CRISP1在性腺中的定位和表達(dá)及其生殖調(diào)節(jié)功能的研究進(jìn)展

黃小烜，羅金，穆楊，徐望明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

哺乳動(dòng)物精子在進(jìn)入雌性生殖道后，需要經(jīng)歷獲能、頂體反應(yīng)、精卵質(zhì)膜融合等一系列事件才能使卵子受精，隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多在受精過程中起到關(guān)鍵作用的分子，其中就包括富含半胱氨酸分泌蛋白1(cysteine-rich secretory protein 1，CRISP1)[1]。有大量的體外實(shí)驗(yàn)和基因敲除模型研究顯示，附睪內(nèi)的CRISP1參與了精子獲能、精子-透明帶結(jié)合及精卵融合的調(diào)控[2-4]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，CRISP1被認(rèn)為是目前在避孕干預(yù)中一個(gè)具有前景的靶點(diǎn)，有望在此基礎(chǔ)上開發(fā)出安全有效且可逆的男性避孕疫苗[5]。本文就CRISP1在不同物種性腺中的定位、表達(dá)研究成果及其在精子獲能、精子-透明帶結(jié)合及精卵融合等生殖調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行綜述。

一、CRISP1的表達(dá)及定位

Cameo等[6]最早在1976年通過聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)了僅由大鼠附睪分泌的蛋白CRISP1，這種蛋白有兩種形式，被分別稱為D蛋白和E蛋白，其由附睪頭部近端的上皮細(xì)胞以雄激素濃度依賴性方式合成，并分泌到附睪管腔中[7]。人CRISP1由Hayashi等[8]于1996年發(fā)現(xiàn)，與嚙齒動(dòng)物CRISP1有一定的相似性。目前對(duì)CRISP1的研究大部分仍集中于嚙齒動(dòng)物，而對(duì)人CRISP1探索較少。

精子在附睪成熟的過程中，CRISP1與精子表面結(jié)合，在精子進(jìn)入雌性生殖道后發(fā)揮作用[7]。在對(duì)大鼠的研究中，CRISP1最初定位于精子頭部頂體區(qū)域，隨著頂體反應(yīng)的發(fā)生，兩種形式的蛋白定位會(huì)發(fā)生改變：分子量較大的D蛋白以松散、可逆的方式結(jié)合在精子表面，當(dāng)精子離開附睪進(jìn)入雌性生殖道后，D蛋白會(huì)從精子表面釋放；而分子量較小的E蛋白同精子表面緊密結(jié)合，隨著頂體反應(yīng)的發(fā)生E蛋白仍結(jié)合在精子表面，并遷移到精子頭部的赤道板區(qū)域[9]。CRISP1與精子結(jié)合的機(jī)制仍然未知，但有研究顯示Zn2+能與CRISP1形成CRISP1-Zn2+復(fù)合物并參與CRISP1與精子在附睪成熟過程中的松散結(jié)合，而CRISP1與精子的緊密結(jié)合機(jī)制被認(rèn)為可能與附睪小體有關(guān)[7]。但CRISP1與精子結(jié)合的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

隨著對(duì)CRISP1研究的深入，可以發(fā)現(xiàn)，CRISP1的表達(dá)及定位在不同物種之間有差異。對(duì)絨山羊CRISP1在睪丸和頂體反應(yīng)前后的精子表面定位的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)CRISP1在絨山羊睪丸組織中廣泛表達(dá)，但主要集中在生精小管內(nèi)側(cè)中央?yún)^(qū)，晚期精子細(xì)胞富集區(qū)域；CRISP1在精子表面的定位也隨著頂體反應(yīng)的發(fā)生而改變，但頂體反應(yīng)前CRISP1主要定位于精子尾部與頭部的連接處，頂體反應(yīng)后CRISP1主要定位于精子頭部的赤道板區(qū)域[10]。對(duì)于CRISP1在人性腺組織中的表達(dá)及定位，各項(xiàng)研究結(jié)果并不一致，有研究顯示人CRISP1只在附睪分泌[11]，而另一個(gè)研究顯示在人類輸精管和精囊中也有CRISP1基因的表達(dá)[12]。另外，與大鼠CRISP1僅由附睪頭部近端的上皮細(xì)胞分泌不同，Leir等[13]對(duì)成人附睪上皮細(xì)胞以附睪頭部、體部和尾部分段進(jìn)行了原代培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，附睪頭部、體部和尾部均有CRISP1的表達(dá)，且各部分表達(dá)量相當(dāng)。

