結(jié)合磁共振成像和腦機接口的新型在體生物電子鼻的研究

張 斌 吳 哲 何宏建 丁秋萍 秦 臻 高克強 鐘健暉 王 平#

(浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院生物傳感器國家專業(yè)實驗室, 生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室, 腦影像科學技術(shù)中心， 杭州 310007)

引言

氣體檢測在食品安全、緝毒搜爆、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有重要的意義[1]。哺乳動物的嗅覺系統(tǒng)在尋找食物或配偶，躲避天敵等方面具有重要作用，其具有高靈敏度和高特異性，是一種十分適合氣味檢測和識別的氣體傳感器。哺乳動物嗅覺系統(tǒng)包括嗅上皮、嗅球和嗅皮層。氣體分子與嗅上皮中的嗅感覺神經(jīng)元(olfactory sensory neurons, OSNs)上的受體結(jié)合，產(chǎn)生動作電位[2]，并沿嗅感覺神經(jīng)元的軸突傳導到嗅球中嗅小球中的僧帽/叢狀(M/T)細胞[3]。嗅覺信息在嗅球中被整合和編碼[4]，并最終在嗅皮層中形成嗅感覺。人工電子鼻模仿這一機制，并在過去的幾十年中應(yīng)用于許多領(lǐng)域[5-8]。然而，電子鼻的性能與動物嗅覺系統(tǒng)相比相去甚遠，因而出現(xiàn)了基于腦機接口和神經(jīng)解碼技術(shù)的在體生物電子鼻。該方法通過在嗅球中植入電極并記錄電生理信號，可以得到比電子鼻更多的氣味信息[9-11]。

盡管在體生物電子鼻能得到更多的氣味信息，但目前電極的植入位置主要依靠腦圖譜定位和實驗經(jīng)驗，其成功率不高，很難直接找到對某一指定氣體敏感的神經(jīng)元或區(qū)域。目前國內(nèi)外已有嗅覺圖譜方面的研究，主要采用2-脫氧葡萄糖(2DG)攝取量制圖[12-13]和功能磁共振成像(fMRI如血氧水平依賴(BOLD)成像技術(shù))[14-15]。2DG法需要對嗅球進行切片、X光成像等處理，過程復(fù)雜、工作量大，同一只動物無法進行多次實驗[12-13]；BOLD成像克服了以上缺點，但其檢測的是激活腦區(qū)及其周圍區(qū)域血液動力學變化，只能間接反映神經(jīng)元活動，且功能磁共振激活區(qū)域與真實的活動區(qū)域是否完全一致在學術(shù)界尚有爭論。相比上述兩種方法，錳離子增強磁共振成像技術(shù)(MEMRI)是一種更合適的技術(shù)[16]。

磁共振成像(MRI)是一種無創(chuàng)的成像技術(shù)，且無CT和X光等成像技術(shù)中存在的有害輻射，不會對檢測對象造成傷害[17]。因此，MRI目前廣泛應(yīng)用于臨床診斷和基礎(chǔ)研究，尤其是在腦功能成像方面，是一種極其重要的工具[18]。錳離子增強磁共振通過在生物體內(nèi)引入外源性的錳離子(Mn2+)作為磁共振對比劑來在體、直接、動態(tài)等研究腦區(qū)的功能活動[19]。MEMRI的實現(xiàn)基于Mn2+的兩個特點：Mn2+是一種鈣離子(Ca2+)類似物，在嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)中，當嗅感覺神經(jīng)元與氣體分子結(jié)合，鈣離子通道打開，Mn2+會像Ca2+一樣通過Ca2+通道進入嗅覺系統(tǒng)，并在經(jīng)過的神經(jīng)細胞中沉積，需要數(shù)天甚至更久才會被完全代謝[20]；Mn2+是一種順磁性很強的物質(zhì)，會縮短其周圍水質(zhì)子的T1和T2弛豫時間[21]。

