高密度發(fā)酵乳酸菌抗凍性影響因素分析

嚴(yán)濤，朱建國(guó)，姜甜，陳珂可，方曙光

（江蘇微康生物科技有限公司 江蘇蘇州 215200）

乳酸菌作為益生菌種類之一，其益生功效被廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥和食品等行業(yè)中。其生產(chǎn)工藝中真空冷凍干燥是其制備工藝中的主要環(huán)節(jié)之一，其乳酸菌的抗凍性直接影響凍干粉活菌數(shù)水平，其冷凍干燥工藝，甚至前期的高密度乳酸菌發(fā)酵工藝條件都會(huì)影響乳酸菌的抗凍性[1]，而發(fā)酵工藝條件對(duì)乳酸菌的抗冷凍性的影響很容易被研究學(xué)者所忽視[2]。不同種類的乳酸菌，其抗凍能力大小不盡相同，但是其抗凍過(guò)程中的相關(guān)機(jī)理基本是一致的[3]。本文從發(fā)酵過(guò)程中的培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH值、保護(hù)劑、凍干工藝等因素對(duì)乳酸菌抗凍性的影響進(jìn)行分析，為提高乳酸菌的抗凍性，進(jìn)而提高其凍干粉活菌數(shù)水平提供新的思路。

1 高密度乳酸菌發(fā)酵工藝對(duì)其抗凍性的影響

1.1 培養(yǎng)基的組分及含量對(duì)其抗凍性的影響

培養(yǎng)基的組分中碳氮源是主要的影響因素，它們可以對(duì)菌體細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量產(chǎn)生影響，選擇合適的碳源，可以增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，而其含量的多少與細(xì)胞膜的流動(dòng)性成正比，因此可以提高菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使菌體呈現(xiàn)不同程度的抗凍性，使菌體在凍干后的活菌數(shù)得到很大提高[4-8]。培養(yǎng)基中的碳氮源除了會(huì)影響乳酸菌細(xì)膜中的不飽和脂肪酸含量外，不同種類的氮源及碳源還會(huì)使乳酸菌的形態(tài)發(fā)生改變，改變其菌體對(duì)周圍環(huán)境的抗性。Shao Yuyu 等[9]在常用的乳酸菌（De Man，Rogosa and Sharp，MRS）培養(yǎng)基上，額外添加酵母浸膏，其保加利亞乳桿菌ND02的菌體長(zhǎng)度是未添加的2倍，菌體表面積的增加，會(huì)增大在冷凍過(guò)程中形成的冰晶對(duì)菌體細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，進(jìn)而導(dǎo)致保加利亞乳桿菌大量死亡。不同的碳氮源，會(huì)影響乳酸菌的代謝途徑，進(jìn)而產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。而有些代謝產(chǎn)物的積累也會(huì)對(duì)乳酸菌抗冷凍性產(chǎn)生一定的影響[10]。例如在含有蔗糖或果糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的腸膜明串珠菌，其代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生甘露醇，這種代謝產(chǎn)物可以維持乳酸菌在低水分下的活性，而且還能起到抗氧化的作用[11]；同樣對(duì)于海藻糖，當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有速效碳源（如葡萄糖）時(shí)，其作為培養(yǎng)基成份之一會(huì)被乳酸菌作為碳源利用，其代謝產(chǎn)物，如乳酸，反而會(huì)使菌體周圍環(huán)境pH值降低，影響菌體內(nèi)外的離子平衡，進(jìn)而使其死亡率增加[12]。另外研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳酸菌在含有某些特定碳水化合物的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，其經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生的胞外多糖也能提高乳酸菌的抗凍性[13]。

在培養(yǎng)基中添加鈣離子時(shí)，其鈣離子可與乳酸菌在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸及其它酸進(jìn)行中和，生成乳酸鈣鹽，減緩pH值下降的程度，降低因過(guò)酸對(duì)乳酸菌菌體生長(zhǎng)造成影響。冷凍干燥過(guò)程中，菌體內(nèi)由液體狀態(tài)變?yōu)楸顟B(tài)，菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，其鈣離子的存在可以使不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值增大，而其比值越大，則乳酸菌的抗冷凍能力越強(qiáng)[14]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌為厭氧或兼性厭氧菌，對(duì)氧自由基比較敏感，而錳離子的存在能與超氧化物歧化酶結(jié)合，穩(wěn)定其酶的結(jié)構(gòu)，保障酶的催化活性，從而提高其低溫不利條件下乳酸菌的活性，對(duì)乳酸菌的抗凍性能有一定的促進(jìn)作用[15]。因此，培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)慕饘匐x子，可增加不飽和脂肪酸的含量，提高乳酸菌抗氧性能，進(jìn)而提升其菌體的抗凍性。添加適量的吐溫-80可增加乳球菌和乳桿菌菌體細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量[16]，增加低溫狀態(tài)下細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高乳酸菌的抗凍性能。如果培養(yǎng)基中同時(shí)添加鈣離子與吐溫-80，則更能有效提升其菌體的抗凍性能。

