傳染性蛋白的“負(fù)面”和“正面”（8）

朱欽士（美國南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

（上接2018年第10 期第10頁）

3.3 Prion 型的蛋白為休眠中的卵細(xì)胞儲(chǔ)存“嫁妝”卵細(xì)胞生成后，常要等待很長的時(shí)間才能被使用。 例如，人的卵細(xì)胞在女孩尚未出生時(shí)就形成了，要過十幾年，甚至幾十年后才成熟并被使用，在此之前卵細(xì)胞就一直處于休眠狀態(tài)。 一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，從線蟲、果蠅到脊椎動(dòng)物，卵細(xì)胞在形成的初期都會(huì)在細(xì)胞內(nèi)生成一個(gè)高密度的團(tuán)狀物，界限清晰而又沒有膜包裹，稱為“巴比阿尼體”（Balbiani body）。 它只存在于休眠期的卵細(xì)胞中，在卵細(xì)胞成熟時(shí)則消失。

檢查巴比阿尼體的組成成分，發(fā)現(xiàn)它含有RNA 和線粒體，被認(rèn)為是卵細(xì)胞在休眠狀態(tài)時(shí)儲(chǔ)存RNA 和線粒體的一種結(jié)構(gòu)，其作用是保護(hù)這些RNA 分子和線粒體，以便在卵細(xì)胞成熟受精后使用，有點(diǎn)像卵細(xì)胞的“嫁妝”或者“細(xì)軟”。

形成巴比阿尼體結(jié)構(gòu)的主要是一種蛋白質(zhì)，在斑馬魚中稱為“布基球蛋白”（Bucky ball），在青蛙卵中稱為Xvelo。它們的氨基端都含有能轉(zhuǎn)變?yōu)闄M向β-折疊，形成Prion 型結(jié)構(gòu)的功能域。它們形成的聚合物能抵抗高濃度的鹽溶液，在高溫下也不解離，且能結(jié)合硫黃素T，說明它們形成的聚合物具有Prion 型的結(jié)構(gòu)。

敲除斑馬魚的Bucky ball基因，或青蛙的Xvelo基因，卵細(xì)胞中就沒有巴比阿尼體形成，說明這些蛋白對(duì)于巴比阿尼體的形成是必要的。 用其他傳染性蛋白的Prion 功能域取代這2 種蛋白的Prion 功能域，這樣生成的蛋白雖然也能形成Prion 型的聚合物，但是卻不能形成巴比阿尼體，也不會(huì)進(jìn)入已經(jīng)形成的巴比阿尼體，說明形成巴比阿尼體的蛋白有自己特異的Prion 功能域，形成的聚合物也有自己的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，是其他的傳染性蛋白無法取代的。

3.4 Prion 型的蛋白形成“分子手銬”抑制質(zhì)粒DNA的復(fù)制 質(zhì)粒（plasmid）是染色體外的環(huán)狀DNA，主要存在于細(xì)菌中。 質(zhì)粒常帶有對(duì)細(xì)菌有益的基因，例如抵御抗菌素的基因。 質(zhì)粒能自我復(fù)制，且通過細(xì)菌之間由細(xì)絲形成的通道從一個(gè)細(xì)菌傳播至另一個(gè)細(xì)菌。

質(zhì)粒既然可自我復(fù)制，一個(gè)細(xì)菌也就可含有多個(gè)質(zhì)粒。細(xì)菌細(xì)胞中質(zhì)粒的數(shù)量是受控制的，既不能太少，也不能太多。 假單孢桿菌（Pseudomonas syringae）所含的質(zhì)粒稱為Psudomonas pPS10，其復(fù)制過程受一個(gè)蛋白R(shí)epA（replication protein A）的控制。RepA 既能讓質(zhì)粒復(fù)制，又不讓它過分復(fù)制，其機(jī)制就包括RepA 的Prion 形式。

