莞香葉及成茶中黃酮類化合物的提取及其對亞硝酸鹽的清除率研究*

羅翔宇 劉朝暉** 仇楚惠 吳 豐 倪進(jìn)東 李林秋，3***

（1 東莞市東莞中學(xué)松山湖學(xué)校 廣東東莞 523808 2 廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 廣東東莞 523808 3 東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東東莞 523808）

莞香茶是東莞三大土特產(chǎn)之一，由莞香的新鮮葉子經(jīng)密封發(fā)酵、殺青、烘干、溫茶等處理制作而成［1］，茶水顏色為淡黃，口感醇厚，具有利尿解暑調(diào)節(jié)血糖的功效，為當(dāng)?shù)厝怂矏邸?莞香［Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg］，也稱白木香，為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬植物。研究表明，莞香葉富含黃酮類化合物［2］。 黃酮類化合物具有良好的亞硝酸鹽清除能力［3］，但是莞香葉制作成莞香茶之后黃酮含量及其清除亞硝酸鹽的能力是否受到影響至今尚未見到報(bào)道。

本文以莞香茶成茶（包括“劉東曉”“香佬李”和“和加仁”3 個不同品牌）和新鮮的莞香葉為原料，用乙醇提取其中的黃酮類化合物，并比較莞香葉發(fā)酵前后的黃酮得率及其對亞硝酸鹽的清除效率。 為優(yōu)化提取條件，研究了液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間對黃酮得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 莞香葉采自當(dāng)?shù)剌赶惴N植基地，由澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張志峰博士鑒定，3 個品牌莞香茶均購自當(dāng)?shù)厥袌?，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%），亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（由天津市津科精細(xì)化工研究所提供，純度98%），九水合硝酸鋁晶體 （上海麥克林生化科技有限公司），氫氧化鈉，無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠），對氨基苯磺酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠），鹽酸萘乙二胺（成都金山化學(xué)試劑有限公司）。 除標(biāo)準(zhǔn)品外，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 超聲波清洗機(jī)（購自歌能公司），UV-1800 型紫外可見分光光度計(jì)（購自美譜達(dá)儀器公司），中藥材粉碎機(jī)（伊貝諾公司，JB-05），不銹鋼篩子（晨興，60 目）。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 將莞香茶和新鮮茶葉清洗干凈，置烘箱于40 ℃烘干，然后用粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩，倒入密封袋于干燥器中存放。

1.3.2 測定黃酮類化合物的含量 黃酮類化合物含量的測定在硝酸鋁顯色法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)［4］，具體方法為：用移液器移取0.25 mL 提取液于10 mL 具塞比色管中，用蒸餾水定容至5.0 mL。 加入0.5 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，再加入0.5 mL 的10 %硝酸鋁溶液，混勻靜置6 min，最后加入4 mL 的1 moL/L 氫氧化鈉溶液，搖勻后靜置15 min。 同時設(shè)置空白對照，移取蒸餾水5 mL，其他試劑同上。 最后以空白對照調(diào)為0，于510 nm 波長下測量樣品液吸光度。

1.3.3 莞香葉黃酮類化合物得率的測定

1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程的建立。 先用60 %的乙醇溶液配制0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。 再用移液器分別移取以上的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于具塞比色管中，用蒸餾水定容至5.0 mL，然后按1.3.2 方法操作。 以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為自變量，吸光度為因變量，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如下標(biāo)準(zhǔn)方程：y=11.667x-0.01419（R2=0.9990），線性檢測范圍為0.02～0.10 mg/mL。

2）黃酮類化合物得率計(jì)算公式。 測定提取得到的黃酮溶液的吸光度，按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中，A 為樣品液吸光度，K 為提取液液料比，40 為1.3.2 操作中的稀釋倍數(shù)。

1.3.4 莞香茶葉黃酮類化合物的提取 稱取樣品茶粉末1 g，加入20 mL 的60%乙醇［液料比為20∶1（mL∶g）］，于60 ℃超聲3.5 h，靜置后取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，濾液按1.3.3.2）測定吸光度和計(jì)算得率。

1.3.5 黃酮提取液對亞硝硝酸鹽的清除能力

1）亞硝酸鹽清除率的測定。 亞硝酸鹽清除率的研究采用的是李佩艷等［5］的方法并稍做改進(jìn)。 用移液器移取2 份1 mL 亞硝酸鈉溶液置于10 mL具塞比色管中，其中一份加入0.25 mL 莞香茶提取液，另一份作空白對照。 分別往比色管中加入pH=3 的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液1 mL，37℃水浴30 min 后取出。 同時以蒸餾水代替亞硝酸鈉溶液作為本底色參比液。 然后分別向3 份試樣中加入1 mL 的0.4%對氨基苯磺酸，搖勻、靜置3 min，然后再分別加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.5 mL，蒸餾水定容至10 mL，靜置15 min，于波長545 nm處測吸光度。

2）不同品牌莞香茶黃酮的亞硝酸鹽清除效率測定。 分別稱取3 種不同品牌的莞香茶各1 g，按1.3.4 方法提取黃酮類化合物，再測定其吸光度，最后按下式計(jì)算清除效率［6］：

式中，M0為空白對照的吸光度，MX為提取液的吸光度，M本為本底色參比液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)以“香佬李”為檢測對象，優(yōu)化莞香茶黃酮的提取工藝。

