體外構(gòu)建新型骨組織工程三維復(fù)合體

麥麥提艾力·阿不力克木 王騰飛 陶 穎 王曉帥 徐磊磊 宋興華

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科中心，烏魯木齊 830054)

引言

中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，2015年全國(guó)發(fā)病率僅次于印度和印度尼西亞，發(fā)病絕對(duì)數(shù)量占全球結(jié)核病人數(shù)量的9.6%[1]。在所有結(jié)核患者中，10%～15%是肺外結(jié)核，而肺外結(jié)核中居首位的是骨與關(guān)節(jié)結(jié)核[2-3]。近年來(lái)，藥物耐受以及伴有HIV 感染的結(jié)核病發(fā)病率急劇增加，加劇結(jié)核控制的困難[4]。目前，臨床上多采用手術(shù)治療與全身化療的綜合性治療，而長(zhǎng)期全身化療引起的副反應(yīng)和手術(shù)治療后形成的骨缺損填補(bǔ)是外科醫(yī)生治療骨關(guān)節(jié)結(jié)核面臨的難題。為了在治療中既可以修復(fù)骨結(jié)核病灶清除后的骨缺損，同時(shí)也在局部能夠保持有效的藥物濃度，有效地預(yù)防結(jié)核復(fù)發(fā)，本研究擬構(gòu)建新型骨組織復(fù)合體rADSCs+利福噴丁聚乳酸緩釋微球+HA/β-TCP。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基(HyClone)，10%胎牛血清(HyClone)，鏈霉素-青霉素雙抗溶液(Gibco),I型膠原酶(Worthington)，磷酸鹽緩沖液PBS(HyClone)，3%戊巴比妥鈉(Merck)，25%胰蛋白酶溶液(HyClone)，維生素C(Gibco)，β-甘油磷酸納(美國(guó)，sigma)，地塞米松(美國(guó)，sigma)，茜素紅染液(美國(guó)，sigma)，利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為60748-201007, 含量為99.3%)，聚乳酸(聚乳酸，試劑級(jí)為3萬(wàn)，山東醫(yī)療器件有限公司)，明膠(美國(guó)，sigma)，二氯甲烷、甲醇等試劑(分析純，市售)，羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(Bi-Ostetic)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)(Thermoscientific)，CO2培養(yǎng)箱(Thermoscientific)，水浴箱(上海精密設(shè)備)，752紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)，ME204E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，顯微鏡(Leica)，電鏡(上海菁華科技儀器有限公司)，JJ-1 A-40 W數(shù)顯增力電動(dòng)攪拌器(金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠)，制冰機(jī)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Savant modulyo冷凍干燥機(jī)(美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1rADSCs的分離培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)鑒定

取一只麻醉滿意的兔子，嚴(yán)格無(wú)菌取腹股溝脂肪組織，將其放入裝有D-hanks緩釋液的培養(yǎng)皿中。于超凈臺(tái)在DMEM生長(zhǎng)液中將脂肪組織剪碎成糊狀，置于20 mL 0.075% I型膠原酶溶液中，37℃水浴箱中消化30 min后，加入3倍體積的DMEM終止消化，以2000轉(zhuǎn)/min離心10 min后，棄上清液及表層漂浮脂肪碎屑，加入3倍體積的DMEM生長(zhǎng)液，充分吹打混勻，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取第3代rADSCs，滴加成骨誘導(dǎo)劑：DMEM生長(zhǎng)液+維生素C(50 μmol/L)+β-甘油磷酸納(10 mmol/L)+地塞米松(1×10-7mol/L)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)14 d后茜紅染色，觀察。