本研究基于腦機接口和錳離子增強磁共振成像技術(shù)提出了一種新的氣體檢測方法，通過在大鼠單側(cè)鼻腔內(nèi)滴入MnCl2溶液并給予氣味刺激，掃描磁共振圖像，并根據(jù)圖像確定嗅球中氣體特異性區(qū)域，在該區(qū)域植入微絲陣列電極，記錄和分析嗅覺電生理信號進行氣味識別。該方法對正丁酸和乙酸異戊酯具有很低的檢測下限。

1 材料和方法

1.1 動物準備與氣體刺激

正丁酸、辛醇、乙酸異戊酯分別具有典型的官能團，有特殊的氣味并且其氣味有一定的差異，是嗅覺研究中較為常用的物質(zhì)。因此在本研究中選取了這三種物質(zhì)作為刺激氣體。氣體由無色無味的礦物油進行稀釋，濃度為10-1～10-9mol/L，并儲存在密封玻璃瓶中。

本實驗選取健康的雄性SD大鼠(200～250 g)，從腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，用移液槍在大鼠右側(cè)鼻腔滴入20 μL MnCl2溶液(400 mmol/L)，為使MnCl2溶液分布較均勻，溶液分4次滴入右側(cè)鼻腔的不同深度，且始終保持大鼠處于仰臥位以保持溶液與嗅上皮接觸[22]。將大鼠放在一個密封的長方形有機玻璃箱中央，在靠近大鼠鼻子處和籠子4個角落均放置一個小玻璃皿，每個玻璃皿中滴有0.1 mL刺激氣體溶液(0.1 mol/L)，大鼠在箱子中始終保持仰臥位。10 min后大鼠被固定在磁共振兼容的大鼠適配器上并放入核磁共振儀中進行MRI掃描。

1.2 MEMRI數(shù)據(jù)采集

MEMRI數(shù)據(jù)采集在西門子MAGNETOM Prisma 3T磁共振上進行，采用4 cm單通道環(huán)形線圈緊貼大鼠鼻腔外側(cè)上方的方式進行掃描。使用3D FISP序列，其具體參數(shù)如下：TR 20 ms，TE 5.2 ms，圖像大小256像素×153像素×22像素，空間分辨率0.195 mm×0.195 mm×0.5 mm，激發(fā)角30°。考慮到體素體積較小，因此采用掃描10次平均的方式以增加信噪比，每次掃描時間為11 min 10 s。

本實驗共對10只大鼠(4只使用乙酸異戊酯、4只使用正丁酸、2只使用辛醇)進行了氣味刺激下的MEMRI掃描，其中辛醇刺激的一只大鼠在掃描期間死亡。每只大鼠在滴入氯化錳溶液之前，以及滴入氯化錳溶液之后的0.5、2.5和 6 h分別進行了掃描。掃描分別在大鼠的橫斷位與冠狀面進行。掃描過程中對大鼠一直進行氣味刺激。

1.3 嗅覺電生理信號采集

為了同步記錄多個嗅球區(qū)域的神經(jīng)元信號，本研究設(shè)計制作了16通道微絲陣列電極。將16根直徑35 μm的鎳鉻合金絲(AM system，WA，#762000)兩兩旋成一股，并整齊排列在PCB板兩面。雙股電極絲的間距為100～200 μm。電極上留有轉(zhuǎn)接口可與神經(jīng)信號采集系統(tǒng)相連。本研究采用Plexon公司的OmniPlex神經(jīng)信號采集系統(tǒng)記錄嗅覺電生理信號，該系統(tǒng)將信號放大濾波后存儲在計算機中，其采樣頻率為40 kHz，放大倍數(shù)為1 000倍，濾波范圍為0.5 Hz～8 kHz。

大鼠從磁共振掃描中恢復(fù)后，從腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)再次麻醉，并固定在立體定位儀上。手術(shù)在無菌條件下進行，利用開顱手術(shù)移除嗅球上方的頭骨，暴露出嗅球背部，用液壓微推進器將電極緩慢植入到嗅球僧帽細胞層，具體位置由MEMRI實驗結(jié)果確定。用牙科水泥將電極進行包埋固定。