2.1 乙醇濃度對黃酮類化合物得率的影響考察了乙醇濃度在40%～80%范圍內(nèi)對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1 所示。 當(dāng)乙醇濃度為40%時，黃酮得率為1.89%。隨著乙醇濃度的增大，得率逐漸增加，并于60%處達(dá)到峰值（2.68%）。 但是，當(dāng)濃度繼續(xù)增大時，黃酮得率逐漸減小。導(dǎo)致該趨勢的原因可能是黃酮類化合物易溶于乙醇等有機(jī)溶劑［7］，所以，乙醇濃度增大有利于莞香茶中黃酮的溶出。但是乙醇濃度過大，其他有機(jī)化合物的溶出也隨之增加，與黃酮類化合物的溶出產(chǎn)生競爭關(guān)系，導(dǎo)致黃酮類化合物占比下降。

圖1 乙醇濃度對得率的影響

2.2 提取時間對黃酮類化合物得率的影響 考察了提取時間在0.5～4.0 h 范圍內(nèi)對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2 所示。 當(dāng)提取時間為0.5 h 時，得率為1.69%，隨著提取時間的增加，黃酮得率逐漸增加并在3.5 h 達(dá)到峰值（2.68%）。當(dāng)提取時間繼續(xù)增加時，得率也隨之降低。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是：提取時間小于3.5 h 時，黃酮類化合物的溶出不充分；提取時間大于3.5 h 時，提取時間過長，一些熱穩(wěn)定性較差的黃酮類物質(zhì)受熱分解，從而導(dǎo)致得率下降。

圖2 提取時間對得率的影響

2.3 提取溫度對黃酮類化合物得率的影響 在40～80℃范圍內(nèi)，溫度對黃酮得率影響如圖3 所示。 當(dāng)溫度為40℃時，得率為1.84%。 隨著溫度的升高，得率逐漸升高，在60℃達(dá)到最大值2.68%后，得率又隨著溫度的升高而下降。 出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因也許是當(dāng)提取溫度小于60℃時，茶葉結(jié)構(gòu)的破壞程度隨溫度升高而增大，黃酮類化合物的溶出量增大；提取溫度高于60℃時，黃酮類化合物中熱穩(wěn)定性較差的物質(zhì)的分解導(dǎo)致得率的下降。

圖3 溫度對得率的影響

2.4 液料比對黃酮類化合物得率的影響 考察了液料比在10∶1 至30∶1（mL∶g）范圍內(nèi)對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4 所示。 當(dāng)液料比為10∶1 時，黃酮得率為2.39%。 在液料比20∶1 之前，得率隨液料比升高而升高，在20∶1 時達(dá)到峰值（2.68%）。在20∶1 之后，得率隨液料比升高而降低。 出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是液料比小于20∶1 時，溶劑體積較小，黃酮類化合物尚未溶解完全；當(dāng)液料比達(dá)到20∶1 時，黃酮類化合物的溶解基本達(dá)到完全，當(dāng)液料比大于20∶1（mL∶g）時，黃酮類化合物的濃度將降低，因此，20∶1（mL∶g）為最優(yōu)液料比。

圖4 液料比對得率的影響

綜上所述，莞香茶黃酮的最佳提取條件為：提取溫度60℃，提取時間3.5 h，乙醇濃度60%，液料比20∶1（mL∶g），在最佳條件下提取黃酮類化合物的得率為2.68%。

2.5 莞香茶與新鮮莞香葉中黃酮類化合物對亞硝酸鹽清除能力的比較 比較了新鮮莞香葉與3 種品牌莞香茶黃酮類化合物的得率及其對亞硝酸鹽的清除能力，結(jié)果如表1 所示。 在最優(yōu)條件下，新鮮莞香葉中黃酮的得率為2.44%。 3 個品牌莞香成茶中，“和加仁”和“香佬李”的黃酮得率較新鮮莞香葉分別上升9.01%和9.84%，而“劉東曉”不升反降，降低3.69%。 這可能與不同品牌莞香茶的具體制作工藝不同有關(guān)。 對于清除亞硝酸鹽的能力來說，新鮮莞香葉的黃酮提取物的效率最高，為77.88%，而3 種莞香茶提取物的清除亞硝酸的能力均有所下降：“和加仁”下降6%，“香佬李”下降8.76%，“劉東曉”下降13%。 總的來說，莞香茶中黃酮得率與新鮮莞香葉相比有上升也有下降，但下降幅度均不超過10%；3 個品牌中黃酮對亞硝酸鹽的清除能力也均有下降，但下降幅度不超過13%。

表1 不同品牌莞香茶黃酮得率及其對亞硝酸鹽清除效率的比較（n=3）

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化莞香茶中黃酮類化合物的提取條件，建立了莞香茶中黃酮類化合物的提取工藝并在最優(yōu)條件下提取了新鮮莞香葉和3 種品牌莞香茶中的黃酮類化合物，結(jié)果表明，莞香茶的制作工藝對黃酮類化合物及其亞硝酸鹽清除率均無明顯影響。 莞香葉發(fā)酵成為莞香茶后，口感醇厚、香味濃郁、性質(zhì)溫和、對胃部刺激減小。 與此同時，又保留了新鮮茶葉中的高黃酮含量的性質(zhì)及其優(yōu)良的清除亞硝酸鹽的能力。因此，莞香葉制成莞香茶后既迎合了消費(fèi)者對口味的追求又保證了其天然的功效，具有一定的推廣價值和市場前景。