以上研究表明，培養(yǎng)基中不同的氮源、碳源對(duì)不同菌抗凍性能影響不同，動(dòng)物來(lái)源的氮源可提升菌體的抗凍性，采用合適的氮源、碳源可使菌體產(chǎn)生可保護(hù)菌體的抗凍代謝產(chǎn)物，添加海藻糖，需要考慮其被代謝后產(chǎn)酸對(duì)菌體的影響，因此其添加量一定要控制在的合理范圍內(nèi)。在乳酸菌的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成份改變過(guò)程中，以發(fā)酵液活菌數(shù)作為最基本的參考指標(biāo)，同時(shí)更重要的是要考慮在該種培養(yǎng)基下培養(yǎng)得到的乳酸菌對(duì)其在后期真空冷凍干燥過(guò)程中抗凍性的影響，以得到一個(gè)即經(jīng)濟(jì)又實(shí)用的培養(yǎng)基配方。

1.2 乳酸菌的生長(zhǎng)溫度對(duì)其抗凍性的影響

乳酸菌在高密度發(fā)酵時(shí)，其生長(zhǎng)溫度的高低也會(huì)影響菌體細(xì)胞膜脂肪酸的含量，進(jìn)而對(duì)乳酸菌的抗凍性產(chǎn)生影響。大多數(shù)乳酸菌在低于最適溫度3℃～5℃時(shí)，會(huì)提高菌體膜內(nèi)不飽和脂肪酸C18∶2的含量，其細(xì)胞膜的流動(dòng)性也相應(yīng)增強(qiáng)，最終提高其抗冷凍能力，但需要把握好溫度的變化，不能過(guò)低，否則不利于菌體生長(zhǎng)[17]。低溫還會(huì)促進(jìn)某些乳酸菌多糖合成，從而提高其冷凍干燥存活率[18]。在30、35、37℃分別發(fā)酵培養(yǎng)嗜酸乳桿菌RD758與CRL640、棒狀乳桿菌Si3及保加利亞乳桿菌L2時(shí)，通過(guò)比較冷凍前后凍干存活率的情況可知，在30℃發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)其抗凍能力最強(qiáng)，凍干存活率高達(dá)67%，相比之前提高30%，而嗜熱鏈球菌在30℃培養(yǎng)所產(chǎn)生的胞外多糖比在37℃的高2倍～5倍，而這種多糖物質(zhì)對(duì)乳酸菌抗凍性有明顯的提升作用[18]。因此，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，可改變膜內(nèi)不飽和脂肪酸的含量，在凍干時(shí)有利于提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性；同時(shí)還能促進(jìn)乳酸菌的多糖合成，提升乳酸菌的抗凍性。

1.3 發(fā)酵過(guò)程中恒定pH值對(duì)乳酸菌抗凍性的影響

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中pH值的控制也會(huì)對(duì)其抗凍性產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)不同的乳酸菌（球菌、桿菌等）其發(fā)酵pH值對(duì)抗凍性有明顯區(qū)別，研究發(fā)現(xiàn)乳球菌在pH值為6.0的發(fā)酵培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)比較適合；而乳桿菌則適合在pH值為5.0的發(fā)酵培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。主要原因還是不同pH值會(huì)增加細(xì)胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸的含量，提高菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性，進(jìn)而提高其抗凍性能[19]；過(guò)酸過(guò)堿也不利于菌體的生長(zhǎng)。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)[20]不同恒定pH值會(huì)對(duì)其菌體形態(tài)產(chǎn)生影響，保加利亞乳桿菌ND02在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)在恒定pH值由5.7到5.0的普通MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，其菌體形態(tài)由細(xì)長(zhǎng)形變成短粗狀，而形態(tài)呈短粗狀時(shí)，其凍干存活率優(yōu)于細(xì)長(zhǎng)形。因此，針對(duì)不同的乳酸菌需控制其相適應(yīng)的發(fā)酵pH值，在相應(yīng)的發(fā)酵pH值條件下培養(yǎng)，可影響菌體膜內(nèi)脂肪酸的含量，改變菌體形態(tài)，進(jìn)而提升其菌體的抗凍能力。