大鼠休養(yǎng)一周后進行氣體檢測實驗。從腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后至于行為箱(長30 cm，寬25 cm，高30 cm)中，頭部電極與OmniPlex系統(tǒng)前置探頭相連，將滴有0.1 mL氣體溶液的濾紙放于大鼠鼻腔旁，停留5 s，記錄氣體刺激前5 s和刺激后10 s內(nèi)的電生理信號。在開始下一次氣體刺激前向行為箱中通入新鮮空氣并等待2 min以上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

磁共振掃描圖像主要由RadiAnt DICOM Viewer和MRIcroN查看，并借助MATLAB和NIfTI工具包進行數(shù)據(jù)分析。

電生理數(shù)據(jù)由Matlab進行離線處理，利用巴特沃斯數(shù)字帶通濾波器分別提取出spike信號(200～400 Hz)和局部場電位(local field potential，LFP)信號(1～100 Hz)。采用雙閾值法可以提取單個神經(jīng)元的spike鋒電位，計算各個時間窗內(nèi)的發(fā)放頻率，并計算氣味刺激前后的spike發(fā)放頻率差值。LFP是局部場電位，是記錄位點周圍神經(jīng)元電信號的綜合響應(yīng)，本研究對LFP進行了頻譜分析。

2 結(jié)果

2.1 Mn2+在嗅覺系統(tǒng)中的傳遞

圖1中給出了大鼠右側(cè)鼻腔中滴入Mn2+并給予乙酸異戊酯氣味刺激后的部分磁共振掃描結(jié)果，圖中從上至下分別為嗅上皮所在的其中一個層面的冠狀位MRI圖像，嗅球所在的其中一個層面的冠狀位MRI圖像，以及嗅球所在的其中一個層面的橫斷位MRI圖像，從左至右分別為尚未滴入錳離子溶液與滴入后0.5、2.5和6 h后的MRI圖像。如圖1所示，滴了Mn2+的右側(cè)鼻腔中，錳離子逐漸進入嗅覺系統(tǒng)，并明顯增強了磁共振信號。在實驗剛開始時，Mn2+尚未進入嗅覺系統(tǒng)，嗅上皮和嗅球左右兩部分無明顯區(qū)別；滴入Mn2+0.5 h后，大鼠右側(cè)嗅上皮中部分區(qū)域信號相比左側(cè)明顯更強(圖像更亮意味著信號更強)，但嗅球中并未看到明顯變化。2.5 h后，右側(cè)的嗅上皮和嗅球均有部分區(qū)域比右側(cè)更亮，即Mn2+已經(jīng)進入了嗅球并且在嗅上皮中仍有殘留。6 h后，右側(cè)的嗅上皮仍比左側(cè)更亮，而嗅球中變亮的區(qū)域相比2.5 h時的區(qū)域明顯變大(無論是橫斷位還是冠狀位圖像)，說明Mn2+在不斷地進入嗅球的其他區(qū)域。

為了解Mn2+在嗅球中特定部位的濃度變化，筆者測量了在乙酸異戊酯刺激實驗中4只大鼠同一位置(圖1紅色黑色所指的黑色圓點處)的MRI信號強度，并以對側(cè)嗅球?qū)ΨQ位置的信號強度作為基準值得到相比強度，以盡量消除大鼠個體差異性等造成的干擾。如圖2所示，無論是該點的信號絕對強度還是相對強度，均呈明顯的上升趨勢，說明該點的Mn2+濃度在不斷增長。

2.2 不同氣味誘發(fā)嗅球不同區(qū)域響應(yīng)

當大鼠受到不同的氣體刺激時，由于對氣體分子有響應(yīng)的嗅感覺神經(jīng)元不同，因此Mn2+會進入不同的嗅感覺神經(jīng)元，并最終進入嗅球的不同區(qū)域。圖3 給出了4只大鼠在氣味刺激4 h后嗅球同一層的MRI圖像，其中大鼠A和B的刺激氣體為正丁酸，大鼠C刺激氣體為辛醇，大鼠D的刺激氣體為乙酸異戊酯。

