有機磷農(nóng)藥廢水高效降解菌的篩選及菌群構(gòu)建

李鐵軍　丁邦琴　周春曉

摘要：利用有機磷農(nóng)藥廢水培養(yǎng)基，從江蘇省南通市有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)污水處理池活性污泥中馴化、分離了52株具有有機磷農(nóng)藥廢水降解能力的菌種，建立資源庫。對菌種資源庫進行高效有機磷農(nóng)藥廢水降解菌的篩選，獲得14株72 h COD去除率大于60%的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA初步鑒定，10株細菌分屬于假單胞菌屬（Pesudomonas）、不動菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、副球菌屬（Paracoccus）；4株真菌分屬于絲孢酵母屬（Trichosporon）、曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Piniciellum）。選擇降解率高的5株菌進行組合培養(yǎng)，篩選了6組72 h COD去除率大于70%的高效降解有機磷農(nóng)藥廢水的菌群組合。

關(guān)鍵詞：有機磷農(nóng)藥廢水；高效降解菌；菌群組合；篩選

中圖分類號：X592 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）03-0019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.005

Abstract： Based on medium made of organic phosphorus pesticide wastewater，a resource library contains 52 strains with degrading ability of organophosphorus pesticide wastewater was set up， these strains were domesticated and isolated from activated sludge from sewage treatment tank of organophosphorus pesticide production enterprises in Nantong city，Jiangsu province. 14 strains with 72 h COD removal rate more than 60% were obtained by screening of highly efficient degradation strain from the library. Through morphological observation and 16S rDNA identification，10 strains of bacteria belong to Pseudomonas，Acinetobacter，Bacillus，and the genus Paracoccus，and 4 fungi were classified as Trichosporon，Aspergillus，Trichoderma and Penicillium. Finally，6 group of flora combination with 72 h COD removal rate more than 70% were selected by using 5 strains with high degradation rate.

Key words： organophosphorus pesticide wastewater； highly efficient degradation strain； flora combination； screening

有機磷農(nóng)藥是目前應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥，具有高效、經(jīng)濟、方便和廣譜等優(yōu)點。然而，有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)和使用過程中產(chǎn)生的廢水具有濃度高、毒性大、成分復(fù)雜等特點，如不進行有效處理， 將會嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境[1]。生物降解法是處理有機磷農(nóng)藥廢水的有效方法之一，與傳統(tǒng)的理化處理方法相比，具有節(jié)能減排、針對性強、無需增加設(shè)備、環(huán)保等優(yōu)點[2]。生物降解法的原理是利用微生物的代謝將有機磷農(nóng)藥廢水同化或分解，其核心是高效降解菌的篩選[3]。

近年來，國內(nèi)外研究學(xué)者已報道分離的有機磷農(nóng)藥廢水降解菌幾乎包括細菌、真菌、放線菌、藻類等各種微生物，其中，細菌由于其生化上的多種適應(yīng)能力以及易誘發(fā)突變菌株，在降解微生物中占重要地位[4]。雖然已有很多的高效菌被篩選、鑒定，相關(guān)的一些降解酶基因也已被克隆表達，高效工程菌株也多見報道，但是由于有機磷農(nóng)藥廢水成分復(fù)雜，某種有害成分需多種微生物同時分解，同一種菌也會對多種類似結(jié)構(gòu)成分具有降解作用[5]。已有研究表明，在自然環(huán)境中，微生物在降解有機污染物時，不同種群微生物間存在協(xié)同作用，復(fù)合菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，降解效果常較單一菌株好[6]，但目前國內(nèi)外尚未見利用復(fù)合菌株降解有機磷農(nóng)藥廢水的相關(guān)報道。本試驗針對目前有機磷農(nóng)藥廢水生物處理研究和開發(fā)現(xiàn)狀，通過不同水質(zhì)有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水優(yōu)勢降解菌種的篩選、分離、鑒定，以期獲得對有機磷農(nóng)藥廢水化學(xué)需氧量（COD）降解率高的菌株及混合菌群組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗廢水及水質(zhì) 試驗用廢水取自江蘇省南通市某農(nóng)藥廠有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水，原廢水清亮透明，強酸性，有強烈的刺鼻氣味，COD為156 000 mg/L，總磷含量為13 200 mg/L，BOD/COD<0.1，敵百蟲有機磷農(nóng)藥殘留量4.0%左右，NaCl含量5.34%。

