光譜法及分子模擬分析大豆皂苷II與牛血清白蛋白的相互作用

光翠娥， 桑尚源， 干建平， 林 芳， 李志剛

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室/大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡438000）

大豆皂苷Ⅱ是一種五環(huán)三萜類齊墩果酸型單糖鏈皂苷，由非極性三萜苷元B的C-3羥基和極性三聚糖分子環(huán)狀半縮醛上的羥基失水縮合而成，見圖1。大豆皂苷Ⅱ是豆制品中皂苷的主要存在形式之一，已被發(fā)現(xiàn)具有促甲狀腺分泌（保護(hù)肝臟）、抑制腎素活性（降低血壓）、抗HSV-1皰疹病毒以及增強免疫原性（免疫佐劑）的功能[1]。

牛血清白蛋白（BSA）由582個氨基酸組成，其中包含兩個色氨酸（Trp134和Trp212）和16個酪氨酸殘基，因此具有熒光活性。BSA的三維結(jié)構(gòu)類似于球狀，由3個相似的結(jié)構(gòu)域I、II和III組成，每一個結(jié)構(gòu)域又由A和B兩個亞結(jié)構(gòu)域組成。BSA的亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，疏水性氨基酸大多包埋于圓筒內(nèi)部，構(gòu)成疏水腔[2]。

BSA是哺乳動物血漿中的主要載體蛋白，具有儲存和轉(zhuǎn)運外源性小分子的重要功能。生理活性物質(zhì)吸收進(jìn)入體內(nèi)后，由血清白蛋白通過各種生理膜運輸?shù)礁鹘M織器官，兩者之間結(jié)合率與結(jié)合能力的不同，會影響到活性物質(zhì)的作用強度和作用時間[2]。實驗選用與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)相似、價格便宜、更易提純的BSA，通過熒光光譜、圓二色光譜及分子模擬等研究活性小分子和BSA相互作用，為大豆皂苷Ⅱ的生物利用提供理論基礎(chǔ)。

圖1 大豆皂苷Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of soyasaponinⅡ

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆皂苷Ⅱ（純度91.7%）：美國ChromaDex公司產(chǎn)品；BSA：Sigma公司產(chǎn)品；三羥甲基氨甲烷（Tris）：國藥集團(tuán)試劑公司產(chǎn)品。Tris-HCl緩沖液：500 mL的0.1 mol/L Tris溶液中加入約420 mL的0.1 mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)pH至7.4，精確加入5.8 g氯化鈉，定容至1 000 mL，4°C保存待用。

FLUORMAX-4熒光光譜儀：美國HORIBA公司產(chǎn)品；MOS-450 AF-CD圓二色光譜儀：法國Bio-Logic公司產(chǎn)品；軟件 Discover Studio（DS）2.5、LigPlot+分析軟件：美國Accelrys軟件公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BSA的內(nèi)源熒光光譜檢測 用Tris緩沖液配制BSA與大豆皂苷Ⅱ不同比例的混合液。BSA的最終濃度為1 μmol/L，大豆皂苷Ⅱ的終濃度分別為0、0.5、1、2、4 μmol/L， 混合靜置 30 min。 分別吸取200 μL Tris-HCl緩沖溶液 （pH 7.4）和樣品注入2 mm比色皿中測定熒光光譜。室溫下 （20℃），以295 nm為激發(fā)波長，狹縫為5 nm，在300～450 nm波長范圍內(nèi)掃描BSA樣品的發(fā)射光得到內(nèi)源熒光光譜圖，重復(fù)掃描3次取平均值?？瞻诪門ris-HCl緩沖溶液，熒光強度值為扣除空白后的相對值。

1.2.2 BSA的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜檢測 分別吸取200 μL Tris-HCl緩沖溶液 （pH 7.4）和樣品注入2 mm比色皿中測定圓二色光譜，每次測量扣除Tris-HCl緩沖溶液的背景干擾。室溫下（20℃）光譜測定條件是200～250 nm波長范圍掃描，掃描速度為20 nm/min，響應(yīng)時間為 2 s。

