桂南木蓮繁育系統(tǒng)及其傳粉適應(yīng)性1)

羅峰 金曉玲 李瑞雪 張哲 張方靜 胡希軍

(中南林業(yè)科技大學(xué)，長(zhǎng)沙，410004) (湖南省環(huán)境資源植物開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心)

植物繁育系統(tǒng)一般指直接影響后代遺傳組成的所有有性特征，包括花部綜合特征、花各性器官壽命、開(kāi)放式樣、自交親和程度和交配系統(tǒng)等，這些特征結(jié)合傳粉者和傳粉行為是影響生殖后代遺傳組成和適合度的主要因素[1]，對(duì)調(diào)節(jié)種群結(jié)構(gòu)有重大影響[2]。植物對(duì)傳粉者的傳粉適應(yīng)是被子植物花部特征進(jìn)化的根本動(dòng)力[3]，如花瓣顏色[4]、花大小[5]、花形態(tài)[6]、花結(jié)構(gòu)對(duì)稱性[7-8]等花部特征的塑造都受其傳粉昆蟲的影響。此外，植物花部特征的形成也會(huì)受一些非傳粉者因子的影響[9]。因此，研究植物繁育系統(tǒng)及傳粉適應(yīng)，是探討物種多樣性發(fā)生歷史、維持機(jī)理和保護(hù)策略的重要基礎(chǔ)[1]。

桂南木蓮(Manglietiachingi)是木蘭科(Magnoliaceae)木蓮屬(Manglietia)常綠喬木，花朵白色清香，具樹形優(yōu)美和材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，是重要的觀賞樹種和林業(yè)用材[10]。但桂南木蓮主要分布在海拔700～1 000 m的山林中，自然種群分布零散，自然條件下結(jié)實(shí)率低[11]，嚴(yán)重制約了種群的自然繁衍和開(kāi)發(fā)利用。目前，對(duì)桂南木蓮的研究主要有引種栽培[10]和種子繁育[12]，對(duì)其繁育系統(tǒng)的研究尚未開(kāi)展。為探討桂南木蓮結(jié)實(shí)率低下的原因，文中對(duì)其繁育系統(tǒng)進(jìn)行研究，包括開(kāi)花生物學(xué)觀察、花粉活力與柱頭可授性的測(cè)定、花粉/胚珠比值的估算以及傳粉昆蟲傳粉行為的觀察。闡明桂南木蓮開(kāi)花特征的傳粉適應(yīng)機(jī)制，為桂南木蓮的資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料是中南林業(yè)科技大學(xué)植物園中的桂南木蓮人工種群，植物園位于111°54′～114°15′E,27°51′～28°40′N，海拔100～120 m,屬于亞熱帶濕潤(rùn)氣候，地帶性植物為常綠闊葉林，年均降水量1 361.6 mm。園內(nèi)植物種類豐富，有桂南木蓮常見(jiàn)的野外伴生樹種，如殼斗科、樟科、安息香科、金縷梅科等植物。

1.2 方法

開(kāi)花生物學(xué)觀察：在2016—2017年每年4—6月份，參照Dafni[13]201-211方法選擇10株10～15年生植株進(jìn)行觀察。盛花期(全株50%以上花朵開(kāi)放)時(shí)隨機(jī)標(biāo)記20朵花朵，觀察花瓣、雌蕊、雄蕊的變化過(guò)程，單花開(kāi)花動(dòng)態(tài)，計(jì)算單花花期。

柱頭可授性測(cè)定：采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法測(cè)定不同開(kāi)花階段柱頭的可授性。

花粉活力測(cè)定：用TTC染色法檢測(cè)不同開(kāi)花階段花粉活力；參考付玉嬪等[14]試驗(yàn)結(jié)果，采用培養(yǎng)基萌發(fā)法測(cè)定閉合階段花粉活力。分別以不同質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸混合溶液為培養(yǎng)基，并設(shè)清水為對(duì)照，共10組處理(表1)，在培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)花粉10 h，用光學(xué)顯微鏡拍照后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