RepA 蛋白由質(zhì)粒自身的DNA 編碼，由320個(gè)氨基酸殘基組成。 它含有2 個(gè)WH（winged helix）功能域WH1 和WH2，都由α－螺旋組成。 在α-螺旋結(jié)構(gòu)不變的情況下，一個(gè)RepA 分子上的WH1 域能與另一個(gè)RepA 分子上的WH1 域結(jié)合，形成RepA 的同質(zhì)二聚體。 WH2 域含有結(jié)合質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)DNA 序列的界面。 在RepA 二聚體通過WH2 域，結(jié)合到質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)時(shí)，二聚體解離，變成單體。 單體的RepA 能作為質(zhì)粒復(fù)制的啟動(dòng)蛋白，開始質(zhì)粒的復(fù)制。

RepA 蛋白單體與質(zhì)粒DNA 的結(jié)合也改變其WH1 功能域的結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闄M向的β-折疊，而WH2 域的結(jié)構(gòu)并不改變，仍然能結(jié)合DNA。 結(jié)合在2 個(gè)質(zhì)粒上的RepA 蛋白單體通過變?yōu)镻rion型結(jié)構(gòu)的WH1 功能域彼此結(jié)合，將質(zhì)粒復(fù)制完成后形成的2 個(gè)質(zhì)粒連在一起，像一根繩子拴住2個(gè)環(huán)，類似手銬的形狀，所以這種情形叫做將2 個(gè)質(zhì)?！颁D”起來（handcuffed）。 由于質(zhì)粒上的復(fù)制起始點(diǎn)被掩蓋，質(zhì)粒也不能進(jìn)一步被復(fù)制，因此這種手銬結(jié)構(gòu)能防止質(zhì)粒過度復(fù)制。 在質(zhì)粒需要再復(fù)制時(shí)，由3 個(gè)伴侶蛋白DnaK-DnaJ-GrpE 組成的復(fù)合物可對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行“解銬”，使質(zhì)?；謴?fù)“自由身”，再由RepA 進(jìn)行復(fù)制。

由WH1 功能域聚合成的結(jié)構(gòu)能結(jié)合剛果紅，并將其吸收峰紅移至500 nm，說明WH1 形成的聚合物確實(shí)具有Prion 型的結(jié)構(gòu)。

假單胞桿菌中RepA 蛋白的例子說明，有些蛋白分子可有2 種結(jié)構(gòu)和2 種功能狀態(tài)。在RepA分子通過WH1 功能域形成同質(zhì)二聚體時(shí)，分子還是由α－螺旋組成，分解為單體后也以α－螺旋的結(jié)構(gòu)執(zhí)行復(fù)制質(zhì)粒的工作。 WH1 功能域變?yōu)闄M向β-折疊后，RepA 分子也形成二聚體，但卻是通過β-折疊的結(jié)構(gòu)而結(jié)合，其功能不再是復(fù)制質(zhì)粒，而是將2 個(gè)質(zhì)粒連在一起，阻止質(zhì)粒復(fù)制。 在這里，Prion 型結(jié)構(gòu)的蛋白也有正常的生理功能，與引起疾病的傳染性蛋白變?yōu)镻rion 型結(jié)構(gòu)后喪失正常的生理功能不同。當(dāng)然Prion 型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)殺傷細(xì)胞也可以算作一種“功能”，但并非正常的生理功能。

RepA 蛋白的例子也說明，Prion 型結(jié)構(gòu)的蛋白，即使在細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)，也可以是沒有毒性的。下一個(gè)例子是Prion 型結(jié)構(gòu)的蛋白在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)，不但沒有毒性，還執(zhí)行重要的生理功能，這就是Pmel17 蛋白在黑色素形成中的作用。