1.4 發(fā)酵過(guò)程中的中和劑對(duì)乳酸菌抗凍性的影響

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中，由于其菌體的生長(zhǎng)，影響培養(yǎng)基中pH值變化的代謝產(chǎn)物主要以乳酸為主，當(dāng)然也有其它酸（如乙酸、甲酸等），其過(guò)低的pH值會(huì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生反饋抑制。因此，在發(fā)酵過(guò)程中需要通過(guò)中和劑來(lái)中和酸性物質(zhì)，維持培養(yǎng)基中pH值的恒定，保證其菌體的最佳生長(zhǎng)環(huán)境。中和劑一般呈堿性，如碳酸鈉、氨水、氫氧化鈉等，使用濃度（質(zhì)量體積比）一般為20%～30%。由于氨水能游離出NH4+，其容易透過(guò)細(xì)胞壁，刺激菌體生長(zhǎng)，提高發(fā)酵液活菌數(shù)水平，進(jìn)而提高凍干后菌粉的活菌數(shù)水平，比較適合作為酸堿中和劑[21]；但張興昌等[22]研究嗜熱鏈球菌ND03時(shí)，發(fā)現(xiàn)采用30%碳酸鈉作為中和劑比25%氨水節(jié)約20 mL，而且碳酸鈉作為中和劑，其與酸中和后，會(huì)產(chǎn)生CO2，形成厭氧環(huán)境，而乳酸菌基本大部分屬于兼性偏厭氧生長(zhǎng)，為厭氧乳酸菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造較適宜的環(huán)境。綜上所述，乳酸菌在生長(zhǎng)時(shí)代謝產(chǎn)生的酸使環(huán)境pH值降低，從而影響其生長(zhǎng)的最佳環(huán)境。在生長(zhǎng)過(guò)程中，添加適當(dāng)?shù)乃釅A中和劑維持恒定的pH值，更有利于維持乳酸菌的生長(zhǎng)最佳環(huán)境，進(jìn)而提高凍干后菌粉活菌數(shù)水平。

1.5 乳酸菌菌體的收獲時(shí)期對(duì)其抗凍性的影響

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中，其菌體生長(zhǎng)會(huì)經(jīng)過(guò)延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期。不同的菌體收獲期對(duì)其活菌數(shù)有顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)菌體在發(fā)酵培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期初期后經(jīng)過(guò)離心、乳化、凍干收獲得到的菌體存活率較對(duì)數(shù)期中期收獲的菌體存活率高8倍[23]。乳酸乳球菌DRC-2與DRC-2C在對(duì)數(shù)期存活率較低，分別為28.5%和34.7%，而穩(wěn)定期存活率達(dá)到60%和61.2%，提高了 2 倍～3 倍[24]。Rault等[25]在研究時(shí)發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌CFL1在穩(wěn)定期收獲的菌體其抗冷凍性好于其對(duì)數(shù)期；Ampatzoglou等[26]在研究鼠李糖乳桿菌LGG時(shí)發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定期收獲的菌體其抗凍性要優(yōu)于對(duì)數(shù)期；Louesdon等[27]對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌RO175的研究，也表明穩(wěn)定時(shí)期收獲的菌體經(jīng)過(guò)凍干后，其抗冷凍干燥性能要優(yōu)于對(duì)數(shù)期。