1.1.2 菌株來源 活性污泥樣品采自南通市某農(nóng)藥廠的污水處理池。

1.1.3 藥品試劑 酵母提取物、蛋白胨為Oxide產(chǎn)品；PCR擴增試劑盒、DL 2000 Marker、p MD-18T 載體、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒（Omega）；氨芐青霉素、瓊脂糖、X-gal，IPTG為Ameresco公司產(chǎn)品；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備 DNA Thermol Cycler4800型PCR儀，AmpGene公司；3K18高速冷凍臺式離心機，美國Sigma公司；迷你離心機，德國Eppendorf公司；DU 640紫外核酸蛋白質(zhì)分析儀，美國Beckon公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；超凈臺，蘇州凈化儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器，太倉市光明實驗分析儀器廠；Power PAC300電泳儀，美國Bio Rad公司；恒溫水浴鍋，北京東方晶美科學(xué)儀器有限公司；Gene Pulse電轉(zhuǎn)化儀與0.2 cm的石英電轉(zhuǎn)杯，Bio-RAD公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.1.5 緩沖液及培養(yǎng)基 ①磷酸鹽緩沖液。NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，加去離子水定容至1 L。②含20%、40%、60%、80%有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水的無機鹽培養(yǎng)基。K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，（NH4）2SO4 0.2 g，CaSO4 0.08 g，加含有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水20%、40%、60%、80%的去離子水定容至1 L。③牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌用）。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加pH 7.0左右的有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水定容至1 L。④馬鈴薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌用）。去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，加有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水定容至1 L。⑤高氏一號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）?？扇苄缘矸?0 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，加有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水定容至1 L。⑥活化培養(yǎng)基。蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，KH2PO4 1 g，加去離子水定容至1 L。⑦固體培養(yǎng)基。各液體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂。以上緩沖液和培養(yǎng)基均需在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 污泥預(yù)處理 將20 mL活性污泥放入100 mL燒杯中，沉降30 min，去上清液；將底層污泥分裝到100 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，棄離心管上清液；用60 mL滅過菌的磷酸鹽緩沖液清洗離心管底部的泥，在上述條件下再次離心，如此操作兩次，將活性污泥中的菌釋放出來。

1.2.2 菌種馴化 采用逐漸提高有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水濃度的方法對菌株進行馴化。洗泥后將離心管底部污泥取出，用滅過菌的50 mL無機鹽培養(yǎng)基將其配成污泥溶液，充分混合均勻后，加到450 mL含20%有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水的滅菌無機鹽培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，5 d后從中移取50 mL培養(yǎng)液加到450 mL含40%有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水的滅菌無機鹽培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min繼續(xù)搖床振蕩培養(yǎng)5 d；同樣操作轉(zhuǎn)接含60%、80%有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水的滅菌無機鹽培養(yǎng)基，獲得馴化菌群。

1.2.3 菌種分離及資源庫的構(gòu)建 菌株分離采用梯度稀釋涂布法，將馴化后的菌液稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個稀釋度，分別取200 μL各梯度稀釋后的菌液涂布于對應(yīng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基固體平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出明顯菌落。用接種環(huán)挑取形態(tài)不同的單菌落，對其進行劃線純化至新鮮固體平板中，重復(fù)純化，直至獲得純的單菌落。將純化的不同菌株轉(zhuǎn)至相對應(yīng)類型的斜面培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將其放入冰箱中4 ℃下保存，建立菌種資源庫，以備使用。以后每月將菌種資源庫中的各個菌株轉(zhuǎn)種至相對應(yīng)類型的新鮮斜面培養(yǎng)基中1次。