3.5 Prion 型的Pmel17 蛋白作為黑色素合成的模板 黑色素（melanin）是生物合成的色素。 生物以酪氨酸為原料，經(jīng)過幾個(gè)氧化步驟，再進(jìn)行聚合，形成黑色素。 黑色素能吸收光線，包括可見光和紫外光。在皮膚中，位于上皮底層的黑色素細(xì)胞（melanocyte）合成黑色素，保護(hù)皮膚不受紫外線的傷害。 在眼中，黑色素由視網(wǎng)膜上的色素細(xì)胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）合成，其作用是遮光，避免光線從視網(wǎng)膜的后面進(jìn)入感光細(xì)胞。黑色素是在細(xì)胞的黑色素體（melanosome）中合成的。 黑色素體是細(xì)胞的一種細(xì)胞器，有膜包裹，膜內(nèi)環(huán)境為酸性（pH 值5.0 左右）。

1930年，在小鼠身上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因，它的突變會(huì)使小鼠合成黑色素的功能受到阻礙，小鼠身體為白色，因而被稱為“銀白基因”（silver gene）。 到了1991年，此基因被克隆，出人意料的是，這個(gè)基因與黑色素合成的化學(xué)反應(yīng)并沒有直接關(guān)系，而與黑色素體的形成有關(guān)，因?yàn)楸环Q為“前黑色素體蛋白”（premelanosome protein 17，Pmel17）。 用電鏡檢查黑色素體，發(fā)現(xiàn)其中有定向排列的纖維，黑色素就在這些纖維上生成，組成這些纖維的是Pmel17蛋白。

Pmel17 起初是一個(gè)膜蛋白，即通過蛋白質(zhì)的穿膜區(qū)段與黑色素體的膜相聯(lián)系，其主要部分伸入至黑色素體腔內(nèi)。 蛋白酶將Pmel17 蛋白切為2段： 仍然與膜聯(lián)系的Mβ 段和在腔內(nèi)的Mα 段。Mβ 段隨后被降解，而Mα 段則改變肽鏈折疊狀況，形成橫向β-折疊，聚合成為纖維。這些纖維能被剛果紅和硫黃素T 染色，證明它的確具有Prion型的結(jié)構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn)，Pmel17 纖維能作為模板，使得形成黑色素的前體分子能在其上聚合，最后形成黑色素。沒有Pmel17 蛋白，黑色素則無法形成。有趣的是，引起阿茨海默癥的Aβ 蛋白和引起帕金森氏癥的“α-突觸核蛋白”（α-synuclein，見文章第1部分）也能促使黑色素的形成，說明是Prion 型蛋白的結(jié)構(gòu)作為黑色素前體分子聚合的模板。

從本文的前2 個(gè)部分知道，Prion 型結(jié)構(gòu)的蛋白，特別是在低聚狀態(tài)時(shí)，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。 Peml17 蛋白就是在細(xì)胞內(nèi)聚合的，怎樣避免其毒性？生物采取的辦法一是隔離，即這個(gè)聚合過程在被膜包裹的黑色素體中發(fā)生；二是讓Pmel17聚合為Prion 型蛋白的過程盡可能快速，這樣低聚物就沒有時(shí)間對(duì)細(xì)胞造成傷害。 在大腸桿菌內(nèi)合成的Pmel17 的Mα 片段在高濃度（8 mol/L）的尿素（破壞蛋白結(jié)構(gòu)的分子）溶液中能以可溶狀態(tài)存在，但是一旦尿素溶液被稀釋，Mα 片段在數(shù)秒時(shí)間內(nèi)就聚集成纖維，比Aβ 蛋白片段聚合的速度快萬倍，這就防止了低聚合度的Pmel17 纖維與細(xì)胞內(nèi)容物接觸的機(jī)會(huì)。

合成黑色素的中間產(chǎn)物在化學(xué)性質(zhì)上也非?；顫?，還有可能經(jīng)由擴(kuò)散通過黑色素體的膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與其他分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而傷害細(xì)胞。讓這個(gè)聚合過程在黑色素體內(nèi)的Pmel17 纖維上發(fā)生，即可防止中間產(chǎn)物與細(xì)胞中的其他分子接觸，不至于傷害到細(xì)胞。 因此，Pmel17 纖維作為黑色素前體分子聚合的模板，具有催化和吸附的雙重意義。