表1 花粉萌發(fā)不同培養(yǎng)基組合

訪花昆蟲的觀察：選擇晴天對(duì)盛花期花朵的訪花昆蟲進(jìn)行全天候觀察。

雜交指數(shù)(OC，I)的測(cè)定：盛花期時(shí)隨機(jī)選擇閉合期的30朵花，按照Dafni[13]201-211標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量花部特征。

花粉/胚珠比的估算：隨機(jī)選取10朵未散粉花朵，將雄蕊取下分別裝于潔凈的小瓶中，待花粉全部散出后加入10 mL蒸餾水，磁力攪拌器下振蕩30 min，取1 μL滴載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)全部花粉數(shù)。同時(shí)將子房壁用解剖刀切開(kāi)，統(tǒng)計(jì)單花胚珠數(shù)值。最后計(jì)算出P/O的值，參照Cruden[15]標(biāo)準(zhǔn)判定其繁育系統(tǒng)。

人工控制性授粉試驗(yàn)：設(shè)置5個(gè)處理，即對(duì)照，為不套袋，不去雄，自由傳粉，檢測(cè)自然條件下結(jié)實(shí)情況；去雄，為套袋，檢測(cè)是否存在無(wú)融合生殖；不去雄，為套袋，檢測(cè)是否能自花授粉；人工同株異花授粉，為檢測(cè)自交是否親和；異株異花授粉，為檢測(cè)異交是否親和。果實(shí)成熟后統(tǒng)計(jì)座果率和結(jié)籽率。座果率=(結(jié)實(shí)總數(shù)/處理個(gè)數(shù))×100%；結(jié)籽率=(果實(shí)中種子數(shù)/胚珠總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Spss軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 開(kāi)花物候及開(kāi)花動(dòng)態(tài)

2.1.1 開(kāi)花物候

桂南木蓮于4月上旬芽鱗開(kāi)裂(圖1A)新葉生長(zhǎng)，10～12 d后形成花蕾，隨后外苞片開(kāi)裂脫落(圖1B)，18～22 d花朵開(kāi)放。其群體花期從4月底持續(xù)到6月初，單株花期(31±5)d，若遇連續(xù)睛天植株迅速進(jìn)行入盛花期。

2.1.2 開(kāi)花動(dòng)態(tài)

桂南木蓮單朵花期3～4 d，可分為5個(gè)階段，即松蕊階段，時(shí)間08：00—19：00，外輪花被片開(kāi)裂，露出白色中輪花瓣(圖1C)；初次開(kāi)放階段，時(shí)間19：00—21：00，柱頭分泌較多黏液(圖1D)；閉合階段，21：00—翌日19：00，外輪花被片舒展但內(nèi)3輪合攏，花藥開(kāi)裂但雄蕊緊貼雌蕊基部，雄蕊并未對(duì)外散粉(圖1E)；再次開(kāi)放階段，時(shí)間翌日19：00—21：00，內(nèi)3輪花被片再次打開(kāi)，花藥開(kāi)始對(duì)外散粉(圖1F)；衰敗階段，前期內(nèi)3輪花被片合攏但相互之間留有空隙，大量花粉散落在花被片底部(圖1G)，后期花藥和花被片脫落，柱頭變褐色失去活性(圖1H)。

2.2 柱頭可授性測(cè)定及雄蕊散粉情況

桂南木蓮柱頭可授性及雄蕊群散粉情況表明(表2)，5個(gè)開(kāi)花時(shí)階段柱頭都有可授性。其中閉合階段柱頭可授性最強(qiáng)(圖2C)，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，約16 h，但花朵閉合不利于昆蟲授粉；初次開(kāi)放階段柱頭可授性強(qiáng)(圖2B)，但持續(xù)時(shí)間短暫，約3 h，且在傳粉昆蟲活動(dòng)少的夜晚；再次開(kāi)放階段柱頭可授性較強(qiáng)(圖2D)，雄蕊對(duì)外散粉，柱頭位于雄蕊群下方，能授上自花花粉。

