致病性與非致病性副溶血性弧菌在不同溫度和接觸材料表面生物被膜形成情況分析

趙愛靜 ， 付嬌嬌 ， 宋雪迎 ， 孫曉紅 ，2，3， 潘迎捷 ，2，3， 趙 勇 *，2，3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種常見的食源性致病菌，尤其在夏秋季節(jié)，因誤食污染的水產(chǎn)品而引發(fā)的急性腸胃炎、原發(fā)性敗血癥等疾病時(shí)有發(fā)生，對(duì)食品安全構(gòu)成了巨大威脅。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，VP引起的食物中毒，發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已高居我國(guó)微生物性食物中毒首位[1]。在正常的少鹽或無鹽環(huán)境中，VP是不容易繁殖的，因此，在不利環(huán)境中極有可能以一種特殊的保持自身有利生存的狀態(tài)存在，即生物被膜。

生物被膜（Biofilm，BF）指的是附著于各種載體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌的由細(xì)菌自身所分泌的含水聚合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性無柄細(xì)菌群落[2]。食源性致病菌易在食品及其加工、運(yùn)輸和保藏設(shè)備的接觸表面形成BF，并通過殘留、接觸、散播微生物或氣溶膠的方式污染整個(gè)生產(chǎn)環(huán)境，隨機(jī)性強(qiáng)、易被忽視[3-5]。這些形成BF的微生物細(xì)胞自身可以分泌胞外多聚物（EPS），能增強(qiáng)微生物細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境因素的抵抗能力，使得常規(guī)殺菌方法不能有效徹底地滅菌，進(jìn)而再次污染食品[3，6]。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所（NIH）指出，人類細(xì)菌性感染約有65%是由BF 引起的[7]。

溫度、pH、離子強(qiáng)度等環(huán)境條件，以及微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件等，都會(huì)影響微生物BF的形成[3，8]。近年來，食品接觸材料對(duì)微生物BF形成能力的影響引起廣泛關(guān)注。已有研究指出，食源性致病菌單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等易在常見的食品接觸材料聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、不銹鋼等表面形成BF，給食品安全帶來了極大風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。VP是一種海洋細(xì)菌，主要來源于魚、蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)品。在這些水產(chǎn)品運(yùn)輸、加工及貯藏過程中，會(huì)直接或間接接觸各種表面，如魚缸、塑料運(yùn)輸盒、工器具、刀具、桌面、冰箱等，從而使VP易在玻璃、聚苯乙烯、不銹鋼等材料表面附著形成生物被膜。法國(guó)報(bào)道稱，60%的食源性疾病是由于生產(chǎn)加工過程中接觸材料表面的微生物污染食品引起的[11]。然而，關(guān)于VP在不同溫度和食品接觸材料交互作用下BF形成情況的研究鮮有報(bào)道。另外，Nilsson等[12]發(fā)現(xiàn)致病血清型與非致病血清型單增李斯特菌BF形成能力的存在差異，而Lianou等[13]則指出沙門氏菌BF的形成與其致病性血清型沒有相關(guān)性。因此，作者模擬致病性與非致病性VP在食品工業(yè)中不同溫度及食品接觸表面BF的形成情況，旨在為通過食品加工環(huán)境對(duì)BF的有效控制提供理論，為食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

作者共檢測(cè)了39株VP生物被膜形成情況，其中，致病性菌株22株，非致病性菌株17株（結(jié)果見表1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

結(jié)晶紫：美國(guó)sigma公司產(chǎn)品；SYBR GreenⅠ染料：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；24和96孔板：美國(guó)康寧公司產(chǎn)品；BioTek酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；垂直流超凈工作臺(tái)、二級(jí)生物安全柜：Esco China公司產(chǎn)品；MIR154高精度低溫培養(yǎng)箱、MLS-3750型高壓滅菌鍋：日本三洋電機(jī)生物醫(yī)藥株式會(huì)社產(chǎn)品；LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡：德國(guó)卡爾蔡司公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的活化