之所以在穩(wěn)定期收獲的菌體其抗凍性要優(yōu)于對(duì)數(shù)期，是因?yàn)樘幵诜€(wěn)定期的菌株因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的改變（低物的累積、pH值的改變等）、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，使其菌體生長(zhǎng)與死亡處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生一系列適應(yīng)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，提高了其對(duì)不良環(huán)境的抗性[28]，如穩(wěn)定期時(shí)其細(xì)胞膜脂類成分（環(huán)丙烷化脂肪酸（cycC19∶0）含量增加）發(fā)生改變，從而增強(qiáng)乳酸菌的抗冷凍干燥能力[29-30]。另外在穩(wěn)定期時(shí)，其乳酸菌的應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)上也發(fā)生了劇烈變化，導(dǎo)致其對(duì)冷凍干燥等不利條件的抗性增加[31]。當(dāng)然也有例外，如袁杰利等[32]分別對(duì)處在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期收獲的布氏乳桿菌R1102進(jìn)行抗冷凍干燥存活試驗(yàn)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間沒(méi)有顯著性差異，可能是不同菌株之間發(fā)酵培養(yǎng)的差異所造成的[33]。綜上所述，處在穩(wěn)定生長(zhǎng)期的乳酸菌其抗冷凍干燥性能要強(qiáng)于其他生長(zhǎng)時(shí)期階段，同時(shí)也要考慮到菌株間的差異性。

1.6 高密度發(fā)酵乳酸菌結(jié)束后的處理對(duì)其抗凍性的影響

乳酸菌發(fā)酵結(jié)束后，可通過(guò)調(diào)整發(fā)酵液pH值、添加特定物質(zhì)等方式來(lái)提高其抗凍性。有研究發(fā)現(xiàn)將嗜熱鏈球菌ND03發(fā)酵終點(diǎn)的pH值由5.8調(diào)至6.6，離心、乳化、凍干后所得到的菌體存活率大大提升[34]。張中青等[35]研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵結(jié)束后的保加利亞乳桿菌ATCC11842的發(fā)酵液中添加滅菌過(guò)的2%（質(zhì)量體積比）氯化鈉溶液，37℃，100 r/min條件下培養(yǎng)2 h后，收集菌體與保護(hù)劑進(jìn)行乳化、冷凍干燥后，其凍干存活率達(dá)到65%，是未處理的1.43倍。究其原因是氯化鈉的刺激，改變了細(xì)胞內(nèi)輔因子水平，使菌體胞內(nèi)磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）活性增加了31.4%，提高酶的活性，將冷凍干燥對(duì)乳酸菌帶來(lái)的損傷降至最低，從而提高乳酸菌的凍干存活率[36]。因此，發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)對(duì)發(fā)酵pH值的調(diào)整，或添加特定物質(zhì)，有利于提高菌體產(chǎn)酸活力水平，間接提高某些激酶的活性，進(jìn)而提高菌體的凍干存活率。

2 高密度乳酸菌發(fā)酵保護(hù)劑/凍干對(duì)乳酸菌的抗凍性的影響

2.1 保護(hù)劑對(duì)乳酸菌的抗凍性的影響

凍干保護(hù)劑對(duì)乳酸菌的凍干存活率有著直接的影響，因此乳酸菌的菌泥在凍干前與適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑乳化混合后凍干，可提高乳酸菌的存活率。保護(hù)劑的作用效果與其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量大小密切相關(guān)。在冷凍干燥和保存中，不同的物質(zhì)如糖類（蔗糖、乳糖和海藻糖）、蛋白質(zhì)化合物（脫脂牛奶）、氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）和抗氧化劑（抗壞血酸）已被作為保護(hù)劑來(lái)提高乳酸菌的存活率[37]。凍干保護(hù)劑大致可分為兩種：一是小分子量化合物。如氨基酸類、有機(jī)酸、低分子的糖類和糖醇類等，這些小分子物質(zhì)都能透過(guò)乳酸菌的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抑制冰晶生成、減緩冰晶生長(zhǎng)，冷凍時(shí)可減少對(duì)菌體的傷害；二是大分子物質(zhì)。如蛋白質(zhì)、多糖、聚乙烯吡咯烷酮和其他的合成聚合物等[38]，這些大分子物質(zhì)不能穿透乳酸菌細(xì)胞膜，由于其具有較強(qiáng)的親水特性和氫鍵形成能力，其附著在菌體表面，形成穩(wěn)定的水分子層，阻止細(xì)胞膜內(nèi)結(jié)合水向外轉(zhuǎn)移，保護(hù)了菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)。不同的保護(hù)劑物質(zhì)種類搭配，可減少冷凍干燥對(duì)菌體的損傷，提高菌體的抗凍性，進(jìn)而對(duì)乳酸菌的凍干存活率有顯著提升，在保護(hù)劑中，碳水化合物類、氨基酸類、肽和蛋白質(zhì)類應(yīng)用的最多。從目前的研究看，對(duì)乳酸菌菌體的凍干脫水方面具有顯著保護(hù)作用的是碳水化合物類保護(hù)劑。其作用機(jī)理在于抑制膜脂的相變，即在乳酸菌菌體在凍干升華干燥脫水時(shí)，進(jìn)行“水置換”作用，使得在有碳水化合物保護(hù)劑存在的條件下，其干燥膜脂狀態(tài)與未脫水前生理特征相似[39]，從而穩(wěn)定其菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高凍干后菌體的存活率；脫脂牛奶中包含一個(gè)混合的大分子（乳清蛋白和酪蛋白）和糖類，脫脂牛奶可使凍干產(chǎn)品形成多孔結(jié)構(gòu)，更易再水合；在細(xì)胞膜脫水后，這些糖類物質(zhì)代替了結(jié)合水，防止蛋白質(zhì)通過(guò)氫鍵的顯露或集聚[40]，為乳酸菌提供良好的保護(hù)，故其可作為許多乳酸菌的保護(hù)劑[41]；脫脂乳可以通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜成分防止細(xì)胞損傷，提供了細(xì)胞蛋白保護(hù)層[42-43]。而各種保護(hù)劑搭配使用優(yōu)于單獨(dú)使用，需要將大分子和小分子物質(zhì)結(jié)合起來(lái)使用，才能更好的發(fā)揮其保護(hù)效果。

