益生菌胞外蛋白與腸道粘膜免疫細(xì)胞互作關(guān)系的研究進(jìn)展

臧凱麗,任效東,王秋萍,王 泳,閻亞麗,趙 培,趙林森,劉愛(ài)國(guó),*,陳慶森,*

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.河北一然生物科技有限公司,河北石家莊 050800)

腸道是消化吸收的重要場(chǎng)所,也是人體最大的免疫器官。腸粘膜作為一個(gè)巨大的外環(huán)境表面,是機(jī)體與環(huán)境進(jìn)行各種信息交流的重要場(chǎng)所。益生菌最初主要是有選擇性地被應(yīng)用于食物的加工處理過(guò)程中,隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展,應(yīng)用的范圍逐漸拓寬,益生菌及其制劑已作為活菌膳食補(bǔ)充劑用于促進(jìn)機(jī)體健康發(fā)展[1]。益生菌(Probiotics)是一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物,定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi),能產(chǎn)生確切的有益健康的功效從而改善宿主微生態(tài)平衡[2]。研究報(bào)道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了30多種疾病與腸內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)有關(guān),使用人體無(wú)害的益生菌治療一些腸道疾病(如糞菌移植技術(shù))和疑難雜癥(諸如癌癥、糖尿病、肥胖癥、過(guò)敏等)均與腸內(nèi)細(xì)菌有關(guān)[3-6]。眾多科學(xué)研究精準(zhǔn)地指向,對(duì)腸道菌群的研究和深度解析是解決人類(lèi)健康問(wèn)題的一條可行途徑。益生菌分泌的胞外蛋白是一類(lèi)具有增強(qiáng)粘膜屏障、免疫調(diào)節(jié)、維持腸道穩(wěn)態(tài)功能的蛋白質(zhì),研究表明,胞外蛋白在益生菌與腸上皮細(xì)胞之間的相互作用中起到關(guān)鍵作用。本文首先概括腸粘膜系統(tǒng)及其免疫機(jī)制和益生菌分泌胞外蛋白的作用,然后系統(tǒng)地介紹國(guó)內(nèi)外對(duì)分泌胞外蛋白的益生菌的相關(guān)研究進(jìn)展,并提出益生菌分泌的胞外蛋白在一定程度上為腸道疾病的治療提供了一些科學(xué)解釋和有價(jià)值的解決途徑。

1 腸粘膜系統(tǒng)及其免疫機(jī)制

龐大的腸道粘膜面積構(gòu)成了強(qiáng)大的機(jī)體粘膜免疫系統(tǒng),加之在腸道中生存著的大量微生物菌群,致使外源細(xì)菌和病毒很難突破這道防線對(duì)生物體產(chǎn)生危害,所以人們認(rèn)識(shí)到腸粘膜對(duì)健康至關(guān)重要[7]。

1.1 腸道粘膜系統(tǒng)

腸道粘膜是宿主防御外來(lái)有害物質(zhì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響的重要屏障,其免疫系統(tǒng)由三道防線構(gòu)成:第一道防線是腸道正常菌群,在整個(gè)腸粘膜免疫中起到機(jī)械屏障的作用,能夠?qū)惯M(jìn)入消化道的病原微生物;第二道防線的主要成員是腸道上皮組織,通過(guò)分泌抗微生物的蛋白質(zhì)或活性肽來(lái)保護(hù)腸粘膜不被損害;第三道防線中的“衛(wèi)士”是腸道中的免疫系統(tǒng)和免疫組織[8]。