用平板劃線法將-80℃冰箱內(nèi)甘油管保藏的菌種接種至TCBS瓊脂培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于5 mL TSB（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%NaCl）試管中，在37℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)10 h，連續(xù)活化兩次，作為接種液備用（A600nm=0.4）。

2.2 BF的培養(yǎng)

為研究不同食品接觸表面對(duì)BF的影響，選用無菌的聚苯乙烯（簡(jiǎn)寫PS，直徑14 mm）、玻璃片（簡(jiǎn)寫GS，直徑14 mm）和不銹鋼片（簡(jiǎn)寫SS，直徑12.5 mm）作為實(shí)驗(yàn)材料。將以上3種無菌的薄片分別置于24孔板中，并依次加入990 μL的TSB（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%NaCl），10 μL 的菌液（A600nm=0.4），隨后分別于 4、10、15、25和 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 48 h。

2.3 BF形成能力的檢測(cè)

采用結(jié)晶紫染色法對(duì)菌株BF形成能力進(jìn)行檢測(cè)[14]，并稍作修改。在PS和GS兩種材料表面的BF培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉菌液，用無菌PBS輕輕洗滌3次，以除去未粘附的細(xì)菌；待室溫晾干后，加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫染色30 min；染色結(jié)束后，用無菌水沖洗以去除多余染液，洗滌3次，室溫風(fēng)干；最后加入1 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫附著的結(jié)晶紫。在600 nm下測(cè)定洗脫液的吸光值。在SS表面的BF培養(yǎng)結(jié)束后，移取SS片至新的24孔板內(nèi)重復(fù)上述步驟。其中每個(gè)樣品重復(fù)6個(gè)孔，以未接種菌液放置PS、GS、SS片的孔板重復(fù)上述操作作為空白對(duì)照。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用菌株Table 1 Strains used in this study

2.4 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）的觀察

BF經(jīng)PBS輕輕洗3次，去除未附著的細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛溶液固定30 min，之后用PBS溶液沖洗 3遍，SYBR GreenⅠ染料避光染色 30 min，PBS溶液清洗3次，取片，在CLSM下觀察。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），檢驗(yàn)水平為P＜0.05時(shí)為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用origin 8.0作圖。另外，變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）的計(jì)算公式為：變異系數(shù)CV=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean）×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度條件下VP菌株BF形成情況分析

VP在不同溫度條件下BF形成情況見表2和圖1。低溫4、10、15℃是水產(chǎn)品低溫貯藏中常用溫度，高溫25、37℃是適于VP生成的環(huán)境溫度。由表2可知，在 PS表面，低溫條件下（4～15 ℃），33.3%～48.7%的 VP生成 BF；高溫條件下 （25、37℃），94.9%以上的VP形成BF。在低溫和37℃條件下，僅生成弱粘附性BF；在25℃條件下，則生成強(qiáng)、中粘附性BF，分別占1.28%和1.0%。由圖1（a）可知，25℃條件下BF形成能力較強(qiáng)，且VP-S36菌株在此條件下BF形成量明顯強(qiáng)于其他菌株?？偟膩碚f，在PS表面，低溫條件下，VP成膜能力較弱，25℃條件下最強(qiáng)，37℃條件下相對(duì)較強(qiáng)。

在GS材料表面，4～37℃條件下，分別有15（38.5%）、25（64.1%）、29（74.4%）、35（89.7%）和 38（97.4%）株VP生成BF。此結(jié)果表明隨著溫度的升高，VP生成BF能力逐漸增強(qiáng)。Bonaventura等[15]研究指出，在4～37℃變化范圍內(nèi)，單增李斯特菌BF形成能力逐漸增強(qiáng)，與本研究結(jié)果相似。VP在4、10℃條件下，僅生成弱粘附性BF；在15、37℃條件下，分別有2株和14株VP生成中粘附性BF；在25℃條件下則15株生成中粘附性BF，2株生成強(qiáng)粘附性BF。菌株VP-S36在此條件下BF形成量明顯強(qiáng)于其他菌株。結(jié)合圖1（b）可知，25℃條件下，VP成膜能力較強(qiáng)，37℃次之，低溫較弱。

