保護(hù)素DX對(duì)膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

卜克，王璐，劉林剛

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052）

膿毒癥作為常見(jiàn)的危重癥，是由各種因素導(dǎo)致的的全身炎性反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致全身各系統(tǒng)、多器官損傷，是危重病房患者主要致死因素[1]。其中，肺往往是最易受損器官，早期便可導(dǎo)致急性肺損傷，且病情進(jìn)展迅猛，尚無(wú)特效的治療方法，病死率較高[2]。因此，如何有效防治膿毒癥所致急性肺損傷，已成為臨床研究重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)[3]，過(guò)度炎癥反應(yīng)在膿毒癥所致急性肺損傷發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。保護(hù)素DX（protectin DX，PDX）作為一種ω-3多不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，可減少中性粒細(xì)胞中活性氧生成，具有較好的抗炎作用[4]。本研究通過(guò)復(fù)制小鼠膿毒癥所致急性肺損傷模型，觀察PDX對(duì)肺損傷保護(hù)作用，并探討可能的機(jī)制，以期為膿毒癥所致急性肺損傷臨床防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑PDX（購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司），HE染色試劑盒（購(gòu)自北京中杉金橋生物公司），白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自碧云天生物工程公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所），兔抗小鼠核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)SAB公司），兔抗小鼠核因子κB抑制蛋白α抗 原（nuclear factor kappa B inhibitor alpha antigen，IκB-α）多克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康雄性昆明小鼠45只購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXX（豫）2010-0002]，6～8周齡，體重18～23 g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，自由進(jìn)食、飲水，利用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組和PDX干預(yù)組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 小鼠膿毒癥模型復(fù)制按照文獻(xiàn)[5]中的方法復(fù)制小鼠膿毒癥模型：用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取仰臥位，消毒后，取腹正中線切口，將腸系膜和盲腸末端游離，用4號(hào)無(wú)菌絲線在回盲瓣以下進(jìn)行結(jié)扎，用針頭于盲端部位進(jìn)行穿孔，擠出少量糞便后，還納腹腔，逐層關(guān)閉腹腔，蘇醒后自由進(jìn)食、飲水。假手術(shù)組小鼠僅開(kāi)腹而不結(jié)扎盲腸及穿孔。術(shù)畢60 min后，PDX干預(yù)組小鼠腹腔注射1 μg的PDX[6]，假手術(shù)組和膿毒癥組則給予等量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中膿毒癥組3只小鼠死亡，PDX干預(yù)組2只小鼠死亡。

1.2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)觀察建模24 h后，各組小鼠處死后，開(kāi)胸留取右肺組織，4%甲醛固定，石蠟包埋、切片后，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并進(jìn)行肺損傷評(píng)分[7]：根據(jù)肺間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡水腫、肺泡出血、肺不張、透明膜形成病變程度，按照正常、輕度、中度、重度分別按0～3分計(jì)分。

1.2.3 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平檢測(cè)取各組小鼠左下肺組織，研磨后制備肺組織勻漿，4℃下3 500 r/min離心15 min，留取上清，保存于-20℃冰箱。利用ELISA檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平，所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.4 Western blot檢測(cè)肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達(dá)取各組小鼠右下肺組織約80 mg，預(yù)冷PBS洗滌3次，將核蛋白提取裂解緩沖液加入，置于冰上靜置20 min，勻漿后，將細(xì)胞裂解液NP-40加入，于4℃下于12 000 r/min離心40 s，取上清作為胞漿蛋白。沉淀物則用預(yù)冷PBS沖洗2次，4℃下于12 000 r/min離心40 s，將核蛋白提取裂解液加入，置于冰上靜置25 min，于4℃下于12 000 r/min離心120 s，取上清作為核蛋白，置于-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg總蛋白，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃條件下用濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，TBST液漂洗30 min，分別將一抗兔抗小鼠NF-κB、IκB-α多克隆抗體（稀釋比例1∶1 000、1∶1 200）加入，室溫下靜置60 min，TBST漂洗30 min，加入二抗，TBST漂洗30 min，加入ECL反應(yīng)液顯影，拍照后，用Image J圖像分析軟件分析條帶獲得胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組小鼠肺組織形態(tài)正常，肺泡腔清晰可見(jiàn)，間隔無(wú)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；膿毒癥組小鼠肺組織間隔增加，間質(zhì)水腫，有大量炎癥細(xì)胞聚集，出現(xiàn)肺泡腔融合，腔內(nèi)出現(xiàn)有點(diǎn)狀或片狀出血；PDX干預(yù)組小鼠肺組織病變較膿毒癥組減輕，見(jiàn)圖1。

2.2 各組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重程度組織學(xué)評(píng)分

假手術(shù)組、膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織損傷組織學(xué)評(píng)分分別為（2.4±1.0）、（13.7±1.3）及（6.4±1.6）分，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織損傷組織學(xué)評(píng)分均升高，與膿毒癥組比較，PDX干預(yù)組小鼠肺組織損傷組織學(xué)評(píng)分則降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=253.323，P=0.000）。

2.3 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比較

假手術(shù)組、膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1980.915、141.627、62.851、44.720及78.345，均P=0.000），兩兩比較，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，PDX干預(yù)組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組、膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.675和123.909，均P=0.000）；兩兩比較，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而胞漿中IκB-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，PDX干預(yù)組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，而胞漿中IκB-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2和圖2。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化 （HE×200）