1.2 腸道粘膜免疫系統(tǒng)分泌粘膜因子的方式

對(duì)抗病原微生物的腸粘膜免疫可分為先天性免疫和后天獲得性免疫,其先天性免疫是構(gòu)成腸粘膜屏障的基礎(chǔ)[9]。腸道中的粘膜免疫反應(yīng)是由腸粘膜表面附著的抗原引發(fā)的,首先,腸道粘膜中的淋巴濾泡集結(jié)將抗原物質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)部的巨噬細(xì)胞中進(jìn)行加工,然后,將其轉(zhuǎn)移給輔助性T細(xì)胞,從而激活B淋巴細(xì)胞,使之分化增強(qiáng),產(chǎn)生大量粘膜免疫的主要效應(yīng)因子—分泌型IgA(SIgA),通過(guò)有效中和粘膜上皮內(nèi)的病原體、細(xì)菌毒素和酶,削弱細(xì)菌表面疏水性,阻止病毒附著、細(xì)菌和抗原的粘附,刺激腸道粘膜表面分泌粘蛋白降解病毒,與細(xì)菌等形成免疫復(fù)合物并排出體外等作用保護(hù)機(jī)體不受外來(lái)病毒和毒素的侵害。這種方式是腸粘膜識(shí)別腸內(nèi)細(xì)菌是否可以定殖在腸道內(nèi)的重要方式,事實(shí)上,腸道內(nèi)分泌型IgA抗體不是為了對(duì)抗腸內(nèi)細(xì)菌,而是為了挑選對(duì)人類(lèi)必要的細(xì)菌讓它們留在腸道中。對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō),在腸道中生存并不是那么簡(jiǎn)單的事,腸道中經(jīng)常會(huì)發(fā)生蠕動(dòng)流,唯一不會(huì)受到蠕動(dòng)流影響的是覆蓋在腸壁的粘液層,這對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō),是舒適的棲身之地。但粘液層的粘性很強(qiáng),普通的細(xì)菌無(wú)法進(jìn)入,具有抗體吸附的細(xì)菌減少了粘液的排斥,才得以進(jìn)入粘液層,所以只有IgA抗體選擇的細(xì)菌才能進(jìn)入粘液層[10]。

2 益生菌及胞外蛋白質(zhì)分泌的研究

近些年國(guó)內(nèi)外眾多的學(xué)者研究報(bào)道了益生菌具有明顯促進(jìn)小鼠腸粘膜免疫的作用[11],能夠影響早產(chǎn)兒機(jī)體免疫功能的成熟和發(fā)展[12],能粘附于腸粘膜并明顯抑制致病菌粘附,可提高腸道微生態(tài)的穩(wěn)定性[13],并且,研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)修復(fù)受損腸屏障,從而達(dá)到減輕腸道炎癥的目的[14],說(shuō)明益生菌在維護(hù)健康和預(yù)防疾病方面起著重要作用[15]。目前,解釋并闡述國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究結(jié)論的分子基礎(chǔ),就是從益生菌分泌的對(duì)腸粘膜免疫起調(diào)節(jié)作用的代謝物質(zhì)入手,其中,益生菌分泌的“胞外蛋白”就是一類(lèi)重要的物質(zhì),并已經(jīng)獲得了一些研究成果。

就益生菌表達(dá)胞外蛋白而言,具有分泌胞外蛋白的益生菌主要有乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌等,胞外蛋白在益生菌與上皮細(xì)胞之間的相互作用中的作用不容小覷[16]。研究表明,胞外蛋白可以參與調(diào)節(jié)腸粘膜的免疫機(jī)制,包括與其他細(xì)菌的信息交流、與宿主免疫系統(tǒng)的交流、調(diào)節(jié)粘膜屏障功能等,通過(guò)這些機(jī)制不僅可以解釋促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)的物質(zhì)基礎(chǔ),也揭示了益生菌保障腸道健康的科學(xué)依據(jù)。重要的是,有一些分泌胞外蛋白的益生菌已通過(guò)生物信息學(xué)手段進(jìn)行了鑒定,確定了細(xì)菌的胞外蛋白可分為兩類(lèi),第一類(lèi)是含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì),這種信號(hào)肽是位于序列的N-末端,直接指導(dǎo)輸出蛋白質(zhì)。第二類(lèi)是與細(xì)胞表面相關(guān)的蛋白質(zhì),因細(xì)菌細(xì)胞壁的正常翻轉(zhuǎn)而簡(jiǎn)單地從細(xì)菌直接脫落[17]。研究顯示,在真細(xì)菌界這些分泌系統(tǒng)是高度保守的,在基因編碼單體組分中表現(xiàn)高度的同源性,這些系統(tǒng)在革蘭氏陰性細(xì)菌上表現(xiàn)的很明確,至少存在有七種不同的分泌系統(tǒng)[18]。然而,在腸道益生菌中大部分是革蘭氏陽(yáng)性菌,大多數(shù)蛋白的分泌均是通過(guò)一般的分泌途徑(the general secretory pathway)和特殊的蛋白輸出系統(tǒng)(the specific protein export systems)兩種途徑進(jìn)行的[19]。第一種分泌途徑是以含有一個(gè)信號(hào)肽為特征,并攜帶一種特殊的分選酶裂解基序(sortase cleavage motif),最著名的是Ala-X-Ala(信號(hào)肽Ⅰ型(signal peptide type Ⅰ))和 Leu-Ala-Gly-Cys(信號(hào)肽Ⅱ型(signal peptide type Ⅱ或稱(chēng) lipobox 基序)[20]。原核細(xì)胞蛋白質(zhì)sec分泌途徑,即一般分泌途徑,新合成的蛋白質(zhì)作為一種前體蛋白質(zhì),并且以未折疊狀態(tài)依靠 Sec蛋白質(zhì)形成的親水通道運(yùn)輸[21]。第二種輸出系統(tǒng),是以折疊/低聚體狀態(tài)分泌,包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[22]。一般認(rèn)為一旦蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面它就會(huì)發(fā)揮其相應(yīng)的功能,如粘附素(adhesins),但蛋白質(zhì)如何從胞內(nèi)跨越細(xì)胞質(zhì)膜到細(xì)胞表面仍待研究。