在SS材料表面，4～37℃條件下，成膜菌株數(shù)量分別為18、14、28、29和19株。在低溫條件下生成的BF均呈弱粘附性，在高溫條件下均僅有1株VP生成中粘附性BF。由圖1（c）可知，25℃條件下VP成膜能力較強(qiáng)。因此，在SS材料表面，4℃和10℃條件下，BF形成能力較弱，37℃條件下VP成膜能力稍強(qiáng)，15℃和25℃條件下VP成膜能力較強(qiáng)。

圖1 不同溫度及聚苯乙烯（PS，A）、玻璃（GS，B）、不銹鋼（SS，C）表面VP菌株BF生成量的箱形分布圖Fig.1 Boxplots of biofilm formation by V.parahaemolyticus at different temperatures on polystyrene（PS，A），glass（GS，B） and stainless steel（SS，C）

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，在BF形成過程中扮演者重要角色，溫度的變化會(huì)影響鞭毛的生成，從而影響B(tài)F的形成[16]。在低溫（4～15℃）下，VP自身生長(zhǎng)遲緩，鞭毛的運(yùn)動(dòng)受到抑制，這可能是低溫BF生成能力較弱的重要因素。25℃是VP菌株BF形成的最佳溫度，在此條件下可形成強(qiáng)粘附的BF，可能是由于25℃適宜VP生長(zhǎng)，在此溫度下鞭毛生長(zhǎng)較快，促進(jìn)了胞外多糖、胞外蛋白等胞外物質(zhì)的分泌，進(jìn)而利于BF的生成。在37℃條件下，VP雖能維持生存但形成BF能力相對(duì)較弱，這可能是胞外酶類物質(zhì)對(duì)高溫敏感的原因所致[4]。因此，建議在以后的食品加工、運(yùn)輸及保藏過程中通過控制溫度抑制VP菌株BF的形成，進(jìn)而降低因其污染而引發(fā)的食品風(fēng)險(xiǎn)。

通過變異系數(shù)分析可知，溫度影響VP菌株BF形成能力的變異性，其變異系數(shù)從大到小排序?yàn)椋篊V（25 ℃）＞ CV（37 ℃）＞ CV（10 ℃）＞ CV（15 ℃）＞CV（4℃），表明25℃對(duì)VP成膜能力變異性影響最大。Lianou等認(rèn)為，沙門氏菌成膜能力變異性在25℃最小[13]，與結(jié)論相反。說明不同種屬的細(xì)菌，溫度對(duì)其BF形成能力變異性的影響存在很大差異。

3.2 不同材料表面VP菌株BF形成情況分析

在低溫條件及不同接觸材料表面VP菌株BF形成情況見表2。在4℃條件下，分別有48.7%、38.5%、46.2%的 VP在 PS、GS和 SS表面生成 BF。因此，在4℃條件下，VP更易在PS材料表面粘附，其次是SS表面，最后是GS表面。在10℃條件下，GS表面64.1%的VP生成BF，而PS和SS材料表面成膜菌株所占比例相對(duì)較低，僅有33.3%和35.9%的VP形成BF。說明在10℃條件下，VP在GS材料表面粘附性較強(qiáng)，在PS和SS材料表面粘附性明顯較弱。在15℃條件下，PS、GS和SS 3種材料表面VP成膜菌株所占比例分別為41.0%、74.4%和71.8%。其中，在GS材料表面，2株VP形成了中粘附性BF。因此，在15℃條件下，VP在GS材料表面成膜能力較強(qiáng)，其次是SS表面，最后是PS表面。