3.6 Prion 型的牙釉蛋白作為牙釉形成時(shí)羥磷灰石晶體聚合的模板 牙釉（enamal）是牙齒最外面的部分，是生物材料中硬度最高的。成熟的牙釉主要由單晶體的羥磷灰石（hydroxyapatite）組成，這些晶體直徑約50 nm，長數(shù)百μm，所以成纖維狀。而在牙釉形成的過程中，Prion 型結(jié)構(gòu)的牙釉蛋白（amelogenin）對(duì)羥磷灰石的聚合起到模板作用。

在牙釉形成的初期，成釉細(xì)胞（amelocyte）分泌多種成釉蛋白，其中主要是牙釉蛋白。牙釉蛋白由175 個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基端是親脂的，能形成橫向β-折疊的結(jié)構(gòu)，而其羧基端含有若干帶電的側(cè)鏈，能與鈣離子和磷酸根結(jié)合。在鈣離子和磷酸根存在的環(huán)境中，氨基端會(huì)改變折疊狀態(tài)，形成Prion 型的結(jié)構(gòu)，能被剛果紅和硫黃素T 染色，光學(xué)測(cè)定也證實(shí)了其纖維的橫向β-折疊結(jié)構(gòu)。這樣形成的纖維就作為羥磷灰石晶體生長時(shí)的模板，且形成的纖維狀晶體的方向也與釉質(zhì)蛋白小纖維的方向一致。

在釉質(zhì)形成的過程中，成釉細(xì)胞也會(huì)分泌蛋白酶Kallikrein-4（KLK4），將牙釉蛋白逐漸降解，騰出空間使更多的羥磷灰石纖維生長，因此在成熟的牙釉中，牙釉蛋白已不復(fù)存在，其作用只是在牙釉形成的初期以Prion 小纖維的形式為羥磷灰石晶體的生長提供模板。

3.7 Prion 型的結(jié)構(gòu)可能作為植物中橡膠形成時(shí)的模板 橡膠是橡膠樹（Hevea brasiliensis）合成的，由異戊二烯單位組成的聚合物。在合成橡膠的細(xì)胞中，異戊二烯的聚合物存在于一種球形的“橡膠顆粒”（rubber partical）中。顆粒的內(nèi)部是異戊二烯的聚合物，表面是一層脂膜，脂膜內(nèi)有合成橡膠的酶，異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（prenyltrnasferase），它可以催化單體的異戊二烯二磷酸 （isoprenyl pyrophosphate）中的異戊二烯部分被加到聚合物上，使聚合物的鏈不斷伸長。 細(xì)胞質(zhì)中的異戊二烯二磷酸從橡膠顆粒的表面與轉(zhuǎn)移酶接觸，被添加到顆粒內(nèi)的聚合物上，使得顆粒不斷長大。

研究發(fā)現(xiàn)，異戊二烯轉(zhuǎn)移酶并不能單獨(dú)催化此反應(yīng)，而是需要膜中的另一個(gè)稱為“橡膠延長因子”（rubber elongation factor，REF）的蛋白。 從橡膠顆粒上去除REF，會(huì)使異戊二烯轉(zhuǎn)移酶無法將異戊二烯單位添加至聚合物上。

有趣的是，REF 能聚合，形成Prion 型的結(jié)構(gòu)。光譜測(cè)定，包括圓二色性測(cè)定，表明單體的REF蛋白主要含有α-螺旋，而聚合狀態(tài)的REF 含有β-折疊。 這個(gè)聚合物能被剛果紅染色，X-射線衍射實(shí)驗(yàn)證實(shí)了橫向的β-折疊結(jié)構(gòu)。 由于REF 并不直接參與化學(xué)反應(yīng)，REF 蛋白對(duì)橡膠合成的必要性有可能像黑色素的合成那樣，以其Prion 結(jié)構(gòu)作為異戊二烯形成聚合物時(shí)的模板。

（待續(xù)）