表2 桂南木蓮柱頭可授性及雄蕊群散粉情況

注：“++++”表示柱頭可授性最強(qiáng)；“+++”表示柱頭可授性強(qiáng)；“++”表示柱頭可授性較強(qiáng)；“+”表示柱頭可授；“-”表示柱頭不可授。

A.芽鱗開(kāi)裂；B.花蕾外苞片脫落；C.松蕊階段；D.初次開(kāi)放階段；E.閉合階段；F.再次開(kāi)放階段；G.衰敗前期；H衰敗后期。

A.松蕊期；B.初次開(kāi)放階段；C.閉合階段；D.再次開(kāi)放階段；E.衰敗前期；F.衰敗后期。

2.3 花粉活力測(cè)定

由TTC染色法測(cè)定桂南木蓮花粉活力可知(表3)，桂南木蓮花粉活力隨著開(kāi)花進(jìn)程逐漸增強(qiáng)，在閉合階段花藥開(kāi)裂時(shí)花粉活力最高為31.34%，隨后花粉活力下降；在再次開(kāi)放階段雄蕊群對(duì)外散粉時(shí)花粉活力較低，為8.85%；衰敗前期花粉活力僅為1.93%,花粉活力散失快。此外，用花粉萌發(fā)法測(cè)定閉合期花粉最高萌發(fā)率也僅為26.23%，與其他木蘭屬和含笑屬植物相比桂南木蓮花粉活力低。

表3 TTC染色法測(cè)定桂南木蓮花粉活力

注:表中花粉染色率數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 訪花昆蟲的觀察

通過(guò)對(duì)桂南木蓮訪花昆蟲的觀察，發(fā)現(xiàn)白天蜜蜂是主要訪花昆蟲，且主要訪問(wèn)閉合階段和衰敗前階段期的花朵。蜜蜂訪花時(shí)從花瓣間隙進(jìn)入花朵(圖3A)，或從花瓣底部鉆入(圖3B)，身上沾滿花粉后再訪問(wèn)其他桂南木蓮花朵時(shí)進(jìn)行授粉。極少數(shù)甲蟲類昆蟲是桂南木蓮夜間訪問(wèn)者，主要訪問(wèn)初次開(kāi)放和再次開(kāi)放的花朵，尤其再次開(kāi)放花朵散出的花粉正好通過(guò)這些甲蟲的訪花活動(dòng)授到其他花朵的柱頭上，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)甲蟲啃食花瓣的現(xiàn)象(圖3C)。此外，在桂南木蓮花內(nèi)還發(fā)現(xiàn)螞蟻、薊馬等小型昆蟲，據(jù)觀察，這類昆蟲不是桂南木蓮的有效傳粉昆蟲。

A.蜜蜂從花瓣間隙飛入；B.蜜蜂從花瓣底部鉆入；C.被甲蟲啃食的花朵。

2.5 雜交指數(shù)的測(cè)定

參照Dafni[13]201-211的標(biāo)準(zhǔn)，桂南木蓮花朵直徑(6.2±1.5)cm>6 mm，記為3；花為兩性花，雌蕊先熟，記為0；雌雄蕊空間分離，且花藥高于柱頭，記為1。因此，桂南木蓮的雜交指數(shù)OC，I為4，繁育系統(tǒng)為部分自交親和,異交,需要傳粉者。

2.6 花粉/胚珠比的估算

桂南木蓮的單花平均花粉數(shù)為3 999 500±1 530，胚珠平均數(shù)為321.75±15，平均P/O=12 430±120(在2 108.0～195 525.0之間)，判定其繁育系統(tǒng)為專性異交。

2.7 套袋試驗(yàn)

