MicroRNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV檢測高危人乳頭瘤病毒對早期宮頸癌的診斷價(jià)值

李永杰，王琛

（河南大學(xué)淮河醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 開封 475000）

宮頸癌臨床較常見，呈現(xiàn)出癌變重、發(fā)現(xiàn)晚及病亡率高等特征，在女性惡性腫瘤中居第2位，僅次于乳腺癌，已經(jīng)嚴(yán)重危害女性健康。宮頸癌病變的主要危險(xiǎn)因素是高危型人乳頭狀瘤病毒（high risk type human papilloma virus，HR-HPV）長期感染誘發(fā)[1]。近幾年相關(guān)研究顯示，99%以上的宮頸癌患者主要病因發(fā)生發(fā)展是HR-HPV感染所致。目前，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（thinprep cytology test，TCT）在宮頸癌的診斷、治療等方面得到普遍應(yīng)用，成為篩查宮頸癌的常規(guī)方法[2]。而第2代雜交捕獲試驗(yàn)（hybrid captureⅡ，HC2）能夠?qū)m頸管代謝物HR-HPV及癌前病變實(shí)施有效臨床分析檢測，由于宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程時(shí)間較長，在癌前病變期若能夠盡早發(fā)現(xiàn)并盡早治療，可以有效預(yù)防其惡化，提高患者的生存率，故宮頸癌的早期篩查十分重要[3]。同時(shí)，HC2-HPV-DNA檢測結(jié)果可能因某些基因蛋白特異性表達(dá)而不能達(dá)到常規(guī)儀器檢測或癌變征兆，易發(fā)生漏診。而隨著近些年分子生物學(xué)與基因遺傳學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)血清標(biāo)志物微小RNA（MicroRNA）與宮頸癌進(jìn)展存在緊密聯(lián)系，且有細(xì)胞特異性，參與癌細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等周期過程，實(shí)時(shí)調(diào)控癌基因活性發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)作用[4]。故Micro RNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV-DNA基因檢查，成為婦女宮頸疾病方面較為前沿的診斷技術(shù)，具有較高的敏感性與特異性[5]，而目前相關(guān)方面報(bào)道較少。故本文對來我院婦產(chǎn)科門診就診的疑似宮頸癌患者進(jìn)行臨床分析，旨在研究Micro RNA、TCT與HC2-HPV基因檢查對早期宮頸癌篩選的臨床應(yīng)用價(jià)值，提高早期診斷率，為臨床提供一定的參考指標(biāo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月-2016年2月本院就診的疑似宮頸癌患者150例作為觀察組。平均年齡（35.26±5.32）歲，所有患者均在知情且自愿的情況下并通過倫理委員會參加本研究。對宮頸肥大、潰瘍或糜爛等不同程度癥狀表現(xiàn)的患者實(shí)施TCT、MicroRNA、HC2-HPV檢測與宮頸病理活檢。

1.2 方法

MicroRNA提?。翰杉芯繉ο髮m頸樣本，依照Trizol試劑盒標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格實(shí)施每一步，所得mRNA A260/280調(diào)節(jié)1.8以上。Real-time PCR反應(yīng)：依照Access RTPCR System嚴(yán)格操作，并依據(jù)GenBank設(shè)計(jì)對應(yīng)序列引物（a為正向引物，b為反向引物）：MicroRNA-203-Fa GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA，Micro RNA-203-Rb GCTGTCAACGATACGCTACGT；U6 RNA-Fa CGCTTCGGCAGCACATATAC，U6 RNA-Rb TTCACGAATTTGCGTGTCAT。其中，將cDNA、引物和SYBR Green混合，Real-time PCR條件為：95℃預(yù)變性5 min，后95℃變性10 s 60℃退火，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。Real-time PCR使用Applied Biosystems 7000擴(kuò)增儀進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以2-ΔΔCt表示目的miRNA的表達(dá)相對于內(nèi)參的變化倍數(shù)，其中Δ△Ct=Ct-miRNA-CtU6。

TCT：嚴(yán)格按照TCT取樣要求制成薄層涂片，經(jīng)巴氏染色后送到病理科檢測。宮頸細(xì)胞學(xué)診斷根據(jù)國際癌癥協(xié)會核定的貝塞斯達(dá)系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）分類標(biāo)準(zhǔn)[6]，根據(jù)細(xì)胞異型性的嚴(yán)重程度依次診斷為正常范圍（normal range，NR）、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high degree of squamous intraepithelial lesion，HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和腺癌。將≥ASCUS診斷為陽性。

