卡氏肺孢子菌的生物學(xué)特性簡述

馮 潔, 林金杏, 高 誠

(上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii，Pc)是一種人獸共患機會性致病病原體，既往將其列為原生動物門，單孢子蟲綱，弓形蟲目，稱為卡氏肺孢子蟲。1980年代后，隨著分子水平研究的進(jìn)展，人們認(rèn)為它是一種不典型的真菌，將其歸為子囊菌綱(Ascomycetes)，并更名為肺孢子菌[1]。該菌可感染多種哺乳動物，常寄居于宿主肺組織，在健康宿主體內(nèi)并不引發(fā)癥狀，對于免疫低下或缺陷宿主常引起肺孢子菌肺炎。

1 病原特性與分類學(xué)進(jìn)展

20世紀(jì)初Chagas和Carinii[2]首次從豚鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)病原，1912年Delanog’s夫婦從大鼠肺中檢出，進(jìn)一步證實它是一種新的病原體，為紀(jì)念Carinii 而將其命名為卡氏肺孢子蟲 (Pneumocystis carinii, Pc)。

肺孢子菌在分類學(xué)上兼有原蟲和真菌二者的特點，長期以來其分類地位一直存在爭議。由于其形態(tài)和生活史與原蟲相似，菌膜結(jié)構(gòu)與瘧原蟲相似，微管的超微結(jié)構(gòu)與孢子蟲類似; 胞膜上富含膽固醇，缺乏真菌胞膜上普遍存在的麥角固醇，廣譜抗真菌藥物對其無效; 在真菌培養(yǎng)基上不能連續(xù)生長，對原蟲的藥物如戊烷脒、磺胺類藥物敏感[3]，因此過去大部分學(xué)者傾向于將其歸為原蟲，歸屬孢子蟲綱(Sporozoa)。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用,人們對肺孢子菌的認(rèn)識不斷深化。Edman等[4]對肺孢子菌16S rRNA基因序列分析表明其與啤酒酵母菌具有很高的相似性, 包囊壁主要成分與釀酒酵母菌同源性高于任何一種已知原蟲, 線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶亞基及細(xì)胞色素氧化酶DNA序列與真菌的同源性(60%)超過與原蟲的同源性(20%)。將肺孢子菌與釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Canidia albicans)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、藍(lán)氏賈第蟲(Giardia lamblia)及弓形蟲(Toxoplasma Gondii)在18S rRNA水平的相似性進(jìn)行比較，表明其序列與真菌更為相似。肌動蛋白、β-微管蛋白和鈣調(diào)素是生物進(jìn)化中最保守的一類蛋白質(zhì)，將肺孢子菌肌動蛋白基因與其他30多種生物的序列進(jìn)行比對，表明其與多數(shù)真菌相近。肺孢子菌和真菌具有合成蛋白質(zhì)所必需的延長因子III，而原蟲則缺乏這種因子。近年來研究[5-7]表明，其胞膜富含β-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)等真菌中存在的特異物質(zhì)，某些超微結(jié)構(gòu)與真菌也相似。上述一系列研究結(jié)果從囊壁超微結(jié)構(gòu)、基因序列、蛋白質(zhì)功能等層面均證實肺孢子菌應(yīng)歸為真菌范疇。1976年Frenkel等[8]報道感染人與鼠的肺孢子菌在形態(tài)和免疫原性等方面均有所不同，提議將導(dǎo)致人類肺炎的肺孢子菌命名為耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jeroveci)，此后專業(yè)文獻(xiàn)[9-12]逐漸沿用這個名稱，其真菌分類歸屬為子囊菌門(Ascomycota)外囊菌亞門(Taphrinomycotina)肺孢子菌綱(Pneumocystidomycetes)肺孢子菌目(Pneumocystidales)肺孢子菌科(Pneumocystidaceae）肺孢子菌屬(Pneumocystis)。在2001年召開的機會性原生生物國際研討會上，科學(xué)家們一致通過重新修改命名，以肺孢子菌代替卡氏肺孢子蟲成為屬，而原先被認(rèn)為寄生于人體的卡氏肺孢子蟲僅寄生于大鼠[13]。

2 流行病學(xué)