1.2.4 高效有機磷農(nóng)藥廢水降解菌的篩選 ①廢水預(yù)處理。向廢水中加入5 g/L CaCO3（方解石，0.044 mm，325目）反應(yīng)3 h，將廢水pH調(diào)至7.0左右，CaCO3處理結(jié)束后過濾除去沉淀。②分別將分離的菌株擴大培養(yǎng)至菌濃度OD600 nm為0.5左右，與處理后的試驗廢水按體積比1∶2混合，置于250 mL錐形瓶中在 28 ℃、120 r/min搖床處理，分別取0、24、48、72、96、120 h的樣品測定其COD，直至COD趨于穩(wěn)定。試驗中COD的檢測采用重鉻酸鉀法[7]，參照GB 11914-1989。有機磷農(nóng)藥廢水的COD去除率=（C0-Ct）/C0×100%，式中，C0為菌株培養(yǎng)前的廢水COD濃度；Ct為菌株培養(yǎng)一定時間后的廢水COD濃度。③設(shè)不接種菌種組在相同條件下?lián)u床培養(yǎng)為空白對照，以COD去除率來表示篩選得到的菌株的降解能力，初篩出COD轉(zhuǎn)化率相對較高的菌株（72 h COD去除率大于60%），保存至斜面以備用。

1.2.5 高COD去除率菌株的初步鑒定 菌株鑒定參照文獻[8-10]；菌株16S/18S rDNA序列分析由上海生工生物工程股份有限公司進行。

1.2.6 高效有機磷農(nóng)藥廢水降解菌群的構(gòu)建 將篩選獲得的具有高效降解有機磷農(nóng)藥廢水的菌株分別進行2株菌、3株菌、4株菌等不同組合，等比例接種培養(yǎng)，構(gòu)建不同的微生物降解菌群，檢測其72 h COD 去除率，并通過與單菌株去除率的比對，研究不同菌群組合的降解效果，每個組合設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機磷農(nóng)藥廢水降解菌的分離純化及資源庫的構(gòu)建

以試驗廢水為培養(yǎng)基，將從農(nóng)藥廠污水處理池中采集的活性污泥經(jīng)過馴化、分離的52株具有有機磷農(nóng)藥廢水降解能力的菌種建立資源庫，其中含38株細菌、9株真菌、5株放線菌，對各菌株進行編號，斜面培養(yǎng)基4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌株篩選結(jié)果

取各菌株分別處理試驗廢水，72 h COD去除率大于60%的菌株有JSBL1、 JSBL5、 JSBL6、 JSBL8、 JSBL11、 JSBL12、 JSBL15、 JSBL17、 JSBL18、 JSBL22、JSBL35、JSBL47、JSBL48、JSBL50，經(jīng)計算，各菌株對COD去除率的平均值為65.2%，各菌株對廢水中COD的去除效果見圖1，由圖1可以看出，JSBL5、JSBL12、JSBL17、JSBL35、JSBL47菌株的72 h COD 去除率大于65%。

2.3 菌種鑒定結(jié)果

對篩選獲得的14株菌株進行形態(tài)學(xué)觀察和16S/18S rDNA序列分析鑒定，其中有10株細菌、4株真菌。

10株細菌菌株鑒定結(jié)果見表1。由表1可見，除JSBL17菌株為不動菌屬（Acinetobacter）、JSBL47菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus）、JSBL50為副球菌屬（Paracoccus）外，其余7株菌株均為假單胞菌屬（Pesudomonas）。

4株真菌菌株鑒定結(jié)果見表2。由表2可見，JSBL6、JSBL8、JSBL22、JSBL48真菌菌株分屬于絲孢酵母屬（Trichosporon）、曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Piniciellum）。

2.4 高效有機磷農(nóng)藥廢水降解菌群的構(gòu)建

選72 h COD去除率大于65%的5個菌株JSBL5、JSBL12、JSBL17、JSBL35、JSBL47，分別進行2株菌、3株菌、4株菌和5株菌組合，等比例接種培養(yǎng)，檢測72 h COD去除率，通過與單菌株的降解率比對，各菌群組合的降解效果見表3。

由表3可以看出，不同菌株的菌群組合相對于單菌株而言，72 h COD去除率均升高的有JSBL17/JSBL47、JSBL5/JSBL17/JSBL47、JSBL12/JSBL17/JSBL47、JSBL17/JSBL35/JSBL47、JSBL5/JSBL12/JSBL17/JSBL47、JSBL5/JSBL17/JSBL35/JSBL47，且這6組的72 h COD去除率均大于70%，其中JSBL17/JSBL35/JSBL47組合72 h COD去除率最高，為75.8%；其余組合均有升有降，72 h COD去除率介于60.5%～69.3%。