如圖3所示，被3種不同氣體刺激的大鼠的嗅球發(fā)亮區(qū)域有明顯區(qū)別，而兩只被正丁酸刺激的大鼠的嗅球發(fā)亮區(qū)域較相似：對正丁酸有響應(yīng)的區(qū)域集中在嗅球的腹外側(cè)邊緣，對辛醇有響應(yīng)的區(qū)域集中在嗅球腹側(cè)，對乙酸異戊酯有響應(yīng)的區(qū)域集中在嗅球的外側(cè)。

圖1 大鼠右側(cè)鼻腔注射Mn2+并用乙酸異戊酯刺激后大鼠嗅覺系統(tǒng)MRI圖像隨時間的變化(每行從左至右分別為0、0.5、 2.5、 6 h)。(a)嗅上皮(冠狀位)；(b)嗅球(冠狀位)，黑色箭頭所指的黑點為圖2中采集數(shù)據(jù)的位置；(c)嗅球(橫斷位)Fig.1 The MRIs of rat′s olfactory system changed over time after Mn2+ administration and isoamyl acetate stimulation (From the left to the right in each row, the time evolution is 0, 0.5, 2.5 and 6 h after Mn2+ administration). (a) Olfactory epithelium (coronal); (b) Olfactory bulb (coronal). The black dots pointed by the arrows represent where data in Fig.2 are collected; (c) Olfactory bulb (transverse)

圖2 乙酸異戊酯刺激下嗅球某一位置MRI信號強度隨時間的變化。(a)絕對信號強度；(b)相對信號強度Fig.2 MRI signals at the same position of rats’ OBs along time after isoamyl acetate stimulation. (a)Absolute signal amplitude; (b) Relative signal amplitude

圖3 不同氣味刺激使Mn2+在大鼠嗅球的不同區(qū)域累積(圖像中越亮的區(qū)域說明Mn2+更多)。(a)大鼠A(正丁酸)；(b)大鼠B(正丁酸)；(c)大鼠C(辛醇)；(d)大鼠D(乙酸異戊酯)Fig.3 Mn2+ accumulation regions varied when rats were stimulated by different odors (Brighter represents more Mn2+ accumulation). (a) Rat A (n-butyric acid); (b) Rat B (n-butyric acid); (c) Rat C (octanol); (d) Rat D (isoamyl acetate)

2.3 電生理信號對氣味刺激的響應(yīng)

圖5 Spike信號分析(虛線為氣體刺激起始時刻)。(a)嗅球外側(cè)單個通道在乙酸異戊酯刺激前后的spike信號；(b)該段信號對應(yīng)的不同時間窗內(nèi)的發(fā)放頻率；(c)該段信號所有spike信號的疊加Fig.5 Analysis of spike signal (The dotted line represents the start of odor stimulation). (a)Spike signal recorded by one channel in the lateral OB before and after isoamyl acetate stimulation; (b)Spike firing frequency in different time bins; (c)All spike waveforms overlapping.

根據(jù)MEMRI的實驗結(jié)果可知，不同氣味在嗅球中引起響應(yīng)的區(qū)域不同，因此在大鼠嗅球不同的位置(嗅球腹外側(cè)：Bregma點前8.5 mm，骨縫線右側(cè)1.5 mm，深度2.0 mm；嗅球外側(cè)：Bregma點前8.5 mm，骨縫線右側(cè)1.0 mm，深度4.0 mm)分別植入電極并記錄電生理信號。如圖4所示，嗅球腹外側(cè)的LFP信號在受到正丁酸氣味刺激后會發(fā)生變化(見圖4(a))，β波(15～30 Hz)在氣味刺激后幅值增大(見圖4(b))，對比氣味刺激前后的頻譜圖發(fā)現(xiàn)，在15～40 Hz頻段信號明顯增強(見圖4(c))。但用乙酸異戊酯氣味刺激該區(qū)域的LFP并沒有明顯變化(見圖4(d)～(f))。