肺孢子菌呈世界性分布，在多種哺乳類動物，包括人、鼠、兔、犬、貓、豬、羊、靈長類等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)過該菌，鼠類的帶菌狀態(tài)非常普遍。不同宿主來源的肺孢子菌異質(zhì)性較高，染色體核型、基因多態(tài)性、免疫原性等差異較大[14,15]。每一種宿主可感染一種或多種不同型的肺孢子菌，不同來源的肺孢子菌形態(tài)和生活史較一致，主要有滋養(yǎng)體、包囊前期、包囊三種形態(tài)。滋養(yǎng)體形態(tài)多變，具有類似原蟲偽足結(jié)構(gòu)及其活動方式，發(fā)育為包囊前期，經(jīng)細(xì)胞核分裂形成具有8個囊內(nèi)小體的成熟包囊。包囊呈圓形或卵圓形，表面光滑，直徑5～8 μm，囊壁厚100～160 nm[16]。

感染患者和健康帶菌者均可為傳染源，嚙齒類和兔是重要的傳播媒介。通常認(rèn)為肺孢子菌包囊經(jīng)空氣傳播進(jìn)入宿主肺內(nèi)，附著在肺上皮細(xì)胞表面，很少侵入細(xì)胞內(nèi)，呈隱性感染，當(dāng)宿主免疫力低下時可大量繁殖。但不能通過食物及飲水傳播，可經(jīng)胎盤垂直傳播感染胎兒，是否存在血液傳播途徑目前尚不清楚[17,18]。

動物實驗表明[19]，免疫力正常宿主的肺內(nèi)可帶有菌體成為傳染源，與病鼠同籠飼養(yǎng)的健康小鼠發(fā)生一過性感染，早期 PCR 檢查陽性，4 周后可查到包囊，5～6 周后隨著獲得性免疫反應(yīng)產(chǎn)生，菌體自動消失，不出現(xiàn)任何臨床癥狀。成熟包囊為感染階段。陳艷等[20]用Giemsa染色法檢查實驗小鼠肺孢子菌感染率為2%。Serikawa等[21]取無肺孢子菌感染的409只裸小鼠，放入不同級別的飼養(yǎng)設(shè)備飼養(yǎng), 結(jié)果6個月后17.2%的動物呈陽性。兔肺孢子菌自然感染率很高[22]。李華軍等[23]于2005年采用染色法和PCR法對6個品系共177只實驗動物肺孢子菌隱性感染狀況作調(diào)查，結(jié)果Giemsa法陽性率為6.8%，改良的六亞甲基四胺銀(GMS)法陽性率為13.6%，PCR法陽性率高達(dá)49.1%。

3 致病性

該菌大多呈隱性感染，機體抵抗力下降時處于潛伏狀態(tài)的菌體進(jìn)行大量繁殖，才可能發(fā)生顯性感染。一般認(rèn)為[1,24]，機體吸入空氣中的肺孢子菌包囊而感染，條件適宜時包囊轉(zhuǎn)為滋養(yǎng)體，后者寄生于肺泡上皮細(xì)胞和肺泡間隔內(nèi)，隨肺泡中肺孢子菌的大量繁殖并在肺組織內(nèi)擴散，纖維連接素在菌體和宿主細(xì)胞受體之間起橋梁作用，促使其附著在肺泡表面。隨著菌體增殖，肺泡毛細(xì)血管通透性增加、肺間質(zhì)增寬、肺泡上皮細(xì)胞脫落，肺泡內(nèi)出現(xiàn)以滋養(yǎng)體、包囊和炎性細(xì)胞為主的滲出物，表面活性物質(zhì)減少，肺彌散功能降低，導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管血氣交換功能障礙，進(jìn)而引起缺氧出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡。近年來關(guān)于肺孢子菌感染與宿主免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)及影響因素等方面的問題成為該領(lǐng)域的研究熱點。滋養(yǎng)體和包囊胞壁上含有多種抗原類物質(zhì)，如主要表面糖蛋白、P55蛋白、A12蛋白、主要表面糖蛋白相關(guān)抗原等，這些蛋白與機體感染肺孢子菌肺炎的過程密切相關(guān)。侵襲肺泡時可破壞機體免疫系統(tǒng)，引發(fā)宿主產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫反應(yīng)[25-28]。

