結果表明該方法可作為玉米中轉基因成分的快速篩查新方法。

2 PCR技術在藥品檢測中的應用

當前，PCR技術應用于藥品的檢測尚不多見，已有的文獻報道中，PCR技術多見于中藥鑒定與藥品微生物檢測。由于PCR技術本身具有先進性、實用性等特點，相信在不久的將來，PCR技術必將更大范圍應用于藥品的檢測。

2.1 PCR技術在藥品微生物檢測中的應用

目前，實時熒光PCR技術在藥品的微生物檢測中應用比較多，該技術比傳統(tǒng)PCR技術更迅速、更準確地檢測出藥品中的有害微生物。劉婷婷等[25]選取了8個品種的藥品接種了金黃色葡萄球菌，然后進行增菌，同時用平板分離法與實時熒光PCR法進行檢查，通過比較兩種方法得到的結果，發(fā)現兩種方法的陽性樣本檢出率均達到了100%。此外，實驗結果還表明實時熒光PCR法具有快速、準確的特性。王曉沖等[26]利用裂解試劑盒提取大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的基因組DNA，然后用實時熒光定量PCR進行檢測，樣品中死細菌的基因組DNA使用PMA抑制其擴增，最終實驗所測結果與藥典方法所測結果一致，并且使用該方法分析藥品中的細菌污染情況，檢測時間可以大幅減少至4 h左右，同時還具有操作簡便、檢測靈敏度高等優(yōu)點，說明PCR技術可以作為藥品無菌檢查的快速篩查方法。

2.2 PCR技術在中藥鑒定中的應用

近些年來，中藥材價格不斷上漲，中藥材尤其是名貴中藥材制假摻假現象頻頻發(fā)生，嚴重威脅到人們的用藥安全。由于中藥材成分的復雜性，難以單純用化學成分來辨別中藥材的偽劣，這就需要引入新技術、新方法。PCR技術的迅速發(fā)展，給中藥的鑒定與檢測提供了一個新思路。蔣超等[27]依據金銀花trnL-trnF序列上的特異性位點來設計特異性PCR引物，優(yōu)化PCR的條件后，使用該方法對金銀花與混淆品進行PCR擴增及檢測，其中金銀花樣品加入SYBR Green I染色后，產生綠色熒光，而混淆品不產生熒光，整個檢測過程僅僅在30 min內便可以完成，實驗結果表明該方法能夠準確快速地鑒別出金銀花和混淆品。市場上蛇類中藥材大多比較名貴，如烏梢蛇、蘄蛇等，因此常常會出現一些偽品。陳康等[28]采用堿裂解法提取蛇類藥材樣品中的基因組總DNA，然后添加特異性的PCR引物進行PCR擴增，加入染料SYBR Green I后，正品有綠色明亮的熒光出現，混淆品則沒有熒光。這種利用PCR技術快速鑒定蛇類藥材真?zhèn)蔚臋z測方法，完成真?zhèn)舞b定僅需30～45 min，為蛇類藥材快速鑒定提供了技術參考。當然，PCR技術不僅僅應用于中藥飲片的鑒定，中成藥的檢測與鑒定中也能看到它的身影，蔣超等[29]根據上文所述的金銀花trnL-trnF序列上的一個位點，設計出可供鑒別的特異性引物，然后對金銀花的原植物及其配方顆粒進行鑒定，最終的實驗結果表明該方法不僅可以對中藥配方顆粒進行優(yōu)劣真?zhèn)蔚目焖勹b定，還可以彌補中藥顯微鑒別與性狀鑒別的局限性，為中藥配方顆粒的生產、流通、安全用藥等環(huán)節(jié)提供了技術支撐。

2.3 PCR技術在藥品檢測中其他方面的應用

近些年來，由于藥學研究的盛行，加上PCR新技術的快速發(fā)展，PCR技術在藥學研究的很多領域得到了應用，如在目前快速發(fā)展的藥理學研究中，PCR技術常常被用來檢測藥效成分以及機體目標成分。如PCR Array技術，這項技術也被稱作PCR陣列或者基因功能分類芯片，它結合了Real Time PCR技術的高特異性和高靈敏度以及微陣列技術，具有能夠同時檢測多個基因等優(yōu)點，是分析信號通路或者某生物學功能相關基因表達狀態(tài)的重要工具。張妮等[30]就采用了PCR Array技術作為輔助技術對大鼠進行了研究，將大鼠隨機分為3組(即空白對照組、高脂血癥組、丹參酮組)開展實驗，結果發(fā)現丹參酮組的大鼠肝臟脂滴減少，PCR Array則顯示出丹參酮組的Abca1、Lep、Pcsk9等mRNA發(fā)生差異性變化，表明丹參酮Ⅱa可以影響高脂血癥大鼠肝臟脂蛋白和膽固醇信號通路的相關基因mRNA的表達。除此之外，PCR技術還在中藥原植物的基因表達分析研究中大放異彩，PCR技術對研究中藥中有效物質含量的動態(tài)變化有著重要的意義。如Kim等[31]以熒光定量PCR技術作為輔助研究手段，在人參葉片的不同開放期，檢測其體內的人參皂苷含量與生物合成途徑上的關鍵酶基因，結果發(fā)現在人參葉片開放期的中間階段及全開放階段，人參皂苷合成途徑上的關鍵酶基因PgSS和PgSE的表達量比閉合階段增加約1.5倍，而關鍵酶基因PgDDS的表達量更是達到4倍以上的水平；在人參的主根和側根中，人參皂苷含量在葉片開放期的中間階段達到最大值，在葉片中，人參皂苷的含量是在全開放階段才達到最高水平。

3 小結與展望

食品藥品安全是當今社會人們最為關注的一個問題，這就對食品與藥品的安全檢測提出了很高的要求。因此需要研究人員去尋求迅速、準確、靈敏的檢測新技術，這樣才能更好地保障食品藥品的質量安全。當前PCR技術的普及和發(fā)展，為食品藥品的檢測工作指明了新的發(fā)展方向，運用PCR技術除了可以明顯提高食品藥品的微生物鑒定分型的準確性和效率，還可以對微生物進行定性和定量檢測[32]，PCR技術將會在中藥檢測與鑒定領域中具有越來越高的地位。當然，PCR技術雖說已是一種比較成熟完備的技術，但并非十全十美，也有一定的局限，如僅單一采用PCR技術容易出現假陽性的情況、儀器與試劑的成本較高、預處理時間較長等。因此，當前PCR技術還有很大的完善空間，未來還可繼續(xù)研究如何減少PCR前處理的時間或是其他步驟的時間，以達到縮短檢測全過程時間的目的。此外，可開發(fā)PCR聯(lián)用技術，使用PCR聯(lián)合多種檢測手段進行檢測，以便更好地提高檢測結果的準確性，如上文所述的PCR與PMA、EMA等聯(lián)用，可較好地避免死菌對實驗結果造成的影響等。相信經過不斷地研究、改進和完善，假以時日，PCR技術必將成為食品藥品檢測工作中不可或缺的重要技術手段。