生物酶解法去除大豆蛋白抗原性研究進(jìn)展

王章存,袁路陽,張 露,胡金強(qiáng),安廣杰,王 佩

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450001;2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450001)

大豆蛋白是來源豐富的植物蛋白,其氨基酸組成與人體蛋白十分接近,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。大豆蛋白具有優(yōu)良的溶解、乳化和發(fā)泡等加工性能,在食品生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。然而,大豆含有多種引起人體過敏的抗?fàn)I養(yǎng)成分,被列為世界八大致敏食物之一[1-2],其主要成分是蛋白質(zhì),目前已從大豆中確認(rèn)出38種抗原蛋白[3]。大豆蛋白主要引起人或動(dòng)物發(fā)生IgE介導(dǎo)的Ⅰ型速發(fā)型過敏反應(yīng),還會(huì)導(dǎo)致人體和動(dòng)物毛細(xì)血管滲透性增加、血漿蛋白漏入腸腔、腸黏膜水腫、細(xì)胞脫顆粒釋放組胺、前列腺素等[4-5]。大豆過敏患者臨床癥狀大多表現(xiàn)為過敏性皮炎,有些可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重失水甚至死亡[6-7]。人體一旦出現(xiàn)大豆過敏反應(yīng),目前尚無有效的治療方法。因此,降低或者消除大豆蛋白的抗原性是食品安全中的重要課題,受到科技和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注。

熱處理是食品加工中最常用的方法,但加熱并不能有效降低大豆蛋白的致敏性[8]。高壓處理也未獲得滿意的效果[9-11]。酸、堿等化學(xué)處理往往使大豆蛋白大分子降解為小分子,其乳化、發(fā)泡等功能性質(zhì)大大降低,而且酸法水解對設(shè)備要求較高,容易造成環(huán)境污染。生物酶解法可以通過不同酶制劑進(jìn)行選擇性酶解,被認(rèn)為是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[12],而且合適的酶解條件還可保持甚至改善大豆蛋白的乳化、發(fā)泡等物化性質(zhì),賦予大豆蛋白新的加工性能[13-14]。因此,近年來生物酶解法改性降低大豆蛋白抗原性的研究受到人們的廣泛關(guān)注。本文在介紹大豆抗原蛋白分子組成和結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)介紹生物酶解法降低大豆蛋白抗原性的研究進(jìn)展,希望為今后降低大豆蛋白抗原性的相關(guān)研究提供一定的參考價(jià)值。

1 大豆抗原蛋白的基本成分

大豆中的蛋白種類較多,根據(jù)沉降系數(shù)可分為2S、7S、11S和15S等四類組分。根據(jù)生理功能可分為生理活性蛋白和儲(chǔ)藏蛋白兩大類,其中生理活性蛋白主要包括血球凝集素、胰蛋白酶抑制劑、β-淀粉酶等,它們的含量較低且對熱敏感,一般的食品加熱過程即可滅去其活性;大豆儲(chǔ)藏蛋白包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白兩大類,其含量分別約占總蛋白40%和30%[15]。通常所說的11S和7S球蛋白主要是指這兩種蛋白質(zhì),它們是大豆中的主要抗原蛋白[16-18]。

大豆球蛋白(11S)是由六個(gè)亞基組成的六聚體寡蛋白,每個(gè)亞基由一個(gè)酸性多肽鏈(A鏈)與一條堿性多肽鏈(B鏈)通過二硫鍵連接形成。其中,酸性多肽包括Ala、A1b、A2、A3、A4和A5,分子量約為34.8 ku;堿性多肽包括B1a、B1b、B2、B3和B4,分子量約為19.6 ku[19]。

大豆β-伴球蛋白(7S)是由α、α′和β三種亞基組成的三聚體球蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)約有10種存在形式,其中有6種已經(jīng)被鑒定出來,分別是ααα,ααβ,αββ,ααα′,αα′β,α′ββ[20]。其中7S球蛋白中的Gly m Bd 28 K和Gly m Bd 30 K和Gly m Bd 60 K(β-伴球蛋白的α-亞基)是大豆中的主要致敏原[18]。β-伴大豆球蛋白的α-亞基能被25%大豆過敏患者的血清識(shí)別[21]。Krishnan 等[18]研究表明,β-伴大豆球蛋白的α-亞基、α′-亞基和β-亞基均為潛在的過敏原。Guo等[22]研究大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),α′-亞基具有免疫刺激能力并可誘發(fā)過敏反應(yīng)。