1.2.3 分子模擬 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 （PDB）中獲取BSA晶體的三維結(jié)構(gòu)模型數(shù)據(jù)文件 （登錄號為3v03），使用DS2.5軟件刪除其中的配體小分子和水分子，補入缺失的氫原子，得到BSA晶體的完整三維結(jié)構(gòu)。大豆皂苷Ⅱ的立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件從網(wǎng)站www.chemical-book.com中搜索下載，采用PRODRG網(wǎng) 站 （http：//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg）對大豆皂苷Ⅱ的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行加電荷和構(gòu)象優(yōu)化等預(yù)處理。以BSA的Trp213殘基為中心，半徑為13×10-8cm的球體范圍為對接區(qū)域，使用DS軟件中的Libdock模塊進(jìn)行剛性分子對接。對接程序參數(shù)設(shè)置如下：Docking Tolerance，0.25；Numbers of Hotspots，100；Docking Preference，High Quality；Conformation Method，F(xiàn)AST；Parallel Processing，F(xiàn)alse。從大豆皂苷Ⅱ構(gòu)象集中選取打分函數(shù)LibDockscore得分最高者，將其對接復(fù)合物的文件導(dǎo)入Ligplot+軟件中，得到蛋白與皂苷分子間相互作用網(wǎng)，進(jìn)一步分析得到氫鍵和疏水相互作用位點[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度大豆皂苷Ⅱ?qū)SA穩(wěn)態(tài)內(nèi)源熒光光譜的影響

BSA有兩個色氨酸殘基，一個Trp213在疏水腔內(nèi)部，另一個Trp134在亞結(jié)構(gòu)域IB表面[4]。以295 nm為激發(fā)波長，BSA的內(nèi)源熒光基團(tuán)色氨酸產(chǎn)生發(fā)射熒光。蛋白質(zhì)與小分子作用，色氨酸對微環(huán)境的變化敏感而使熒光光譜發(fā)生改變。在穩(wěn)態(tài)內(nèi)源熒光光譜圖2中，單純BSA在334 nm出現(xiàn)最大吸收峰，隨著大豆皂苷Ⅱ的添加，最大發(fā)射波長略微藍(lán)移至333 nm；在BSA與大豆皂苷Ⅱ比例為1∶1、1∶2和1∶4時，峰型不變，但出現(xiàn)熒光猝滅，BSA熒光譜特征峰的相對強度為98%、98%和97%。因此，大豆皂苷Ⅱ與BSA發(fā)生弱相互作用，使色氨酸殘基的微環(huán)境的疏水性增加，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變，形成了發(fā)射弱的熒光復(fù)合體。

2.2 不同濃度大豆皂苷Ⅱ?qū)SA圓二色光譜的影響

蛋白質(zhì)生色團(tuán)的光活性中心對平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不同，造成透射后偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成橢圓偏振光，即為圓二色性，不同波長對應(yīng)的橢圓率稱為圓二色光譜，小于250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色光譜反映蛋白質(zhì)肽鍵的圓二色性[5]。在圓二色光譜圖3中，靠近209 nm和221 nm處出現(xiàn)的兩個負(fù)肩峰為單純BSA分子α螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，吸收峰的強度可以反映蛋白α螺旋的變化。隨著大豆皂苷Ⅱ（特別是4倍的皂苷）的加入，BSA的圓二色光譜的負(fù)橢圓率下降，原209 nm處的負(fù)峰移向高波數(shù)并且振幅減弱，說明皂苷的疏水作用引起微構(gòu)象的變化，使肽鏈伸展，改變了BSA的二級結(jié)構(gòu)。

圖2 不同濃度大豆皂苷Ⅱ?qū)SA內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.2 Fluorescencespectra ofBSA with different concentrations of soyasaponinⅡ

圖3 大豆皂苷Ⅱ-BSA混合溶液的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜圖Fig.3 Far-UV CD spectra of the soyasaponin-BSA solutions