益生菌的胞外蛋白可以通過(guò)覆蓋腸粘膜的粘液層進(jìn)行擴(kuò)散,使其與上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行相互作用。在某些情況下,信號(hào)通過(guò)不同的通路傳輸?shù)郊?xì)胞核中,這通常要有一些激酶的參與,如絲分裂素激活蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)及糖原合成激酶-3(GSK-3)等。這些共同作用會(huì)引起基因表達(dá)發(fā)生變化,細(xì)胞水平上也隨之發(fā)生變化。益生菌的胞外蛋白可以調(diào)節(jié)一些信號(hào)通路和細(xì)胞應(yīng)答,如不同效應(yīng)分子的分泌(如趨化因子、細(xì)胞因子、還有抗菌肽(防御素))、粘蛋白的分泌、免疫功能的調(diào)節(jié)和腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)細(xì)胞應(yīng)答[23]。胞外蛋白對(duì)腸粘膜免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)要通過(guò)可以識(shí)別胞外蛋白的受體來(lái)實(shí)現(xiàn),Toll樣受體(Toll-like receptor)就是其中一種,它通過(guò)將胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)識(shí)別胞外蛋白及其攜帶的信息傳遞給樹(shù)突細(xì)胞,從而使樹(shù)突細(xì)胞被活化而成熟,提供獲得性免疫共刺激信號(hào),從而誘導(dǎo)某些促炎細(xì)胞因子(IL-12,IFNγ)的產(chǎn)生[24],如TLR-5可以識(shí)別鞭毛蛋白[25]。另一種受體是C型凝集素受體(CLR),現(xiàn)已證明DC-SIGN(DC-specific ICAM-3-grabbing non-integrin)可以識(shí)別益生菌的某些胞外蛋白[26]?？傊?益生菌胞外蛋白是通過(guò)腸粘膜的交互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)腸粘膜免疫系統(tǒng)的啟動(dòng),從而促進(jìn)宿主腸道的健康。

3 分泌胞外蛋白的益生菌及研究的進(jìn)展

3.1 分泌胞外蛋白的乳酸菌

乳酸菌是人類(lèi)腸道重要的益生菌,乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的平衡,增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抵抗力,促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)和發(fā)育,受到了學(xué)界極大關(guān)注。近些年來(lái)報(bào)道了一些乳酸菌分泌的胞外蛋白研究成果,解釋了為什么會(huì)對(duì)人體腸道的穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響。