1.3.2利福噴丁聚乳酸緩釋微球?qū)ADSCs增殖及成骨活性的影響

按照復(fù)乳-溶媒揮發(fā)法[5-6]制備利福噴丁聚乳酸緩釋微球，即稱取聚乳酸0.1 g完全溶解于5 mL二氯甲烷，加入0.1 g利福噴丁，于4℃冰塊超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲乳化(超聲1 s，間隙2 s，功率為200 W)1.5 min，高速攪拌下緩慢注入到25 mL的0.5%明膠水溶液中，形成O/W乳液，加入75 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，再溫和持續(xù)攪拌6 h，將獲得的懸浮液通過0.88 μm孔徑的水系濾膜抽濾，收集并用蒸餾水洗滌，離心(2000轉(zhuǎn)/min,15 min)數(shù)次后冷凍干燥24 h，并計(jì)算微球載藥率及包封率，顯微鏡及掃描電鏡下觀察形態(tài)大小及表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。取第3代rADSCs(濃度為3×106個(gè)/mL)400 μL與微球3 mg混合均勻后接種于培養(yǎng)皿中，設(shè)置2個(gè)復(fù)皿。設(shè)立對(duì)照組及未加入利福噴丁聚乳酸緩釋微球，均滴加成骨誘導(dǎo)劑，成骨誘導(dǎo)14 d后茜紅染色，觀察。

1.3.3利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP的復(fù)合

對(duì)用60Co-γ照射消毒并在成骨誘導(dǎo)劑中浸泡24 h的HA/β-TCP，在用無(wú)菌濾紙吸凈培養(yǎng)基后，將第3代rADSCs懸液400 μL緩慢滴加，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，將其移至新的培養(yǎng)皿中，加入成骨誘導(dǎo)劑，往第一個(gè)培養(yǎng)皿中滴加2.5 g/L胰蛋白酶消化，計(jì)算流失細(xì)胞數(shù)。取第3代rADSCs懸液400 μL與微球3 mg混合后，緩慢滴加到HA/β-TCP支架上，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，將其移至新的培養(yǎng)皿中，加入成骨誘導(dǎo)劑，往第一個(gè)培養(yǎng)皿中滴加2.5 g/L胰蛋白酶消化，計(jì)算流失細(xì)胞數(shù)。將上述2個(gè)復(fù)合體置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，在震蕩培養(yǎng)后，將2個(gè)復(fù)合體移至新的培養(yǎng)皿中，加入成骨誘導(dǎo)劑后繼續(xù)在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。舊的培養(yǎng)皿中滴加2.5 g/L胰蛋白酶消化，計(jì)算未黏附細(xì)胞數(shù)。將上述2個(gè)復(fù)合體在成骨誘導(dǎo)中培養(yǎng)14 d后，沿皿壁吸凈培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定過夜，95%、75%、45%乙醇逐級(jí)脫水、噴金后，掃面電鏡觀察rADSCs在HA/β-TCP支架的黏附及生長(zhǎng)情況，以及微球和rADSCs在HA/β-TCP支架上的黏附情況。

1.3.4利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP三維復(fù)合體的體外釋藥性

稱取利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，滴加成骨誘導(dǎo)劑基定容至25 mL容量瓶刻度，從中分別精取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL液體，滴加至25 mL容量瓶中，用成骨誘導(dǎo)劑基定容至刻度，用紫外分光光度法在475 nm下檢測(cè)吸光度，畫出利福噴丁濃度(c)對(duì)吸光度(A)的線性回歸曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述三維復(fù)合體置于培養(yǎng)皿中，隔日換液并收集培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基離心后取上清液，在475 nm下檢測(cè)吸光度(A)，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出利福噴丁濃度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累計(jì)釋放量為縱坐標(biāo)，繪制藥物釋放曲線。

2 結(jié)果

2.1 rADSCs及成骨誘導(dǎo)的顯微鏡觀察

第3代rADSCs呈梭形，鏡下可見排列有一定的方向性，呈漩渦狀排列分布(見圖1)。rADSCs體外成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色后，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)被染成深紅色(見圖2)。

2.2 利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs二維復(fù)合體

大體觀察，微球外觀呈橘紅色粉末狀，無(wú)明顯的聚集(見圖3)。掃描電鏡下呈圓球狀，無(wú)粘連成團(tuán)，表面光滑(見圖4)。微球平均直徑(21.82±5.32)μm，76.4%的微球粒徑分布在18～28 μm范圍(見圖5)，微球載藥率(27.57±4.72)%，包封率(82.31±1.28)%。微球與第3代rADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)14 d，茜素紅染色后，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)深紅染色的許多結(jié)節(jié)，微球表面塌陷，但保持圓形輪廓(見圖6)。

圖1 第3代兔脂肪干細(xì)胞 (10×)Fig.1 The third generation rADSCs (10×)