表1 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比較 （±s）

表1 各組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比較 （±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；2）與膿毒癥組比較，P ＜0.05

組別 例數(shù) IL-1β/（pg/mg） IL-6/（pg/mg） TNF-α/（pg/mg） SOD/（u/mg） MDA/（nmol/mg）假手術(shù)組 15 47.1±4.0 110.2±39.5 88.1±17.1 32.5±6.9 5.7±1.4膿毒癥組 12 159.5±5.91） 359.5±20.51） 158.6±19.31） 59.0±9.21） 14.8±1.91）PDX 干預(yù)組 13 74.4±4.31）2） 162.4±51.31）2） 115.1±11.71）2） 38.7±6.21）2） 8.6±2.31）2）F值 1980.915 141.627 62.851 44.720 78.345 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達(dá)比較 （±s）

表2 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；2）與膿毒癥組比較，P ＜0.05

組別 例數(shù) NF-κB蛋白 IκB-α蛋白假手術(shù)組 15 0.31±0.07 0.98±0.15膿毒癥組 12 0.77±0.121） 0.30±0.071）PDX 干預(yù)組 13 0.51±0.141）2） 0.63±0.091）2）F值 55.675 123.909 P值 0.000 0.000

圖2 各組小鼠肺組織胞核中NF-κB和胞漿中IκB-α蛋白表達(dá)

3 討論

膿毒癥作為燒傷、創(chuàng)傷、外科手術(shù)及缺血再灌注損傷等常見(jiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者死亡的重要因素[8]，研究表明[9]，膿毒癥所致難以控制的全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致的多器官損傷是導(dǎo)致患者早期死亡的主要原因。肺作為發(fā)生膿毒癥時(shí)最易受損的靶器官，近年來(lái)雖然各種診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但膿毒癥所致急性肺損傷仍是主要死亡原因[10]，是目前危重醫(yī)學(xué)亟需解決的難題。有研究指出[11]，膿毒癥引發(fā)的全身炎癥及大量炎癥因子釋放導(dǎo)致的氧化/抗氧化失衡是發(fā)生急性肺損傷的主要因素。PDX作為多不飽和脂肪酸經(jīng)脂氧合酶代謝產(chǎn)物，在減少炎癥反應(yīng)及相關(guān)細(xì)胞因子釋放中發(fā)揮重要作用[12]，戴昳寧[13]指出，PDX可降低叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的炎癥及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子釋放，減輕視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷。本研究利用文獻(xiàn)[5]中經(jīng)典方法構(gòu)建膿毒癥所致小鼠急性肺損傷模型，病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，膿毒癥組小鼠肺組織出現(xiàn)典型的急性損傷改變，且肺組織損傷組織學(xué)評(píng)分顯著增加，表明成功構(gòu)建膿毒癥所致小鼠急性肺損傷模型。

IL-1β、IL-6及TNF-α作為機(jī)體內(nèi)主要的促炎因子，其水平與體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平呈正相關(guān)，可反應(yīng)機(jī)體炎癥反應(yīng)水平[14]，MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物，是反應(yīng)機(jī)體內(nèi)氧自由基生成及活性的主要指標(biāo)，而SOD作為一種保護(hù)性物質(zhì)，則在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損傷中發(fā)揮重要作用[15]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均升高，說(shuō)明膿毒癥所致急性肺損傷時(shí)，肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而在給予PDX干預(yù)后，小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均降低，說(shuō)明PDX可減少小鼠肺組織中炎癥因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)，病理學(xué)檢查亦顯示，PDX干預(yù)組小鼠肺組織病變較膿毒癥組減輕，且肺組織損傷組織學(xué)評(píng)分降低，進(jìn)一步說(shuō)明PDX可通過(guò)抑制小鼠肺組織炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕膿毒癥所致急性肺損傷。

有研究指出[16]，NF-κB可通過(guò)調(diào)控炎癥因子釋放而參與急性肺損傷發(fā)生。正常情況下，未活化的NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合而游離于胞漿中，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，IκB發(fā)生降解而與NF-κB解離，NF-κB快速移至細(xì)胞核內(nèi)，在于特異性靶位結(jié)合后，促進(jìn)多種炎癥因子和介質(zhì)大量釋放[17]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組和PDX干預(yù)組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而胞漿中IκB-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，說(shuō)明發(fā)生膿毒癥時(shí)可導(dǎo)致肺組織胞漿中IκB-α蛋白解離而使胞核中NF-κB蛋白大量增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺組織發(fā)生急性損傷，而在給予PDX干預(yù)后，PDX干預(yù)組小鼠肺組織胞核中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，而胞漿中IκB-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，說(shuō)明PDX可能通過(guò)減少胞漿中IκB-α蛋白降解而阻止胞核中NF-κB蛋白，從而減輕炎癥因子釋放，發(fā)揮肺保護(hù)作用。

綜上所述，PDX可減輕膿毒癥所致小鼠肺組織損傷，其機(jī)制與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及通過(guò)調(diào)控NF-κB/IκB-α通路而抑制炎癥因子釋放有關(guān)。

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