二、CRISP1的功能

CRISP家族蛋白有三個(gè)潛在功能結(jié)構(gòu)域：N末端的PR結(jié)構(gòu)域、C末端的ICR結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域，ICR結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域也被合稱為CRD結(jié)構(gòu)域[14]。PR結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)CRISP1參與精卵融合，CRD結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)CRISP1的抑制獲能功能[15]。

1.調(diào)節(jié)精子獲能：精子獲能是哺乳動(dòng)物受精的重要步驟，而酪氨酸磷酸化是獲能最重要的過程之一[16]。有研究顯示，在大鼠中CRISP1以濃度依賴性方式抑制酪氨酸磷酸化，從而抑制精子獲能，這種抑制作用是可逆的，可以通過外源性cAMP來克服，表明CRISP1等可能通過控制精子質(zhì)膜表面的某些離子通道，在獲能早期產(chǎn)生抑制作用[17]。有研究顯示，CRISP1以濃度依賴性方式瞬時(shí)結(jié)合于精子表面，在與其抑制獲能活性一致的濃度范圍內(nèi)，這種結(jié)合是飽和的[18]，這也證實(shí)了CRISP1抑制精子獲能的濃度依賴性。Da等[19]對(duì)小鼠進(jìn)行CRISP1基因敲除，顯示獲能期間在突變體精子中酪氨酸磷酸化水平明顯低于對(duì)照組。而最近Hu等[20]對(duì)小鼠進(jìn)行基因敲除后，結(jié)果顯示僅CRISP1缺陷并沒有改變獲能精子的百分比及酪氨酸磷酸化水平。有研究者認(rèn)為產(chǎn)生這種差異的原因可能是實(shí)驗(yàn)小鼠遺傳背景不同導(dǎo)致了生殖表型不同[21]。CRISP1對(duì)精子獲能產(chǎn)生的影響可能還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.參與精卵間相互作用：對(duì)CRISP1基因敲除小鼠進(jìn)行體外受精的檢測(cè)中，突變體精子穿過透明帶完整或無透明帶的卵子的能力顯著降低，表明在缺乏CRISP1的情況下，精子穿過透明帶和與卵融合的能力降低[19-20]。在大鼠中，如前述，兩種形式的CRISP1，E蛋白與D蛋白的作用機(jī)制不同，E蛋白會(huì)隨著頂體反應(yīng)的發(fā)生，定位到精子頭部的精卵融合區(qū)域上，參與精卵融合[2]。CD9是已知的卵細(xì)胞膜上介導(dǎo)精卵融合的精子結(jié)合位點(diǎn)[22-23]，有研究顯示在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，CRISP1能與CD9相互作用，促進(jìn)精卵融合，但具體作用機(jī)制仍不明確[24]。此外，CRISP1也參與了精子與透明帶的結(jié)合，且作用在結(jié)合的初始階段[7]。CRISP1參與精卵間相互作用的過程可以概括為：位于精子頂體區(qū)域的CRISP1與透明帶結(jié)合，誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，緊密結(jié)合于精子表面的CRISP1(E蛋白)遷移到精子頭部的赤道板區(qū)域，通過與卵子表面的精子受體結(jié)合，啟動(dòng)精卵融合。

對(duì)人CRISP1功能的研究顯示，將人精子與抗CRISP1抗體共同孵育一段時(shí)間后，人精子穿透?jìng)}鼠卵子的能力顯著降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性，而抗CRISP1抗體對(duì)人精子的活力、頂體反應(yīng)的發(fā)生及精子與倉(cāng)鼠卵的結(jié)合并無顯著影響，CRISP1可能通過與人卵子表面的特異性CRISP1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合參與精卵融合[4]。有研究顯示，CRISP1能通過與人類重組蛋白ZP3以濃度依賴性方式相互作用參與到精子-透明帶結(jié)合的起始階段[25]，ZP3是透明帶上與人精子結(jié)合的最主要位點(diǎn)[26]，因此，同嚙齒動(dòng)物一樣，CRISP1既參與了精卵融合，也參與了精子-透明帶結(jié)合。CRISP1在人受精過程中的這些功能被認(rèn)為是與精子緊密結(jié)合的CRISP1部分的功能[27]，而與精子松散結(jié)合可溶于精漿的CRISP1在精液中的作用仍有待確定。