桂南木蓮套袋處理結(jié)實(shí)表明(表4)，桂南木蓮自然傳粉條件下座果率和結(jié)籽率均較低，分別為15.00%和2.29%±0.13%，小核果敗育嚴(yán)重(圖4A)；去雄、套袋不結(jié)實(shí)，說(shuō)明不存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象；不去雄、套袋和同株異花授粉的結(jié)實(shí)率為0，說(shuō)明自交不親和(圖4B)；桂南木蓮異株異花授粉座果率較高，為65.00%，果實(shí)發(fā)育良好(圖4C)，但結(jié)籽率僅為11.32%±1.06/%，通過(guò)解剖果實(shí)發(fā)現(xiàn)心皮內(nèi)胚珠敗育嚴(yán)重，單個(gè)心皮內(nèi)種子2～3粒。由此判斷桂南木蓮的繁育系統(tǒng)為異交型，需要傳粉媒介。

表4 桂南木蓮套袋處理結(jié)實(shí)情況

注：表中結(jié)籽率數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

A.自然傳粉，不套袋發(fā)育的果實(shí)；B.同株異花授粉不親和，雄蕊敗育；C異株異花授粉發(fā)育的果實(shí)；D.單心皮內(nèi)兩粒種子，胚珠敗育嚴(yán)重。

3 結(jié)論與討論

異交傳粉機(jī)制的多樣性是花結(jié)構(gòu)和傳粉媒介相互適應(yīng)的結(jié)果。為適應(yīng)昆蟲的傳粉，植物形成與授粉昆蟲活動(dòng)規(guī)律相協(xié)調(diào)的開(kāi)花動(dòng)態(tài)。例如，高山龍膽科植物為節(jié)約能量以適應(yīng)低頻率的昆蟲訪花，形成了有規(guī)律的晝夜開(kāi)放和閉合的特征及時(shí)間長(zhǎng)的花壽命[16]。克魯茲王蓮花器官呈現(xiàn)出有規(guī)律的開(kāi)放和閉合，也是適應(yīng)其傳粉昆蟲的需要[17]。Gerhard et al.[18]觀察到巴西木蘭科植物Magnoliaovata夜晚開(kāi)放、二次開(kāi)合的開(kāi)花特征，發(fā)現(xiàn)這與其特定授粉甲蟲在晚上活動(dòng)有關(guān)，且夜晚雌蕊特征和雄蕊特征表達(dá)時(shí)花朵所散發(fā)的香味只能吸引這種甲蟲訪花。本研究中，桂南木蓮兩次開(kāi)放都是在上半夜進(jìn)行，初次開(kāi)放階段柱頭可授性較強(qiáng)，雄蕊未散粉，可為異交提供無(wú)污染的柱頭，再次開(kāi)放階段雄蕊群才開(kāi)展散粉則為異交提供較高活力的花粉，試驗(yàn)中觀察到的甲蟲正好是花粉傳播的媒介。此外，桂南木蓮在連續(xù)天晴時(shí)迅速進(jìn)入盛花期，更是為這種傳粉機(jī)制實(shí)現(xiàn)生殖成功提供柱頭和花粉的保障。而桂南木蓮花朵下半夜閉合，從而推測(cè)其目的是，節(jié)約能量、保護(hù)雌蕊和為授在柱頭上的花粉萌發(fā)形成合適的微環(huán)境。

花朝向的花部特征也是植物與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果，其中傳粉者在花朝向的形成中扮演著重要角色[9]。植物會(huì)通過(guò)花朵下垂來(lái)提高昆蟲訪花頻率，提高授粉成功率[19]，同時(shí)避免花粉因陽(yáng)光直射而降低活力，延長(zhǎng)雄性特征表達(dá)時(shí)間[20]。本研究中人工套袋試驗(yàn)結(jié)果顯示桂南木蓮存在自交不親和現(xiàn)象，結(jié)合較低的花粉活力測(cè)定結(jié)果和白天蜜蜂的訪花行為，判斷桂南木蓮花朵下垂、花被片合攏的花部特征并不是為其自交提供條件，而是為了將花粉散落在合攏的花被片上，延長(zhǎng)雄性特征表達(dá)時(shí)間，這也是為昆蟲傳粉提供充足的花粉源。綜上所述，桂南木蓮花朵下垂、二次開(kāi)合的花部特征均是對(duì)其昆蟲傳粉機(jī)制的適應(yīng)。