圖2 成骨誘導(dǎo)14 d茜素紅染色 (5×) Fig.2 The alizarin red dye after osteogenic induction (5×)

圖3 微球大體觀 Fig.3 The microspheres

圖4 微球掃描電鏡(600×)Fig.4 The microspheres′s SEM view (600×)

圖5 微球粒徑分布 Fig.5 The size distribution of microspheres

圖6 微球-rADSCs二維復(fù)合體(5×)Fig.6 The two-Dimensional Complex(5×)

2.3 利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP的復(fù)合

rADSCs+HA/β-TCP復(fù)合體細(xì)胞黏附率(94.24±1.25)%，微球+rADSCs+HA/β-TCP復(fù)合體細(xì)胞黏附率(92.02±0.74)%，兩組數(shù)據(jù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在掃描電鏡下，HA/β-TCP表面呈不規(guī)則顆粒狀，各孔間相通，孔隙大小不等。

rADSCs+HA/β-TCP復(fù)合體培養(yǎng)14 d后，可見HA/β-TCP表面被rADSCs層狀膜形分布(見圖7)。微球+rADSCs-HA/β-TCP復(fù)合體培養(yǎng)14 d后，HA/β-TCP表面見rADSCs相互融合呈膜狀，并將微球牢固地固定在HA/β-TCP上，釋微球表面塌陷，但保持圓形輪廓(見圖8)。兩組復(fù)合體中，rADSCs形態(tài)無(wú)明顯差異。

圖7 rADSCs+HA/β-TCP復(fù)合體(掃描電鏡 200×)Fig.7 The two-Dimensional Complex(SEM 200×)

圖8 微球+rADSCs+HA/β-TCP復(fù)合體(掃描電鏡 200×)Fig.8 The three-Dimensional Complex(SEM 200×)

2.4 利福噴丁聚乳酸緩釋微球+rADSCs+HA/β-TCP三維復(fù)合體的體外釋藥性

根據(jù)紫外線分光光度計(jì)的吸光值(A)結(jié)果，得出利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)品在含成骨誘導(dǎo)劑的DMEM培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=12.513c-0.011 7(R2=0.999 6)(見圖9)。微球+rADSCs+HA/β-TCP三維復(fù)合體第6 d釋放量最高，達(dá)0.127 8±0.000 2 mg，第46 d累計(jì)釋放量達(dá)89.733% (見圖10、11)。

圖9 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.9 The standard curve

圖10 藥物釋放濃度 Fig.10 The drug release concentration

圖11 藥物累計(jì)釋放百分率Fig.11 The cumulative release rate of drug

3 討論

rADSCs是脂肪組織中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群，經(jīng)過一定的定向培養(yǎng)后，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞。Arrigoin等將rADSCs接種于HA支架上，修復(fù)脛骨缺損，8周后發(fā)現(xiàn)rADSCs+HA復(fù)合體的骨愈合情況明顯好于單純HA的情況[7]。

支架材料在體外構(gòu)建骨組織工程復(fù)合體中具有重要的意義，本實(shí)驗(yàn)中所用的HA/β-TCP 是由60%的 HA和40%β-TCP組成的復(fù)合材料，是一種新型的植骨材料，也是目前廣泛應(yīng)用于臨床的人工骨粒，具有很好的生物相容性、可降解性及骨傳導(dǎo)性，能夠與骨直接形成鍵性結(jié)合，形成骨組織，是骨組織工程中比較理想的支架材料。李海建等采用HA/β-TCP復(fù)合體材料和家兔同種異體骨進(jìn)行rADSCs培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rADSCs在兩種材料上附著良好、生長(zhǎng)良好、增殖明顯并保持均勻分布，HA/β-TCP復(fù)合體材料的生物相容性不弱于同種異體骨的生物相容性，可在骨組織工程中充當(dāng)細(xì)胞載體[8]。