3 小結(jié)與討論

生物處理法處理農(nóng)藥廢水的關(guān)鍵是篩選高效降解菌種，污泥馴化是獲得適宜菌種的有效途徑。迄今為止，已從石油、農(nóng)藥、油脂、苯酚、抗生素等廢水的污泥中分離出多種高效降解微生物。本研究通過逐漸提高有機磷農(nóng)藥生產(chǎn)廢水濃度的方法對菌株進行馴化，其目的在于獲得對有機磷農(nóng)藥廢水具有較高降解能力的高效菌株。經(jīng)過篩選獲得了14株72 h COD去除率大于60%的菌株，其中10株為細菌，4株為真菌；10株細菌菌株分屬于假單胞菌屬、不動菌屬、芽孢桿菌屬、副球菌屬，4株真菌菌株分屬于絲孢酵母屬、曲霉屬、木霉屬、青霉屬；此篩選結(jié)果與已有文獻報道基本一致，分解有機磷農(nóng)藥及生產(chǎn)污水的微生物主要是細菌，也有一些真菌，其中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬是最活躍的菌屬，真菌以曲霉屬為主[11]。

另外，由于有機磷農(nóng)藥廢水成分復(fù)雜，依靠單一的微生物無法徹底完成有機磷農(nóng)藥廢水的降解，需要通過具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能實現(xiàn)有機磷農(nóng)藥廢水的完全降解[4]。本研究對篩選得到的72 h COD去除率大于65%的5個菌株分別進行2株菌、3株菌、4株菌和5株菌混合，構(gòu)建了26組降解有機磷農(nóng)藥廢水的菌群組合。根據(jù)各菌群組合的降解率可以看出，不同菌株的菌群組合相對于單菌株而言，有的升高，有的降低，這可能是由于不同菌株之間的相互作用導(dǎo)致的。研究發(fā)現(xiàn)，6組混合菌群的降解效果均比單個菌株降解效果有明顯提高，其中JSBL17/JSBL35/JSBL47組合降解率達到75.8%。已有研究認為，復(fù)合菌中的相互共存菌種越多，抗沖擊能力也就越強，這個菌群也就越穩(wěn)定，因此，在實際中常采用多菌株復(fù)合降解體系，使其更貼近自然界微生物的協(xié)同生態(tài)關(guān)系[12]。本研究JSBL17/JSBL35/JSBL47組合中，3個菌株分屬于假單胞菌屬（Pesudomonas）、不動菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus），可能是3種細菌在代謝途徑上存在互補性。

本研究只是對高效有機磷農(nóng)藥廢水降解菌的篩選和組合進行了初步研究，后續(xù)研究中還將對高效降解菌株和菌群組合的降解機理及溫度、pH、鹽度、時間等對降解能力的影響進行進一步研究，以為高效有機磷農(nóng)藥廢水降解菌的固定化研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 慕毅敏，代巖石，劉 宇.芽孢桿菌降解有機磷農(nóng)藥的研究[J].中國衛(wèi)生工程學(xué)，2014，13（5）：414-415.

[2] 徐 璟，王紅武.有機磷農(nóng)藥廢水處理方法研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：93-94.

[3] 朱福興，王 沫，李建洪.降解農(nóng)藥的微生物[J].微生物學(xué)通報，2004，31（5）：120-123.

[4] 張六六，夏森玉，丁亞欣，等.有機磷農(nóng)藥高效降解微生物的篩選與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（36）：212-215.

[5] 葉國青，唐文偉，曾新平.高效工程菌的構(gòu)建及其降解有機農(nóng)藥的研究進展[J].環(huán)境保護科學(xué)，2010，31（1）：31-33.

[6] 梁生康，王修林，汪衛(wèi)東，等.高效石油降解菌的篩選及其在油田廢水深度處理中的應(yīng)用[J].化工環(huán)保，2004，24（1）：41-45.

[7] 國家環(huán)?？偩?水和廢水監(jiān)測分析方法[M].第四版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.88.

[8] HOLT J G，KRIEG N R，SNEATH P H，et al. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology[M].9th ed. Baltimore，MD：The Williams and Wilkins Co.，1994.

[9] 李秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[10] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[11] 李志瑞.有機磷農(nóng)藥降解菌的分離篩選及其降解性能的初步研究[D].西安：西北大學(xué)，2008.

[12] 徐志霞，張 穎，金顯敏，等.高效石油降解菌株的篩選及菌群的構(gòu)建[J].海南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，28（4）：421-424.