桂南木蓮花量大，連續(xù)晴天時(shí)進(jìn)入盛花期，在單株和群體水平上開(kāi)花同步性強(qiáng)，屬于“大量、集中式開(kāi)放”模式，這種模式能吸引更多的昆蟲訪花傳粉，保障植株的生殖成功。同時(shí)桂南木蓮群體花期在雨水多的季節(jié)，這種集中開(kāi)放模式還能減輕惡劣天氣對(duì)其群體繁衍的不利影響。但桂南木蓮為避免自交導(dǎo)致的敗育，雄蕊特意延遲對(duì)外散粉時(shí)間，因此在單花水平上開(kāi)花同步性差。另外，桂南木蓮單花雖然能產(chǎn)生大量花粉，但在柱頭可授性最強(qiáng)期間，柱頭被花被片包圍，難以接受蟲媒傳粉以外的其他途徑授粉，因此，受花粉傳遞的限制，在自然條件下植株的結(jié)實(shí)率低。

在測(cè)定其繁育系統(tǒng)時(shí)，花粉/胚珠比和套袋試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果與雜交指數(shù)測(cè)定的結(jié)果不一致。這可能與用雜交指數(shù)測(cè)定植物繁育系統(tǒng)時(shí)，只考慮到花的外部特征對(duì)植物生殖系統(tǒng)的影響，對(duì)授粉后花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)、雌雄配子結(jié)合及胚胎發(fā)育等未做考慮有關(guān)。桂南木蓮作為原始的被子植物，開(kāi)花過(guò)程中花被片長(zhǎng)期包裹雄蕊和雌蕊以及雄蕊位于雌蕊之上的花結(jié)構(gòu)，很容易發(fā)生自花授粉造成胚胎敗育。且自交譜系缺乏對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)性和形成新物種的潛力，易引起自交衰退而導(dǎo)致物種滅絕，所以自交不能作為植物長(zhǎng)期的生殖策略[16]。因此，在種群長(zhǎng)期的繁衍中，桂南木蓮為避免自交衰退依舊保持原始專性異交的繁育系統(tǒng)。

此外，本文研究結(jié)果與測(cè)定大果木蓮(Manglietiagradis)繁育系統(tǒng)時(shí)的結(jié)果有所不同，這說(shuō)明同一分類群(種、屬、族、科)中繁育系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生多樣性表達(dá)，從而推測(cè)是花部特征不同的植物(桂南木蓮花下垂合攏，大果木蓮花上舉開(kāi)放)為適應(yīng)傳粉環(huán)境形成的不同適應(yīng)機(jī)制。

綜上所述，桂南木蓮的繁育系統(tǒng)是異交，昆蟲傳粉，有效傳粉昆蟲是甲蟲和蜜蜂。在自然條件下其結(jié)實(shí)率低的內(nèi)因是對(duì)外散出的花粉活力低，外因是缺少有效的傳粉昆蟲。

桂南木蓮結(jié)實(shí)率低與其專性異交的繁育系統(tǒng)密切相關(guān)?；ǚ刍盍Φ?，需要傳粉媒介，自然條件下種群多星散分布，這些都會(huì)影響傳粉的有效性[21]，制約桂南木蓮自然種群的繁衍更新。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其人工栽培技術(shù)的研究，通過(guò)人工栽種的手段擴(kuò)大種群數(shù)量，結(jié)合花期釋放傳粉昆蟲的方法，提高自然條件下桂南木蓮異株異花授粉的概率。此外，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有桂南木蓮自然種群的保護(hù)，減輕人為活動(dòng)對(duì)種群的影響，進(jìn)而達(dá)到種質(zhì)資源保護(hù)的目的。

[1] 何亞平,劉建全.植物繁育系統(tǒng)研究的最新進(jìn)展和評(píng)述[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2003,49(2)：151-163.