HC2-HPV-DNA檢測：采用美國Digene公司提供的HPV-DNA技術(shù)進(jìn)行嚴(yán)格制樣并檢測，13種高危型 HPV（16、18、3l、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、66與68），判斷標(biāo)準(zhǔn)：相對光單位（relative light unit，RLU）/Cutoff（閾值）≥1.0診斷為HPV陽性。

病理組織活檢[7]：操作醫(yī)師在陰道鏡下對可疑位多點(diǎn)活檢，將組織送病理科檢測。根據(jù)2013版《病理學(xué)》子宮頸腫瘤組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：良性細(xì)胞改變（benign cell change，BCC）、不典型增生輕度（cervical intraepithelial neoplasia-I，CIN-I）、 中 度（cervical intraepithelial neoplasia-Ⅱ，CIN-Ⅱ）、重度（cervical intraepithelial neoplasia-Ⅲ，CIN-Ⅲ）及SCC。病變在CIN-Ⅰ及以上為組織學(xué)陽性。

1.4 評定指標(biāo)

根據(jù)病理學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算TCT、HC2-HPV及MicroRNA相對表達(dá)量的敏感性、特異性及診斷符合率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）描述，并行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT診斷結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果比較

TCT診斷結(jié)果（NR、ASCWS、LSIL、HSIL、SCC）與病理學(xué)結(jié)果（BCC、CIN-I、CIN-II、CINIII、SCC）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TCT診斷結(jié)果≥ASCUS有73例（73/150）呈陽性，占48.67%，病理學(xué)結(jié)果≥CIN-I有79例（79/150），占52.67%。見表1。

2.2 HC2-HPV診斷結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果比較

不同病理學(xué)診斷結(jié)果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ、SCC）與HC2-HPV陽性率差異較大，且其隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 MicroRNA相對表達(dá)量與病理學(xué)結(jié)果比較

不同病理學(xué)診斷結(jié)果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ及SCC）與不同microRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miRNA-21與miRNA-193b表達(dá)量隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸升高，表明其有促進(jìn)癌變周期發(fā)生、發(fā)展；而miRNA-124與miRNA-195表達(dá)量隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸降低，表明其有抑制癌變周期發(fā)生、發(fā)展。血清microRNA相對表達(dá)量的檢測可以直接預(yù)估宮頸癌變情況，有直接指導(dǎo)價(jià)值。見表3。

表1 TCT診斷結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果比較 例（%）

表2 HC2-HPV診斷結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果比較 例（%）

2.4 患者TCT與HC2-HPV診斷結(jié)果比較

HC2-HPV陽性率隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 MicroRNA相對表達(dá)量、TCT、HC2-HPV檢測對宮頸癌患者診斷結(jié)果比較

MicroRNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV檢測的敏感性為98.73%，特異性為98.59%，高于單項(xiàng)microRNA、TCT、HC2-HPV或者聯(lián)合microRNA+TCT、HC2-HPV+TCT及microRNA+HC2-HPV的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)microRNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV檢測的診斷符合率為98.67%，也優(yōu)于單項(xiàng)或者兩項(xiàng)聯(lián)合（P＜0.05）。此外，microRNA的敏感性、特異性及診斷符合率優(yōu)于單一TCT、HC2-HPV的。見表5。

表3 MicroRNA相對表達(dá)量與病理學(xué)結(jié)果比較 （u/ml，±s）

表3 MicroRNA相對表達(dá)量與病理學(xué)結(jié)果比較 （u/ml，±s）

注：1）與BCC比較，P ＜0.05；2）與CIN-Ⅰ比較，P ＜0.05；3）與CIN-Ⅱ比較，P ＜0.05；4）與CIN-Ⅲ比較，P ＜0.05

項(xiàng)目 BCC CIN-Ⅰ CIN-Ⅱ CIN-Ⅲ SCC F值 P值miRNA-21 121.32±10.32 135.26±15.571） 226.31±29.251）2） 334.13±37.461）2）3） 411.45±43.641）2）3）4） 752.611 0.000 miRNA-124 106.52±13.21 81.36±8.371） 67.37±6.381）2） 51.25±5.721）2）3） 39.35±5.121）2）3）4） 191.492 0.000 miRNA-193b 104.13±12.35 129.42±15.571） 151.38±24.231）2） 192.46±32.371）2）3） 245.58±39.691）2）3）4） 175.880 0.000 miRNA-195 92.79±9.48 77.25±7.351） 61.21±6.421）2） 45.26±5.531）2）3） 36.36±4.791）2）3）4） 229.085 0.000