3.1.1 增強(qiáng)粘膜屏障和維持人類(lèi)腸道穩(wěn)態(tài) Yan等[27]已研究出兩種從鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)上清液純化出的蛋白質(zhì)—p75和p40,它們是一類(lèi)能夠維持胃腸道穩(wěn)態(tài)的促生長(zhǎng)因子,能夠激活蛋白激酶B,并通過(guò)PI-3K通路抑制細(xì)胞凋亡,防止腸上皮細(xì)胞YAMC(Young Adult Mouse Colon cells)的損傷,因此有預(yù)防和治療胃腸疾病的作用。Sánchez等人[28]以鼠李糖乳桿菌GG為研究對(duì)象,對(duì)該菌所分泌的蛋白質(zhì)采用SDS-PAGE進(jìn)行了分離,用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)鑒定,發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在MRS肉湯的鼠李糖乳桿菌分泌的幾種蛋白質(zhì),確定有一些具有預(yù)防上皮細(xì)胞屏障(細(xì)胞壁水解酶)和細(xì)菌粘附(GAPDH)損壞等特定的功能表現(xiàn)。Tao等[29]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)分泌的一種可溶性蛋白質(zhì)(LGG-CM)能引起腸上皮細(xì)胞熱休克蛋白(Hsp)表達(dá)增多,包括Hsp70和Hsp25。這種誘導(dǎo)作用持續(xù)時(shí)間很短,但上皮細(xì)胞能持續(xù)表達(dá)Hsp,并證實(shí)LGG-CM通過(guò)激活MAPKs途徑而調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞Hsp表達(dá),p38和JNK的阻止劑能阻斷Hsp的表達(dá),揭示Hsp能保護(hù)腸上皮細(xì)胞免于氧應(yīng)激,保持腸上皮細(xì)胞完整性。

Beck等[30]對(duì)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)來(lái)源的細(xì)胞相關(guān)表層蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了分析,通過(guò)SDS-PAGE電泳分析結(jié)合毛細(xì)管LC-ESI-MS/MS獲得了肽序列,經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索認(rèn)定29種蛋白質(zhì),它們中的許多蛋白質(zhì)可能涉及到益生菌在胃腸道中的作用,該結(jié)果為未來(lái)有關(guān)益生菌分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。Benardo等[31]以植物乳桿菌為模型,發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌分泌的一種肽STp可以誘導(dǎo)人類(lèi)腸道樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)炎癥、自身免疫疾病的預(yù)防及腸道穩(wěn)態(tài)的維持有重要作用的IL-10。因此,從應(yīng)用的角度,STp可以作為添加劑或保健成分添加到食品當(dāng)中,它也為IBD患者建立了非藥物飲食治療的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室在研究嗜酸乳桿菌CICC6005(LactobacillusacidophilusCICC6005)時(shí)發(fā)現(xiàn),以固體培養(yǎng)獲得胞外蛋白粗提液,分離L.acidophilusCICC6005胞外蛋白獲得兩個(gè)蛋白峰,分子量分別為67 ku和37 ku,含量分別為0.066 mg/mL和0.021 mg/mL,對(duì)HT-29細(xì)胞增殖具有不同程度的抑制作用,其中37 ku胞外蛋白的抑制作用較強(qiáng)[32]。研究進(jìn)一步探討了67 ku和37 ku胞外蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用途徑,結(jié)果顯示,不同濃度的67 ku和37 ku胞外蛋白分別作用于HT-29細(xì)胞一定時(shí)間后,兩種胞外蛋白均可以下調(diào)兩個(gè)信號(hào)通路途徑中p-ERK1/2、p-p38、p-Akt、PI3K蛋白的表達(dá),且存在濃度依賴(lài)關(guān)系,但對(duì)p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響。研究揭示了源于L.acidophilusCICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表現(xiàn)出顯著的抑制HT-29細(xì)胞增殖的功能,其機(jī)制可能與調(diào)控MAPK和PI3K-Akt兩個(gè)信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵的靶點(diǎn)蛋白的活化水平相關(guān),并且,食用嗜酸乳桿菌其分泌的胞外蛋白質(zhì)將發(fā)揮維護(hù)腸道健康的效果[33-34]。

3.1.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生 Schlee等[35]研究的7種乳酸菌株和VSL#3(a probiotic cocktail of four lactobacilli,three bifidum and one streptococcus species)證實(shí)益生菌經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生一種抗菌肽(防御素)能夠穩(wěn)定腸道屏障功能,并且在NF-κB和AP-1誘導(dǎo)及MAPKs、ERK、p38和JNU等多種激酶參與下分泌胞外蛋白—人β-防御素-2(hβD-2),使得IL-8的分泌量增加。