嗅球外側(cè)的LFP信號在受到乙酸異戊酯氣味刺激后也會發(fā)生變化(見圖4(g))，β波(15～30 Hz)在氣味刺激后幅值增大(見圖4(h))，對比氣味刺激前后的頻譜圖發(fā)現(xiàn)，在15～30 Hz頻段信號明顯增強，但用正丁酸氣味刺激該區(qū)域的LFP并沒有明顯變化(圖中未給出)。

每個植入到大鼠嗅球中的電極有16個通道，其中通常能在幾個通道的信號中檢測到較為穩(wěn)定和高信噪比的spike鋒電位。當大鼠受到氣味刺激時，某些通道的spike信號也會發(fā)生變化，其發(fā)放頻率會增加或減少。圖5(a)給出了嗅球外側(cè)一個通道在乙酸異戊酯刺激實驗中記錄的信號。圖5(b)為該段信號不同時間窗內(nèi)的發(fā)放頻率，在給予氣味刺激后，發(fā)放頻率明顯升高。圖5(c)為該段時間內(nèi)所有spike鋒電位的疊加。圖6給出了植入在嗅球外側(cè)的電極在乙酸異戊酯刺激實驗中記錄到spike的6個通道在乙酸異戊酯刺激前后平均發(fā)放頻率的變化，可以看出某些通道的發(fā)放頻率增加了，某些通道的發(fā)放頻率降低了，而某些通道沒有明顯變化。某些通道在氣體刺激后不僅會改變發(fā)放頻率，而且其頻率變化與刺激氣體的濃度呈現(xiàn)較好的線性(見圖7)。根據(jù)最低檢測限的定義，這兩個通道對乙酸異戊酯和正丁酸的檢測下限分別為0.033 0 和0.007 2 μmol/mL。

圖4 嗅球LFP信號分析(左側(cè)圖中的虛線為氣體刺激開始時刻)。(a)～(c)正丁酸刺激前后嗅球腹外側(cè)LFP信號、β波信號和刺激前后的LFP頻譜圖；(d)～(f)乙酸異戊酯刺激前后嗅球腹外側(cè)LFP信號、β波信號和刺激前后的LFP頻譜圖；(g)～(i)乙酸異戊酯刺激前后嗅球外側(cè)LFP信號、β波信號和刺激前后的LFP頻譜圖Fig.4 Analysis of LFP signals in OBs (In the left plots, the dotted line represents the start of odor stimulations). (a)～(c)LFP and β wave in the ventral lateral OB and the spectrogram of LFP before and after n-butyric acid stimulation; (d)～(f)LFP and β wave in the ventral lateral OB and the spectrogram of LFP before and after isoamyl acetate stimulation; (g)～(i)LFP and β wave in the lateral OB and the spectrogram of LFP before and after isoamyl acetate stimulation.

圖6 植入在嗅球外側(cè)的電極中的6個通道在乙酸異戊酯刺激實驗中的頻率變化Fig.6 The 6 channels of the electrode implanted in the lateral OB had different firing frequency variations in the isoamyl acetate stimulation trail

圖7 頻率響應(yīng)-濃度曲線。(a)乙酸異戊酯；(b)正丁酸Fig.7 The responsive firing rate curve to different concentrations of odors. (a)Isoamyl acetate; (b)N-butyric acid