2.2 預(yù)冷凍速率對(duì)其抗凍性的影響

在凍干過(guò)程中，其凍干工藝，如預(yù)冷速率等也會(huì)影響菌體的凍干存活率。其中緩慢冷凍可以增加乳酸菌的抗凍性。原因是經(jīng)過(guò)預(yù)冷處理的乳酸菌，其菌體受低溫刺激，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生冷應(yīng)激蛋白，提高相關(guān)酶的低溫活性；此外，低溫會(huì)使菌體細(xì)胞膜上的飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變，增加菌體在低溫下細(xì)胞膜的流動(dòng)性。這些現(xiàn)象對(duì)乳酸菌后期的冷凍干燥抗凍性起著重要的積極保護(hù)作用[44]。另外，也有研究表明凍干時(shí)，其冷凍速率在5℃/min～180℃/min之間時(shí)，冷凍干燥時(shí)胞內(nèi)水分會(huì)完全滲出菌體外，菌體內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶，乳酸菌存活率較高；當(dāng)冷凍速率在180℃/min～5 000℃/min之間時(shí)，菌體內(nèi)的水分容易在外滲過(guò)程中形成結(jié)晶，進(jìn)而容易對(duì)菌體造成機(jī)械損傷；當(dāng)冷凍速率大于5 000℃/min時(shí)，胞內(nèi)水分來(lái)不及外滲而迅速形成結(jié)晶，細(xì)胞存活率會(huì)受一定的影響；因此在預(yù)凍時(shí)，需要根據(jù)不同菌體的特性來(lái)調(diào)整其冷凍速率，以達(dá)到最佳冷凍存活率[44]。

3 小結(jié)

真空冷凍干燥是乳酸桿菌菌粉制備工藝中的重要環(huán)節(jié)之一，菌體在冷刺激下會(huì)發(fā)生一系列改變，例如細(xì)胞膜的變化、遺傳物質(zhì)的變化等，本文從發(fā)酵工藝、發(fā)酵后處理、保護(hù)劑及凍干工藝等因素對(duì)乳酸菌的抗凍影響進(jìn)行了分析，其培養(yǎng)基成份、培養(yǎng)基溫度、發(fā)酵pH值、保護(hù)劑及凍干工藝等因素都會(huì)對(duì)乳酸菌的凍干性能產(chǎn)生影響，針對(duì)不同菌株的特性需要采用不同的控制條件，而且不同因素之間也存在一定的聯(lián)系，把握好各個(gè)影響因素之間的關(guān)系，也是提高乳酸桿菌抗凍性的關(guān)鍵之一。目前對(duì)乳酸菌的抗凍性的研究停留在宏觀研究水平（如培養(yǎng)基、溫度、pH值等），而微觀水平（菌株代謝、菌體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換、菌株的差異性等）研究的還不夠深入，乳酸菌的抗凍性是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，仍需在今后對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步深入的研究。