2 生物酶解法降低大豆蛋白抗原性的研究

2.1 酶解對大豆7S蛋白抗原性的影響

2.1.1 酶解降低大豆7S蛋白抗原性 Keum[23]等用胃蛋白酶水解大豆7S球蛋白,并用SDS-PAGE和酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)分析大豆蛋白分子和抗原性變化,發(fā)現(xiàn)7S球蛋白的亞基很快消失,其抗原性降低了50%以上。劉曉毅[24]等研究體內(nèi)蛋白酶的體外消化實(shí)驗(yàn),證明胃蛋白酶能有效降解7S組分,但是卻無法完全水解掉30 ku和28 ku成分。王俊[25]等用胃蛋白酶、胰蛋白酶水解β-伴大豆球蛋白,產(chǎn)生了分子量分別約為52、30、25 ku的抗酶解肽段;用大豆β-伴球蛋白致敏的兔子血清做免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明,這些肽段仍具有免疫活性,尤其是30 ku等肽段表現(xiàn)明顯[26]。王錦欣[27]等通過胃蛋白酶和黑曲霉生產(chǎn)的酸性蛋白酶聯(lián)合處理β-伴大豆球蛋白,可以將α′-和α-兩種亞基完全消除,但是β-亞基依然表現(xiàn)出較強(qiáng)的完整性和免疫活性。Zhao[28]等研究認(rèn)為,β-伴大豆球蛋白的β-亞基不易被胃蛋白酶水解,即使延長酶解時(shí)間或增加酶的用量也沒有明顯的酶解效果。黃婷[29]等用風(fēng)味蛋白酶處理大豆分離蛋白,并采用間接競爭ELISA法測定酶解產(chǎn)物中β-伴大豆球蛋白的抗原性,表明在水解30 min后,7S組分的α-、α′-和β-亞基有明顯的降解作用,生產(chǎn)了較小分子量的肽段,β-伴大豆球蛋白的抗原抑制率平均值達(dá)到21.79%。

Wang[30]等用堿性蛋白酶對豆粕處理10 min時(shí),β-伴球蛋白的α-、α′-及β-亞基幾乎完全清除,用ELISA試劑測定酶解物的抗原性僅剩余約4%;相比之下,用胰蛋白酶水解10 min時(shí),抗原性剩余約45%,即使酶解120 min時(shí)抗原性還剩余30%以上。用乳酸桿菌產(chǎn)生的蛋白酶對大豆分離蛋白水解,幾乎可以完全降解β-伴大豆球蛋白的3個(gè)亞基和大豆球蛋白的酸性、堿性肽鏈[31]。但該研究僅用電泳和反相色譜方法分析了酶解過程中大豆蛋白的分子組成,并未采用相應(yīng)的抗體反應(yīng)測定抗原性變化。

就目前的研究結(jié)果看,用動(dòng)物來源的蛋白酶水解時(shí),大豆β-伴球蛋白的β-亞基比其他亞基較難水解徹底,這也是大豆過敏者食用大豆蛋白或者大多數(shù)幼小動(dòng)物飼用大豆原料后,雖然經(jīng)過消化道酶解仍然發(fā)生過敏現(xiàn)象的原因;而用微生物或植物來源的蛋白酶水解大豆蛋白時(shí),β-亞基的變化和抗原性降低程度較明顯。

白小娟[32]等用風(fēng)味蛋白酶水解大豆分分離蛋白并用ELISA試劑法分析抗原性,發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?%、pH7.5、加酶量1000 U/g、在50 ℃酶解120 min、條件下,大豆蛋白抗原蛋白P34(7S的一種)的致敏性完全消除。鄭環(huán)宇[33]等將超高壓和風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合處理P34時(shí),將消除P34致敏性的酶解時(shí)間由120 min縮短到了60 min。Meinlschmidt[34]等發(fā)現(xiàn),大豆β-伴球蛋白經(jīng)400 MPa高壓處理后再用風(fēng)味蛋白酶水解,抗原消除率可達(dá)99.5%?？梢?兩種方法的結(jié)合對降低大豆蛋白抗原性有一定的協(xié)同效果。