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+在嗅上皮和嗅球中的傳遞速度有較大區(qū)別。在大鼠鼻腔滴入Mn2+并進行氣味激10 min后，立即掃描MRI圖像即可在嗅上皮中觀察到Mn2+的存在，大約1 h后可以在嗅球前側(cè)觀察到Mn2+的沉積。而Mn2+在嗅球中的傳遞速度要慢得多，如圖1中嗅球冠狀位和橫斷位MRI圖像所示，Mn2+從2.5～6.0 h之間傳遞的距離很小。這與文獻中的結(jié)果類似[15]。人們猜測，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是嗅球中的結(jié)構(gòu)相比嗅上皮到嗅球的神經(jīng)投射更復(fù)雜，嗅球中的突觸更多，神經(jīng)元之間的連接更復(fù)雜，而Mn2+在突觸的傳播速度可能會受到限制，因而影響了其在嗅球內(nèi)的傳播速度。

本研究利用MEMRI顯示了嗅覺通路的一部分，Mn2+的沉積路徑可視為嗅覺信號的傳導路徑。從MRI圖像可以看出，單種氣味分子會激活嗅上皮上的大片嗅感覺神經(jīng)元，并投射到嗅球中的某個區(qū)域，而不是只與一種神經(jīng)元結(jié)合并投射到單個嗅小球。實際上，嗅感覺神經(jīng)元與氣味分子之間存在交叉響應(yīng)，即一種氣味分子可以激活多種神經(jīng)元，而一種神經(jīng)元會對多種氣體分子產(chǎn)生響應(yīng)[3,11]。嗅上皮中同一種嗅感覺神經(jīng)元會投射到同一個嗅小球中。因此，單種氣味分子也會激活多個嗅小球，即在MRI圖像中嗅球會有某一片區(qū)域發(fā)亮(見圖1)；同一個嗅小球會被多種氣體激活，即MRI圖像中嗅球發(fā)亮區(qū)域會有重疊(見圖3)。

本研究在人體3T磁共振掃描儀上掃描大鼠，對于序列可實現(xiàn)的空間分辨率和信噪比具有較高要求?；趦煞矫嬉蛩氐木C合考慮，并未采用錳離子增強MRI常用的T1W SE或IR-SE序列，而是選用了3D FISP序列。該序列產(chǎn)生的是T1/T2加權(quán)圖像，即具有較小T1/T2比值的組織將產(chǎn)生更大信號。

在MEMRI實驗中對某種有響應(yīng)的區(qū)域的LFP對響應(yīng)的氣體也會有響應(yīng)，該氣體刺激會使LFP信號中的β波能量增強，而其他氣體的刺激并無此現(xiàn)象(見圖4)，證明電生理方法與MEMRI測得的響應(yīng)區(qū)域相同(見圖5)。Spike信號對氣味刺激也會有響應(yīng)，且不同的通道對同一種氣味的響應(yīng)不同(見圖6)。利用某些通道spike發(fā)放頻率變化對特定氣體的濃度的響應(yīng)，可以檢測到濃度較低的氣體分子(見圖7)，且檢測限比傳統(tǒng)電子鼻更低[23]，能較好發(fā)揮哺乳動物嗅覺高靈敏度的優(yōu)勢。

本研究同時存在一定的局限性，如MRI圖像的分辨率(195 μm)大于嗅小球的尺寸(50～100 μm)，而嗅小球是嗅球中的功能單元，因此本研究尚不能發(fā)現(xiàn)刺激氣味與嗅小球之間的響應(yīng)關(guān)系，本課題組正在嘗試使用更高磁場強度的磁共振儀器，得到分辨率和圖像質(zhì)量都更高MRI圖像。

4 結(jié)論

本研究利用錳離子增強磁共振成像技術(shù)研究了嗅覺信息的傳導通路，證明了嗅覺的交叉響應(yīng)機理。通過磁共振圖像標記了嗅球中的對特定氣體敏感的區(qū)域，輔助電生理定位，在相應(yīng)的嗅球區(qū)域植入微絲陣列電極。實驗結(jié)果表明，嗅覺信號中的LFP和spike信號都對氣體產(chǎn)生響應(yīng)。據(jù)此，設(shè)計了新型的高特異性、低檢測下限的氣體檢測系統(tǒng)。本研究是第一個利用磁共振輔助定位的生物電子鼻，在爆炸物搜索、食品安全等方面將有廣闊的前景。

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