利福噴丁是一種新型半合成的利福霉類抗生素，其抗結(jié)核桿菌作用比利福平強(qiáng)2～10倍，最低抑菌濃度(MIC)為0.12～0.39 mg/L，具有高效、低毒、長(zhǎng)效的優(yōu)點(diǎn)，是安全有效的抗結(jié)核藥物[9-10]。通過復(fù)乳-溶媒揮發(fā)法[5-6]制備具有緩慢釋藥的微球，其平均直徑、載藥率及包封率與文獻(xiàn)報(bào)道的相仿[11]。本實(shí)驗(yàn)將rADSCs與微球二維復(fù)合后成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色證明該復(fù)合物可向骨分化，成骨誘導(dǎo)14 d后顯微鏡發(fā)現(xiàn)微球表面塌陷，但保持圓形輪廓，可能是微球降解、釋放的結(jié)果。rADSCs+微球+HA/β-TCP三維復(fù)合后，經(jīng)檢測(cè)復(fù)合體中細(xì)胞黏附率較高，微球及rADSCs均未見脫落現(xiàn)象，提示rADSCs與微球及支架均有較好的相容性。此外，復(fù)合體中微球向外周釋放良好，未見細(xì)胞干擾微球釋放的現(xiàn)象。

體外釋藥結(jié)果提示，三維復(fù)合物初期有“突釋”現(xiàn)象，隨后藥物緩慢釋放，釋放量逐漸減少，符合聚乳酸緩釋材料釋放的一般規(guī)律[12]。釋放周期可達(dá)46 d，均高于最低抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rADSCs、HA/β-TCP和利福噴丁聚乳酸緩釋微釋球復(fù)合，所構(gòu)建的材料既可以修復(fù)骨結(jié)核病灶清除后的骨缺損，同時(shí)在局部能夠保持有效的藥物濃度，能有效預(yù)防結(jié)核復(fù)發(fā)，為治療骨結(jié)核這一臨床難題開辟了嶄新的思路。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用rADSCs、利福噴丁聚乳酸緩釋微球及HA/β-TCP構(gòu)建新型骨組織工程復(fù)合體，可以控制藥物的緩慢釋放，并且在局部維持有效的抗結(jié)核藥物的同時(shí)，不影響其增殖及成骨活性，為兔脊柱結(jié)核的治療提供新的思路，從而引導(dǎo)臨床上治療骨與關(guān)節(jié)結(jié)核，但其體內(nèi)抗結(jié)核及促進(jìn)骨愈合作用還需經(jīng)體內(nèi)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2015[EB/OL].http://www.tbonline.info/posts/2015/10/28/global-tuberculosis-report-2015,2015-12/2017-05-20.

[2] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志，2012，34(8):485-508.

[3] Pigrau-serrallach C,Rodr Guez-padro D.Bone and joint tuberculosis[J].Eur Spine J,2013,22(4):556-566.

[4] Chang KC, Yew WW. Management of difficult multidrug-resistant tuberculosis and extensively drug-resistant tuberculosis: Update 2012[J]. Respirology, 2013, 18(1):8-21.

[5] 葉向陽(yáng)，孫湘，賈會(huì)文，等.利福平/聚乳酸-聚羥基乙酸緩釋微球的制備及特性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(51): 9608-9612.

[6] 劉江濤，王永清，夏侃，等.異煙肼聚乳酸緩釋體的制備及體內(nèi)外釋藥特性[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志，2008，18(4):290-293.

[7] Arrigoni E, Girolamo LD, Giancamillo AD. Adipose-derived stem cells and rabbit bone regeneration: histomorphometric, immunohistochemical and mechanical characterization[J]. Journal of Orthopaedic Science, 2013, 18(2):331-339.

[8] 李海建，龍志成，張崢，等. HA/β-TCA復(fù)合材料與同種異體骨體外兔脂肪干細(xì)胞生物相容性的對(duì)比實(shí)驗(yàn)[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015(8):949-953.

[9] Jarvis B, Lamb HM. Rifapentine[J]. Drugs, 1998, 56(4):607.

[10] Listed N. Rifapentine[J]. Tuberculosis, 2008, 88(2):155.

[11] 王丹，姜航航. 聚乳酸共聚物復(fù)合緩釋藥物的材料特征與實(shí)驗(yàn)應(yīng)用[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2013,17(8):1473-1480.

[12] 王丹，姜航航. 聚乳酸共聚物復(fù)合緩釋藥物的材料特征與實(shí)驗(yàn)應(yīng)用[J]. 中國(guó)組織工程研究，2013，17(8):1473-1480.