乳酸菌分泌的胞外蛋白還具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的作用。Konstantinov等[26]研究了嗜酸乳桿菌NCFM(LactobacillusacidophilusNCFM)釋放的蛋白SlpA可以與特異性受體DC-SIGN結(jié)合誘導(dǎo)DC分泌IL-10,可用于預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)LactobacillusacidophilusNCFM突變體釋放的胞外蛋白SlpB,可以誘導(dǎo)DC分泌IL-12p70、TNF-α、IL-1β。最近報(bào)道了[36]一種費(fèi)氏丙酸乳桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)的研究,費(fèi)氏丙酸乳桿菌傳統(tǒng)上用作一種干酪成熟發(fā)酵劑的有益的細(xì)菌,在近期有關(guān)該菌的益生能力的研究發(fā)現(xiàn),它基于釋放一種在小鼠體內(nèi)具有保護(hù)急性結(jié)腸炎的、免疫調(diào)節(jié)功效的有益代謝產(chǎn)物,從而有利于這種菌附著在宿主的細(xì)胞上而發(fā)揮腸道保護(hù)作用。最重要的是費(fèi)氏丙酸乳桿菌CIRM-BIA 129(P.freudenreichiiCIRM-BIA 129)表達(dá)的表層蛋白質(zhì)(surface-layer proteins),這種蛋白質(zhì)是完成一些功能所必需的,并具有菌株的依賴(lài)性。

3.2 分泌胞外蛋白的雙歧桿菌

雙歧桿菌是動(dòng)物腸道內(nèi)具生理性功能的細(xì)菌之一,它粘附于腸道粘膜上皮細(xì)胞后,定居形成穩(wěn)定的菌群,從而發(fā)揮其生理功能,主要體現(xiàn)在對(duì)宿主的生物屏障和生物拮抗作用、增強(qiáng)免疫、延緩機(jī)體衰老作用和抑制腫瘤作用等方面[29]。

3.2.1 抑制腫瘤和增強(qiáng)粘膜屏障功能 Mitsuma等[37]在雙歧桿菌BB-12(BifidobacteriumlactisBB-12)生長(zhǎng)穩(wěn)定期成功分離出一種由Cys、His、Trp、Pro和Arg五種氨基酸組成的短肽CHWPR,CHWPR可以穿過(guò)細(xì)胞膜與胞漿的核受體RORγ特異性結(jié)合,再與基因區(qū)域的啟動(dòng)子相結(jié)合,在HL-60細(xì)胞株中可以增強(qiáng)c-myc和IL-6的基因表達(dá),并且相對(duì)濃度較高的CHWPR對(duì)提高c-myc和IL-6的表達(dá)是有利的,但作用時(shí)間短而且消失快,該結(jié)果對(duì)解決腸道腫瘤疾病具有前景。

Ewaschuk等[38]在以IL-10缺陷性小鼠為模型的研究中發(fā)現(xiàn),嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)分泌的一種胞外蛋白可以使上皮細(xì)胞緊密連接蛋白(TJPs)和TER增加,進(jìn)而可以減少結(jié)腸癌發(fā)生的機(jī)率,并且還能降低結(jié)腸通透性,減弱炎癥反應(yīng),從而增強(qiáng)粘膜屏障。Gilad等人[39]開(kāi)展了動(dòng)物雙歧桿菌胞外蛋白質(zhì)組的研究,使用2D結(jié)合MALDI-TOF MS/MS對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌胞外蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)在鑒定的74種不同的蛋白質(zhì)中有31種在細(xì)胞表層或細(xì)胞外扮演了它們各自的生理學(xué)的角色,包括細(xì)胞壁代謝的蛋白質(zhì)及氨基酸、低聚糖結(jié)合蛋白質(zhì);18種蛋白質(zhì)具有同人體上皮細(xì)胞相互作用,或是與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的特點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的鑒定預(yù)示著在細(xì)菌和宿主之間能很好地為蛋白質(zhì)介導(dǎo)的交互作用定向的研究鋪平道路,也必將會(huì)達(dá)到增強(qiáng)人類(lèi)認(rèn)識(shí)益生菌的作用模式和促進(jìn)機(jī)體健康的目的。