3.調(diào)節(jié)精子的運(yùn)動(dòng)及方向：近年來有對(duì)基因敲除小鼠的研究顯示CRISP1也存在于雌性配子中，由卵丘細(xì)胞表達(dá)，并可以通過抑制精子的過度活化和增強(qiáng)精子的線性泳動(dòng)來調(diào)節(jié)精子的運(yùn)動(dòng)及方向[28]。最新的研究顯示，CRISP1基因敲除小鼠的精子運(yùn)動(dòng)速度會(huì)下降[20]。

4.可作為無精子癥的診斷標(biāo)志物：有研究發(fā)現(xiàn)，梗阻性無精子癥患者精液中CRISP1水平顯著低于非梗阻性無精子癥患者精液和正常精液中CRISP1水平，研究者認(rèn)為男性生殖道任何部位的梗阻都可能導(dǎo)致精液中CRISP1水平的降低，因此CRISP1對(duì)于區(qū)分梗阻性和非梗阻性無精子癥有相當(dāng)大的診斷能力，可作為不同類型無精子癥的診斷標(biāo)志物[29]。

三、CRISP1作為避孕的靶點(diǎn)

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于CRISP1的研究，在動(dòng)物試驗(yàn)中主要研究了CRISP1的表達(dá)定位及其在受精過程中的作用，結(jié)果表明CRISP1滿足作為避孕靶點(diǎn)的許多必要條件：①它是附睪特異性蛋白；②影響生育力；③它在精子獲能及精卵融合中起特定作用；④它的活性位點(diǎn)已被鑒定；⑤人類生殖道也具有同源的CRISP1[30]。有研究顯示，用天然或重組大鼠CRISP1對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，在超過90%的動(dòng)物中產(chǎn)生了針對(duì)CRISP1的特異性抗體，并且這種抗體對(duì)動(dòng)物生育力的抑制作用是可逆的[7]。本課題組前期構(gòu)建的pcDNA-mCRISP1 DNA疫苗，使免疫后的雌/雄性小鼠均產(chǎn)生了特異性的抗體，并誘導(dǎo)一定的抗生育反應(yīng)[31-32]。進(jìn)一步的研究表明，免疫產(chǎn)生的小鼠CRISP1特異性抗體對(duì)正常雄性小鼠附睪精子的活動(dòng)力和存活率、自發(fā)或誘發(fā)頂體反應(yīng)發(fā)生率無顯著影響，也不會(huì)引起精子的凝集反應(yīng)及影響精卵黏附，但當(dāng)抗體濃度達(dá)到一定水平時(shí)，受精率會(huì)顯著下降，也說明小鼠CRISP1抗體特異性地作用于精卵融合階段，導(dǎo)致生育力的下降[17]。然而，與其他研究中的發(fā)現(xiàn)一樣，CRISP1缺陷并不能導(dǎo)致男性完全不育[33]，mCRISP1 DNA疫苗僅能使免疫小鼠生育力下降40%～50%[31]。為了增強(qiáng)疫苗效果，在后續(xù)研究中，我們使用了殼聚糖-DNA納米顆粒作為載體，顯著提高了mCRISP1 DNA避孕疫苗的免疫效應(yīng)[34-35]，雖然小鼠的生育力仍然沒有被完全阻斷，但為進(jìn)一步開發(fā)出高效、安全、經(jīng)濟(jì)的避孕疫苗奠定了基礎(chǔ)。

四、結(jié)語(yǔ)

綜上，在動(dòng)物研究中已經(jīng)確定CRISP1參與了受精過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，但其中的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。近年的研究顯示了CRISP1也對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)及方向有調(diào)節(jié)作用，并提出雌性配子中也存在CRISP1。不僅不同物種之間CRISP1的表達(dá)及定位有差異，人體中CRISP1是否是僅由附睪特異性表達(dá)也無定論。因此，我們還需要對(duì)CRISP1的表達(dá)定位方面進(jìn)行全面的研究。此外，目前對(duì)人CRISP1功能的研究尚少且有爭(zhēng)議，增加對(duì)人CRISP1功能方面的研究是有意義的。以CRISP1為靶點(diǎn)的避孕疫苗安全且可逆，是我們以后研究的重點(diǎn)。因此，CRISP1對(duì)生育力的影響及作用機(jī)制值得我們進(jìn)一步深入研究。