趙巧麗[35]等以豆乳為原料用木瓜蛋白酶水解,在加酶量為3500 U/mL 酶解15 min 時(shí),β-伴球蛋白的α′-亞基被完全水解,抗原活性殘留率為56.6%。Meinlschmidt[36]等研究了五種蛋白酶(堿性酶、風(fēng)味酶、中性酶、木瓜蛋白酶和Corolase)及其不同組合,且采用一步和兩步水解方式對大豆抗原蛋白的水解效果,發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的組合水解效果最好,產(chǎn)生的多肽片段分子量均小于20 ku,可以將大豆β-伴球蛋白和大豆球蛋白等主要過敏原有效水解。這表明不同酶有不同的作用位點(diǎn),可將蛋白分子水解到較小肽段,破壞抗原決定簇,從而有效降低其抗原性。

2.1.2 酶解不能降低大豆7S蛋白的抗原性 與前述酶解降低大豆7S球蛋白抗原性的結(jié)果相反,有些研究發(fā)現(xiàn),某些酶解條件下,大豆蛋白的抗原性不僅沒有降低,反而出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。

Rakhi[37]等采用SDS-PAGE、IgE印跡法和細(xì)胞培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn),大豆分離蛋白經(jīng)過酶解后其抗原性并沒有減少,而且胰凝乳蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解大豆分離蛋白后,抗原性反而有所增加,其中β-伴球蛋白水解的片段是引起抗原性升高的主要原因。Keum[23]等用胃蛋白酶水解7S球蛋白后,其抗原性可以降低50%以上。然而,先用胃蛋白酶、再用胰凝乳蛋白酶水解得到的酶解物抗原性又有所恢復(fù),在10名大豆過敏者中,有5人的血清可與酶解產(chǎn)物發(fā)生免疫反應(yīng)。其中,酶解產(chǎn)物中有2個(gè)片段(分子量分別為20～25和13～16 kDa)表現(xiàn)出與10位大豆過敏者血清有反應(yīng)活性。

上述結(jié)果之所以不太一致,可能與選擇的抗原性測定方法有一定關(guān)聯(lián)。大部分研究者采用ELISA法檢測,少數(shù)采用免疫印跡法;另外,即使均采用大豆過敏者血清,但對同一測試樣品并不是所有過敏者血清都會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)[38]。所以體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床癥狀可能存在不一致之處。

2.1.3 酶解去糖基化降低大豆7S蛋白抗原性 針對上述酶解后7S大豆蛋白亞基消失,但抗原性并未完全消失,甚至酶解產(chǎn)生的低分子量肽鏈仍然表現(xiàn)出一定的抗原性的現(xiàn)象,還可能與大豆蛋白肽鏈中糖的存在有一定關(guān)聯(lián)性。Hiemori[39]等用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶除去7S大豆蛋白Gly m Bd 28K組分的糖鏈后其抗原性消失。Miryam[40]等用糖苷酶水解脫去大豆抗原蛋白的糖鏈后,用Western印跡法和直接ELISA測定發(fā)現(xiàn)其免疫反應(yīng)大大降低,而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),大豆β-伴球蛋白難以被胃蛋白酶完全水解,脫糖基處理后則易被胃液消化,但糖基化的α和β亞基仍有部分保留下來[41]。這可能是蛋白酶水解無法完全消除其免疫活性的重要原因。

2.2 生物酶解降低大豆11S蛋白抗原性

大豆11S球蛋白也是主要抗原蛋白之一,相對于7S蛋白而言,受關(guān)注程度較低。王之盛[42]等研究認(rèn)為,復(fù)合酶制劑在酸性條件下,較容易酶解大豆中11S抗原蛋白;而在中性、堿性條件下易于酶解7S和2S抗原蛋白;表明復(fù)合酶制劑在不同的酸堿環(huán)境下,酶解特性存在一定的差異。Lee[43]等用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶研究發(fā)現(xiàn),大豆11S球蛋白中的酸性多肽鏈比堿性多肽鏈更容易水解;通過凝膠過濾法將11S酶解物各組分分開,并用大豆過敏者血清鑒定發(fā)現(xiàn),肽分子量小于20 ku的成分幾乎沒有免疫活性。但是相對于上述酶水解效果,胰蛋白酶有效水解11S蛋白則相對較難。如:Wang[30]等發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶對11S的酸性亞基以及堿性亞基幾乎沒有作用;Zhao[28]等也發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶不易將大豆11S球蛋白的B多肽鏈水解。