3.2.2 免疫調(diào)節(jié) Hoarau等[23]在對(duì)短雙歧桿菌C50(BifidobacteriumbreveC50)分泌的胞外蛋白研究中發(fā)現(xiàn),它可以與TLR-2結(jié)合,通過(guò)不同通路途徑導(dǎo)致DC生理上的改變。一是可以增強(qiáng)樹(shù)突細(xì)胞的存活能力,這個(gè)過(guò)程是由PI-3K通路介導(dǎo)完成的;二是可以促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞成熟,這個(gè)由p38和PI-3K通路介導(dǎo),而且分別通過(guò)ERK、p38、PI-3K通路和p38、GSK-3通路可以增加IL-10、IL-12的分泌量。

Ivanov等[40]研究了定植在人體消化道的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)分泌的一種胞外蛋白質(zhì),也是絲氨酸蛋白酶抑制劑。通過(guò)研究該胞外蛋白的生化特性發(fā)現(xiàn),這種絲氨酸蛋白酶抑制劑可以有效抑制胰彈性蛋白酶和嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶,其中嗜中性粒細(xì)胞蛋白酶可以導(dǎo)致腸道急性炎癥,因此,這種抑制劑是直接作用并參與炎癥反應(yīng)的酶,在防止腸道疾病的發(fā)生方面表現(xiàn)出明顯的作用。

3.3 一些腸道有益菌分泌胞外蛋白的研究

在人體腸道中含有大量的大腸桿菌,有些菌對(duì)人體健康起著重要的作用。尼氏大腸桿菌1917(EscherichiacoliNissle 1917)是其中一種研究的比較好的菌株[41]。與其他腸道益生菌不同,它是一種革蘭氏陰性細(xì)菌,在常規(guī)抗生素應(yīng)用之前,這個(gè)菌株已經(jīng)在市場(chǎng)上用于治療腹瀉接近100年的時(shí)間[42]。在增強(qiáng)粘膜屏障功能方面的研究表明,具有益生功能的一些大腸桿菌屬的菌株是由于在腸道內(nèi)能夠分泌表現(xiàn)很好生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用的。Schlee等[43]研究了在NF-κB和AP-1誘導(dǎo)下,益生菌大腸桿菌Nissle 1917(probioticEscherichiacoliNissle 1917)可以分泌的一種胞外蛋白—鞭毛蛋白,它可以誘導(dǎo)hβD-2和IL-8的表達(dá),其中,hβD-2是上皮細(xì)胞分泌的抗菌肽,它可以抵制致病菌對(duì)上皮細(xì)胞的粘附和侵襲,因此可以增強(qiáng)粘膜屏障功能。

賈彥等人[44]探究了不同濃度的杜仲水提液對(duì)嗜酸乳桿菌CICC6005增殖以及對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中胞外和胞內(nèi)蛋白含量變化的影響,結(jié)果表明當(dāng)杜仲水提液濃度為0.125 g/mL時(shí),對(duì)其增殖有明顯的促進(jìn)作用,菌體生物量最大,同時(shí)在此濃度下菌體胞外蛋白和胞內(nèi)蛋白含量也達(dá)到最大值,且經(jīng)分離純化后胞外蛋白兩組分分子量分別為67 ku和31 ku,胞內(nèi)蛋白兩組分分子量分別為57 ku和17 ku,揭示了適宜濃度的杜仲水提液對(duì)L.acidophilusCICC6005的增殖起到了一定的促進(jìn)作用,并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的組成產(chǎn)生了一定的影響。