大鼠、小鼠感染肺孢子菌主要表現(xiàn)為精神沉郁、被毛粗亂、消瘦、發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀。免疫缺陷小鼠、遺傳修飾造成免疫功能不全的小鼠易感，呈亞急性或慢性病程，持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月，動物體質(zhì)量逐漸減輕，呼吸窘迫，衰弱，裸鼠皮膚發(fā)紺，年長鼠較年輕鼠嚴(yán)重，呈進(jìn)行性消耗病特征，最終導(dǎo)致窒息[29]。剖檢可見病變多集中在肺臟，表面可見散在米粒大小灰白色結(jié)節(jié)性病灶，肺泡壁充血、擠壓切面有少許粉紅色泡沫樣液體溢出，肺泡腔內(nèi)泡沫狀滲出物大量肺孢子菌滋養(yǎng)體、包囊及其崩潰物，肺印片可見肺孢子菌，以包囊為主。兔急性肺部感染主要表現(xiàn)為多發(fā)、散在的實變灶，多分布于肺野外周。猴感染肺孢子菌后表現(xiàn)為肺水腫、出血、肉樣變、間質(zhì)增寬、肺不張，切面流出紅色泡沫樣液體，瀕死期口吐白色泡沫樣物質(zhì)[16]。

4 實驗室診斷

目前，實驗室診斷方法包括病原學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測3種方法。

4.1 病原學(xué)檢測

通常取呼吸道樣本作染色檢查或免疫熒光染色,以顯微鏡下觀察到包囊和滋養(yǎng)體為確診的金標(biāo)準(zhǔn)。

目前常用的方法包括GMS染色、甲苯胺藍(lán)(TBO)染色和Giemsa染色、瑞氏(Wrights)染色等。GMS染色法對包囊有特異性染色效果，包囊壁染成灰黑色或深褐色，部分囊壁可見括號狀結(jié)構(gòu)，但不能識別滋養(yǎng)體和囊內(nèi)小體。對比度強，菌體易于辨認(rèn)，簡便快捷，應(yīng)用最為廣泛。TBO染色法同樣具備操作簡便的優(yōu)點，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，染色效果易受溫度和時間的影響，現(xiàn)今很少應(yīng)用此染色法。Giemsa和Wrights法染色后囊壁不著色，可使包囊內(nèi)小體和滋養(yǎng)體著色，呈淡藍(lán)色，包內(nèi)可見4～8個深紅色子孢子，便于與其他真菌鑒別。近年來建立的熒光染色法和Calcofluor White(CFW)染色法，易于辨認(rèn)包囊，操作簡便可行，適用于快速診斷。

我國實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18448.4-2001《實驗動物 卡氏肺孢子蟲檢測方法》推薦實驗動物卡氏肺孢子蟲檢測方法為，對寄生于宿主肺細(xì)胞內(nèi)(或釋放于細(xì)胞外)的菌體進(jìn)行固定、Giemsa染色，顯微鏡下觀察到包囊和滋養(yǎng)體判定為陽性。

由于肺孢子菌在不同發(fā)育階段和不同生存環(huán)境下的形態(tài)也不同，染色鏡檢直接觀察到病原體，特異性強，但對檢測人員的染色技術(shù)及鏡檢水平要求較高，且受標(biāo)本載菌量的影響，因此容易造成漏檢[30,31]。

4.2 免疫學(xué)檢測

酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗和免疫印跡試驗檢測血清特異性抗體，快速、簡便，可用于流行病學(xué)調(diào)查。另外可采用單克隆抗體直接進(jìn)行免疫熒光試驗或免疫組織化學(xué)試驗，用于檢測組織中的包囊或滋養(yǎng)體，具有較高的特異性和敏感性。但由于其抗原組分復(fù)雜，各抗原多肽的抗原性強弱不同，迄今未找到理想的抗原分子，限制了血清學(xué)檢測方法的開發(fā)和應(yīng)用。

4.3 分子生物學(xué)檢測

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已作為傳統(tǒng)檢測的補充手段，用于流行病學(xué)調(diào)查和治療監(jiān)測。自1990年Wakefield 等[32]首次采用PCR方法從患者肺泡灌洗液中檢出肺孢子菌DNA以來，PCR方法因具備特異、敏感和簡便等優(yōu)勢在Pc檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。檢測的標(biāo)本可為支氣管肺泡灌洗液、呼吸道分泌物、外周血單核細(xì)胞、血清、環(huán)境樣本等。引物設(shè)計大多為針對18S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、二氫葉酸合成酶基因、線粒體大亞基rRNA基因、主要表面糖蛋白基因等進(jìn)行設(shè)計，較常用的為線粒體大亞基rRNA基因，根據(jù)其序列設(shè)計的引物特異性和敏感性均很好[33-36]。在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展了一些新的PCR檢測方法，如毛細(xì)管PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR等，與常規(guī)PCR相比具備更高的靈敏度和特異性。