[2] 楊旭,楊志玲,王潔,等.瀕危植物凹葉厚樸的花部綜合特征和繁育系統(tǒng)[J].生態(tài)學(xué)雜志,2012,31(3)：551-556.

[3] 黃雙全,郭友好.傳粉生物學(xué)的研究進(jìn)展[J].科學(xué)通報(bào),2000,51(3)：225-237.

[4] HEUSCHEN B, GUMBERT A, LUNAU K. A generalised mimicry system involving angiosperm flower colour,pollen and bumblebee’s innate colour perferences[J]. Plant Systematics & Evolution,2005,252(3)：121-137.

[5] THOMPOSON J D. How to visitation patterns vary among pollinators in reation to floral display design in a generalist polliantion systen?[J]. Oecologia,2001,126(3)：386-394.

[6] BLOCH D, ERHARDT A. Selection toward shorter flowers by butterfies whose probosces are shorter than f-loral tubes[J]. Ecology,2008,89(9)：2453-2460.

[7] NEAL P R, DAFIN A, GIURFA M. Floral sysmetry and its role in plant-pollinator systems: terminology, distr-ibution, and bypotheses[J]. Annual Review of Ecology & Systematics,2003,29(1)：345-379.

[8] SARGENT R D. Floral symmetry affects speciation rates in angiosperms[J]. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences,2004,271：603-608.

[9] 侯勤正,任昱蘭,文靜,等.灌木鐵線蓮繁育系統(tǒng)特征及其花下垂現(xiàn)象的適應(yīng)性意義[J].西北植物學(xué)報(bào),2016,36(11)：2283-2290.

[10] 徐奎源,徐永星.桂南木蓮的引種與栽培技術(shù)[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2004,47(10)：41-42.

[11] 羅仲春.桂南木蓮[N].中國(guó)花卉報(bào),2003-10-07(T00).

[12] 楊成華,孔志紅.9種木蘭科種子的場(chǎng)圃發(fā)芽率試驗(yàn)[J].貴州林業(yè)科技,2003,31(3)：19-21，43.

[13] DAFNIA.Pollinationecology:Apracticalapproach[M].Oxford:OxfordUnivertyPress,1992.

[14] 付玉嬪,陳少瑜,吳濤.瀕危植物大果木蓮與中緬木蓮的花部特征及繁育系統(tǒng)比較[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,38(4)：6-10.

[15] GRUDEN R W. Pollen-ovule: a conservative indicator of breeding systems in flowering Plants[J]. Evolution,1977,35(1)：1-6.

[16] 何亞平,劉建全.植物繁育系統(tǒng)研究的最新進(jìn)展和評(píng)述[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2003,49(2)：151-163.

[17] 周慶源,傅德志,靳曉白.克魯茲王蓮(睡蓮科)的開(kāi)花生物學(xué)研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2006,27(8)：1526-1533.

[18] GERHARD G, ILSE S, ROGER S, et al. Pollination ecology ofMagnoliaovatamay explain the overall lar-ge flower size of the genus[J]. Flora,2012，207(2)：107-118.

[19] SUNS G, YAOCY Y. Increased seed set in down slope-facing flower ofLiliumduchartrei[J]. Journal of Systematics & Evolution,2013,51(4)：405-412.

[20] CHAN Z, IRWIN R E, YUN W, et al. Selective seed abortion induced by nectar robbing in the selfing pl-antComastomapulmarium[J]. New Phytologist,2011,192(1)：249-255.

[21] 李宗艷,郭榮.木蓮屬瀕危植物致瀕原因及繁殖生物學(xué)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2014,18(1)：90-94.