3.4 益生菌劑與胞外蛋白的分泌的研究

將已知有益的菌種,經(jīng)特殊工藝(如培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥等)制成純菌粉,與一定量的益生元(Prebiotics)混合,制成的具有一定功能的生物制劑,即為益生菌劑。對(duì)益生菌劑而言,目前已從開(kāi)發(fā)高效全能的單菌株逐漸轉(zhuǎn)化成多效的復(fù)合菌粉,其中較為出名的是益生菌劑VSL#3,該益生菌劑在治療腸易激綜合征[45]和潰瘍性結(jié)腸炎[46]的效果尤為突出。VSL#3還可改善食源性肝纖維化[47],可見(jiàn)益生菌劑在功效發(fā)揮上有更加寬廣的前景。Caballerofranco等[48]研究表明VSL#3可以誘導(dǎo)粘蛋白基因的表達(dá),并增強(qiáng)在結(jié)腸上皮細(xì)胞粘蛋白的分泌能力,并且乳桿菌最利于粘蛋白的分泌。而且,Madsen等[49]研究發(fā)現(xiàn),VSL#3中的一種或幾種菌屬能釋放一種可溶性蛋白質(zhì),提高腸上皮的物理屏障功能。此外,本實(shí)驗(yàn)室探討了益生菌劑(Probotic Preparations,PPrs)(含抗性糊精、菊粉、水蘇糖、麥芽糊精、植物乳桿菌LP45(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌La28(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌YMC1069(Lactobacilluscasei)、兩歧雙歧桿菌TMC3115(Bifidobacteriumbifidum)對(duì)肥胖大鼠脂代謝水平的影響,研究結(jié)果表明,PPrs可降低大鼠體重增長(zhǎng)速率,降低腎脂、睪脂指數(shù),控制肥胖狀態(tài),緩解肝臟脂肪變性和脂肪浸潤(rùn);重要的是,研究還證實(shí)該益生菌劑的攝入可顯著地下調(diào)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)mRNA表達(dá)量,上調(diào)膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)mRNA、低密度脂蛋白受體(LDL-R)mRNA、磷酸化AMP活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表達(dá)量,有效地調(diào)節(jié)脂代謝過(guò)程中內(nèi)源性膽固醇的合成,促進(jìn)膽固醇向膽汁酸代謝,改善肥胖大鼠的血清和肝臟脂代謝指標(biāo),從而達(dá)到降脂功能。可見(jiàn)益生菌劑在功效發(fā)揮上有更加寬廣的前景。因此,開(kāi)發(fā)新功效益生菌劑和研究益生菌劑發(fā)揮功效的生物學(xué)組分及機(jī)理具有重要意義。

4 目前尚存在的問(wèn)題

從益生菌施惠于人類(lèi)健康的角度出發(fā),有價(jià)值的研究與臨床上的功能表現(xiàn)均是主流的,但有研究表明在以潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型為對(duì)象,鼠李糖乳桿菌LGG可以緩解和預(yù)防IBD的復(fù)發(fā),但當(dāng)以LGG為輔助劑,在治療克羅恩病的兒童時(shí)并沒(méi)有緩解病情的復(fù)發(fā)[50]。這些結(jié)果表明了使用益生菌療法難以確定在胃腸道中益生菌的生物利用度的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。此外,因?yàn)樵谝恍┟庖吡δ艿拖耓51]或年齡很小[52]的患者中使用活菌會(huì)導(dǎo)致菌血癥的發(fā)生,所以,使用活益生菌要引起關(guān)注。還有,盡管研究已表明益生菌的有益功效歸功于益生菌的胞外蛋白,尚需要進(jìn)一步研究這些蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞)上的精確作用機(jī)制,這將有利于了解益生菌的代謝產(chǎn)物對(duì)人體產(chǎn)生的有益的影響,對(duì)胃腸功能紊亂、過(guò)敏和自身免疫性疾病的治療會(huì)有所幫助。綜上所述,雖然益生菌分泌的胞外蛋白與腸粘膜免疫的關(guān)系是非常密切的,但只有在分子水平上就胞外蛋白對(duì)免疫的影響進(jìn)行深入地研究,才能更有力地為胞外蛋白對(duì)機(jī)體健康的促進(jìn)作用提供佐證。

5 展望

分泌胞外蛋白的益生菌以及開(kāi)發(fā)一種相關(guān)的治療方案一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),胞外蛋白作為一種生物活性蛋白,較好的生物相容性和廣泛的生物學(xué)功能決定了其潛在的商業(yè)價(jià)值和開(kāi)發(fā)的可行性;并且,胞外蛋白可以作為功能性食品用于腸道疾病的生物免疫治療,為解決腸道疾病等常見(jiàn)、難愈疾病提供了一條新的、有效的途徑。因此,使用益生菌分泌的胞外蛋白來(lái)治療腸道相關(guān)疾病不失為一個(gè)較好的生物治療藥物方案,圍繞腸粘膜來(lái)研究某一種胞外蛋白對(duì)腸道疾病的影響將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。