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)是一種新的核酸擴增方法，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，在恒溫水浴(65 ℃左右)反應(yīng)30～60 min即可完成擴增。楊秋林等[37]選取Pc mtrRNA序列作為LAMP擴增靶序列，設(shè)計引物進(jìn)行擴增，顯示具有良好的特異性，敏感性比PCR更高。該方法對儀器設(shè)備要求不高，可直接通過肉眼觀察反應(yīng)沉淀即可對結(jié)果作出判定，因而具有良好的應(yīng)用前景和基層推廣價值。LAMP操作過程中極易出現(xiàn)氣溶膠污染，實際操作時要嚴(yán)加小心。另外，核酸分子雜交技術(shù)(包括Southern雜交、斑點雜交、Northern雜交和原位雜交等)因具備較高的敏感性和特異性，也被用作傳統(tǒng)染色法的補充手段。

近年來對肺孢子菌開展了大量種內(nèi)基因分型研究[38-42]，分型遺傳標(biāo)志主要包括：核內(nèi)rRNA基因(常用的有16S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、26S rRNA基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因等)、線粒體大亞基rRNA基因(mtLSUrRNA)、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、細(xì)胞色素B(CYB)、β-微管蛋白基因等。對于研究肺孢子菌的傳播途徑、種屬特異性、生物學(xué)特性，鑒別不同來源和種型的肺孢子菌及指導(dǎo)臨床合理用藥等方面發(fā)揮了重要作用。

綜上，目前尚缺乏理想的診斷技術(shù)。病原學(xué)染色法特異性強，是唯一能直接觀察到菌體的方法，但操作繁瑣、敏感性低。PCR方法敏感快捷，可作為傳統(tǒng)染色法的補充，但受引物設(shè)計、反應(yīng)條件、人員操作等環(huán)節(jié)的影響，易造成假陽性。因此在規(guī)范試劑、環(huán)境以及人員操作流程的前提下，PCR方法可用于快速診斷和初步篩查。為提高檢測效率，我們認(rèn)為實際工作中應(yīng)結(jié)合病例的情況，選擇合適的檢測方法進(jìn)行多角度綜合判定。

5 結(jié)語

肺孢子菌作為一種機會性致病因子，廣泛分布于自然界，不僅嚴(yán)重危害實驗動物健康，對公共衛(wèi)生也構(gòu)成重大威脅。當(dāng)前全球?qū)嶒瀯游餀C構(gòu)已普遍將其納入動物質(zhì)量監(jiān)控列表。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14922.1-2001《實驗動物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)》將其列為清潔級實驗大鼠、小鼠必要時檢測項目，清潔級兔必須檢測的寄生蟲項目。該版國家標(biāo)準(zhǔn)是在1994年版GB 14922.1-1994《實驗動物微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)》基礎(chǔ)上進(jìn)行修訂的，將舊版標(biāo)準(zhǔn)中寄生蟲學(xué)和微生物學(xué)兩部分進(jìn)行拆分，各自形成獨立的標(biāo)準(zhǔn)。但新修訂的國家標(biāo)準(zhǔn)中該項目仍歸屬于寄生蟲檢測項目，仍使用舊名“卡氏肺孢子蟲”。病原體的命名和分類歸屬重新劃分具有重要意義，筆者認(rèn)為目前肺孢子菌已明確屬于真菌而非原蟲，建議將中文名稱改為“卡式肺孢子菌”更為妥當(dāng)，將其從實驗動物寄生蟲學(xué)標(biāo)準(zhǔn)移至實驗動物微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)中的相應(yīng)位置更為科學(xué)，以免造成混亂。實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)作為整個行業(yè)最基本的綱領(lǐng)和通用要求，應(yīng)尊重科學(xué)，做到與時俱進(jìn)，動態(tài)發(fā)展，結(jié)合實情適時修訂完善，這對于推動整個行業(yè)的發(fā)展具有積極的引領(lǐng)和促進(jìn)作用。