表4 患者TCT與HC2-HPV診斷結(jié)果比較 例（%）

表5 MicroRNA相對表達(dá)量、TCT、HC2-HPV對宮頸癌患者診斷結(jié)果比較 例（%）

3 討論

宮頸癌防治重點(diǎn)是在早期宮頸癌前病變進(jìn)行有效篩查并采取合理的治療與預(yù)防措施。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步以及人們保健意識的提高，大多數(shù)生育期女性的初期官頸癌可以被及時(shí)診斷。早期普遍采用TCT技術(shù)可以提高宮頸上皮內(nèi)瘤變的診斷率，具有較高的敏感性與特異性[8]。本研究結(jié)果顯示，TCT診斷（NR，ASCUS、LSIL、HSIL、SCC）與病理學(xué)結(jié)果（BCC、CIN-Ⅰ、CIN-Ⅱ、CIN-Ⅲ及SCC）比較有差異。TCT診斷結(jié)果≥ASCUS呈陽性占48.67%，病理學(xué)結(jié)果≥CIN-I占52.67%，說明單一的TCT診斷存在一定的陽性預(yù)測率，但預(yù)測值較低，故容易出現(xiàn)漏檢、假陰性情況[9]。有研究表明，高危型HPV感染往往與宮頸癌變密切相關(guān)，而HC2-HPV具有簡便易行，較高的HPV陰性預(yù)測率也被逐漸采用[10]。本研究結(jié)果顯示，不同病理學(xué)診斷結(jié)果與HC2-HPV陽性率差異較大，且其隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸升高，有差異。其中HC2-HPV陰性率較高，與以上報(bào)道一致。有研究顯示，HC2-HPV與TCT可提高陽性檢出率，降低漏檢[11]。此外，本研究進(jìn)一步分析HC2-HPV與TCT診斷結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HC2-HPV陽性率隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸升高，比較有差異，進(jìn)一步揭示宮頸癌早期采用HC2-HPV與TCT有一定診斷效果。此外，研究報(bào)道證實(shí)，microRNA在HPV活性周期中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，具有下調(diào)抑癌基因表達(dá)及癌細(xì)胞增殖作用，且與宮頸癌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移有直接聯(lián)系[12]。本研究結(jié)果顯示，不同病理學(xué)診斷患者中不同microRNA相對表達(dá)量有差異，miRNA-21與miRNA-193b表達(dá)量隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸上升，表明其有促進(jìn)癌變周期發(fā)生、發(fā)展[12]；而miRNA-124與miRNA-195表達(dá)量隨宮頸癌變嚴(yán)重程度逐漸下降，表明其有抑制癌變周期發(fā)生、發(fā)展。血清microRNA相對表達(dá)量的檢測可以直接預(yù)估宮頸癌變情況，有直接指導(dǎo)價(jià)值[13]。

另外，有研究報(bào)道證實(shí)，microRNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV基因檢測可以有效提高診斷的準(zhǔn)確率和敏感性[14-15]。本研究結(jié)果顯示，新型腫瘤標(biāo)志物micro RNA的敏感性、特異性及診斷符合率優(yōu)于單一TCT、HC2-HPV。同時(shí)microRNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV檢測的敏感性為98.73%，特異性為98.59%及診斷符合率為98.67%，高于單項(xiàng)microRNA、TCT、HC2-HPV兩種或者聯(lián)合如microRNA+TCT、HC2-HPV+TCT及microRNA+HC2-HPV，比較有差異。揭示聯(lián)合應(yīng)用可以更加準(zhǔn)確診斷早期宮頸癌情況，采用聯(lián)合方法診斷結(jié)果可優(yōu)勢互補(bǔ)，在臨床宮頸癌前期病變診斷方面應(yīng)大力推廣[16-17]。

綜上所述，采用microRNA聯(lián)合TCT、HC2-HPV，用于宮頸癌患者的診斷及病情評估，具有較高的敏感性、特異性及診斷符合率，在臨床有較高的診斷價(jià)值。

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