2.3 大豆皂苷Ⅱ與BSA相互作用的分子對接

DS工作站中Libdock模塊的對接吻合度打分函數(shù)LibDockscore是對幾何形狀、化學(xué)環(huán)境以及能量的綜合評價參數(shù)，也是根據(jù)配體與受體對接時的對接模式、親和力和相對能量值等進(jìn)行綜合打分。LibDockscore大于100表示配體與受體能較好地結(jié)合，其值越大則表明對接產(chǎn)生的復(fù)合物構(gòu)象越穩(wěn)定，Poses是與配體受體蛋白對接時所得配體的構(gòu)象數(shù)[3]。當(dāng)大豆皂苷Ⅱ與BSA對接時，所得立體構(gòu)象總數(shù) Poses為 97，LibDockscore最高分為 188.485，表明兩者可較好地穩(wěn)定結(jié)合，所得復(fù)合物構(gòu)象穩(wěn)定。選取LibDockscore評分最高的構(gòu)象，制作分子對接三維圖。圖4中，綠色為色氨酸殘基，透明球中的線型模型分子為大豆皂苷Ⅱ的最優(yōu)對接構(gòu)象，由此可知皂苷處于“心型”BSA的疏水腔內(nèi)。

2.4 大豆皂苷Ⅱ和BSA間的氫鍵和疏水相互作用

運用Ligplot+軟件，得到最佳復(fù)合物分子間相互作用二維圖，并通過HBPLUS程序計算氫鍵和疏水作用[6]。根據(jù)圖5，表1總結(jié)了穩(wěn)定的氫鍵作用，由此可知，BSA中的 4個氨基酸 Asp108、Asp111、Arg144及Arg458與大豆皂苷Ⅱ形成了6個氫鍵，其中Arg144與O46形成的氫鍵最短。同樣地，從二維圖5可知，BSA中的 15氨基酸 Ser109、Pro110、His145、Pro146、Leu189、Thr190、Ala193、Gln424、Ser428、Lys431、Val432、Arg435、Tyr451、Leu454 及 Ile455 參與了與大豆皂苷Ⅱ的疏水作用。

圖4 大豆皂苷Ⅱ與BSA的對接三維圖Fig.4 Molecular docking 3D-diagram of soyasaponinⅡand BSA

注：實心圓代表原子：紅色為氧原子，黑色為碳原子，藍(lán)色為氮原子。原子間的實線代表化學(xué)鍵：黃色為氨基酸殘基的化學(xué)鍵，紫色為配體化學(xué)鍵。帶標(biāo)簽的氨基酸代表BSA中與大豆皂苷Ⅱ相互作用的殘基：紅色并帶有輻射狀短線弧線的為參與疏水作用的殘基，其它為參與氫鍵的殘基，綠色虛線代表氫鍵作用。

根據(jù)以上相互作用的分析，使用DS工作站得到氫鍵和疏水相互作用的三維圖。圖6（a）中，大豆皂苷Ⅱ的三糖基鏈中第二個阿拉伯糖基、第三個鼠李糖基與BSA氨基酸殘基有氫鍵作用。圖6（b）中，參與疏水作用的氨基酸在BSA內(nèi)部組成一個疏水性腔體（即代表靜電中性點白色部分），大豆皂苷Ⅱ的疏水性配基齊墩果烷伸進(jìn)BSA的這個疏水腔內(nèi)，兩者產(chǎn)生了疏水相互作用。

表1 大豆皂苷Ⅱ與BSA分子間氫鍵作用Table 1 Hydrogen bond interaction between soyasaponinⅡand BSA

圖6 大豆皂苷Ⅱ與BSA分子間氫鍵和疏水作用三維圖Fig.6 3D diagrams of hydrogen bond and hydrophobic interactions between soyasaponinⅡand BSA

3 結(jié) 語

通過內(nèi)源熒光光譜、圓二色光譜和分子建模方法研究了大豆皂苷Ⅱ與BSA之間的相互作用。BSA的內(nèi)源熒光光譜表明蛋白與大豆皂苷Ⅱ作用后其立體構(gòu)象發(fā)生變化，圓二色光譜顯示大豆皂苷Ⅱ還對BSA的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。計算機模擬分子對接表明大豆皂苷Ⅱ與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性較好，大豆皂苷Ⅱ的三糖基鏈中阿拉伯糖基和鼠李糖基部分與BSA形成氫鍵作用，參與其中的重要氨基酸有Asp108、Asp111、Arg144和 Arg458殘基， 皂苷的配基三萜烯部分與BSA的15個氨基酸殘基形成疏水相互作用。這些研究闡明了大豆皂苷Ⅱ與BSA的結(jié)合特點，為進(jìn)一步開發(fā)大豆皂苷提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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