相比以上動(dòng)物蛋白酶,植物蛋白酶和微生物蛋白酶更容易水解大豆11S球蛋白。Shutov[44]等研究發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶很容易水解大豆11S球蛋白,有效降低大豆11S球蛋白的抗原活性,且11S球蛋白酸性肽鏈的酶解產(chǎn)物還可以促進(jìn)堿性肽鏈的水解。Wang[30]等用Alcalase堿性蛋白酶對豆粕處理10 min,能夠明顯降解大豆11 S球蛋白的酸性亞基和堿性亞基。楊春華[45]等用堿性蛋白酶與轉(zhuǎn)谷酰胺酶聯(lián)合水解大豆11S球蛋白,發(fā)現(xiàn)除發(fā)生酶解反應(yīng)外,還可以發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),從而達(dá)到降低大豆蛋白抗原性的效果。

2.3 微生物發(fā)酵降低大豆蛋白抗原性

通過微生物發(fā)酵降低或者清除大豆蛋白的抗原活性也是目前研究和應(yīng)用熱點(diǎn)之一。Lee[46]等通過乳酸乳球菌、球菌、曲霉和枯草芽孢桿菌以及其不同組合對蒸煮過的大豆進(jìn)行發(fā)酵,提取大豆蛋白后用SDS-PAGE和免疫印跡法進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大豆蛋白被降解為氨基酸或者分子量小于10 ku的肽,并且未檢測到免疫活性。Frias[47]等對大豆進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵發(fā)現(xiàn),米曲霉和米根霉發(fā)酵可降低66%和71%大豆蛋白抗原性,枯草芽孢桿菌發(fā)酵則可降低81%～86%。Amnuaycheewa[48]等發(fā)現(xiàn)用雙歧桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵豆粕可降低大豆抗原蛋白68%～72.7%。王波[49]等用植物乳酸桿菌對豆粉進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵48 h后,β-伴大豆球蛋白免疫活性降低71%,大豆球蛋白的免疫活性降低64%。

而Song[50]等研究發(fā)現(xiàn),釀酒酵母液態(tài)發(fā)酵豆粕可明顯降低大豆免疫活性,用乳桿菌、雙歧桿菌發(fā)酵效果并不明顯。之所以出現(xiàn)上述不一致的結(jié)果,可能與菌種的活性、接種量、發(fā)酵時(shí)間等條件有很大關(guān)系。尤其是固態(tài)發(fā)酵需要更長的發(fā)酵時(shí)間才有可能使微生物分泌的蛋白酶與大豆蛋白充分反應(yīng)。

3 結(jié)論與展望

大豆是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一,但是大豆的致敏性一直是全世界普遍關(guān)注的食品安全問題。生物酶解法被認(rèn)為是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[35]。盡管酶解大豆蛋白的文獻(xiàn)很多,但往往關(guān)注大豆蛋白酶解后的溶解、乳化、發(fā)泡等食品加工性能的變化,而對生物酶解法降低大豆蛋白抗原性的研究近年來才有較多報(bào)道。當(dāng)然,生物酶解法的酶解效果受酶的種類、酶解條件等多種因素的影響,酶解產(chǎn)物的抗原性測定方法也是目前研究結(jié)論不太一致的主要原因。因此如何有效降低或者完全去除大豆蛋白的抗原性,還需更加深入的研究。生物酶解法降低大豆蛋白抗原性過程中大豆蛋白加工性能的變化規(guī)律也是未來的重要研究方向。相信隨著生物酶解法去除大豆蛋白抗原性研究的不斷深入和新型酶的不斷開發(fā),既能降低大豆蛋白抗原性、又能獲得較好加工性能的酶解方法將不斷出現(xiàn),并能有效應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)中。