在高溫條件及不同接觸材料表面VP菌株BF形成情況如下：從表2可知，在25℃條件下，PS材料表面，29株VP生成弱粘附性BF，5株VP生成中粘附性BF，4株VP生成強(qiáng)粘附性BF；在GS材料表面，18株、15株、2株VP分別生成弱、中、強(qiáng)粘附性BF；在SS材料表面，28株VP生成弱粘附性BF，1株VP生成中粘附性BF，無強(qiáng)粘附性BF的生成。由此可見，在25℃條件下，SS材料表面VP成膜能力較弱。在37℃條件下，PS表面37株VP形成弱粘附性BF；在GS材料表面，24株VP生成弱粘附性BF，14株生成中粘附性BF；在SS材料表面，19株VP生成BF，其中1株形成中粘附性BF。該結(jié)果表明，在37℃條件下，GS表面成膜能力較強(qiáng)，PS表面次之，SS表面較弱。綜上所述，VP在GS材料表面粘附性較強(qiáng)，在PS表面相對(duì)較強(qiáng)，在SS材料表面較弱。

表2 不同溫度及接觸材料表面VP菌株BF的形成情況Table 2 Biofilm formtaion of V.parahaemolyticus on different surfaces at various temperatures

VP帶負(fù)電荷，極易與帶正電的材料相結(jié)合，而GS帶正電荷，故在GS表面其BF形成能力較強(qiáng)。Meira等[17]研究指出在疏水性材料-聚丙烯表面，金黃色葡萄球菌BF能力強(qiáng)于親水性材料SS表面BF形成能力，與本研究中VP在疏水材料PS比在親水材料SS表面更易粘附的結(jié)果相類似。Rodriguez和Litzler[18-19]等研究表明菌株在SS表面成膜能力與粗糙度無關(guān)，同樣，本研究中SS不光滑的表面并未影響VP生物被膜的形成。Bonsaglia等[16]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在SS材料表面可形成強(qiáng)粘附性BF，在GS表面大都形成弱粘附性BF，與作者研究結(jié)果相反。說明細(xì)菌在不同材料表面形成BF的能力與其所在菌屬有很大關(guān)系。VP在37℃下，PS和GS表面成膜能力較強(qiáng)，而SS表面較弱，僅有19株VP形成BF。該現(xiàn)象的原因可能是，較PS與GS，SS是一種導(dǎo)熱性良好的材料，在高溫37℃的交互作用下抑制VP鞭毛的生成，進(jìn)而降低BF的形成[16，20]。因此，在食品加工過程中，可通過改換食品接觸材料的方式有效控制VP菌株BF導(dǎo)致的危害。

由變異系數(shù)CV值可知，CV （PS）=74.17%，CV（GS）=56.15%，CV （SS）=35.99%， 說明對(duì)比 3 種材料，PS表面菌株BF形成能力的變異性最大。由表2可知，在PS表面，低溫條件下低于50%的VP形成BF，而高溫條件下超過94.9%的VP形成BF，成膜VP菌株數(shù)量波動(dòng)范圍較大；在GS表面，4～37℃變化范圍內(nèi)，成膜菌株數(shù)量波動(dòng)規(guī)律，呈逐漸上升趨勢(shì)；在SS表面，成膜菌株數(shù)量波動(dòng)范圍較小。因此，PS材料對(duì)VP成膜變異性影響最大。此外，對(duì)影響B(tài)F生成的外界因素進(jìn)行了變異系數(shù)分析，結(jié)果顯示，CV（溫度）=157.4%，CV（接觸材料）=43.4%，說明溫度對(duì)VP成膜影響最大，其次是接觸材料。綜述所述，在食品加工環(huán)境中，不僅要注意接觸材料表面的衛(wèi)生，更要注意控制環(huán)境溫度，以降低BF污染引發(fā)的食品風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 致病性菌株與非致病性菌株BF形成情況

致病性菌株與非致病性菌株BF形成情況見表2。對(duì)于弱粘附性BF，在PS表面，主要是由致病性菌株形成的；在GS表面，4～37℃條件下，致病性VP成膜菌株數(shù)量是非致病性VP的1倍以上，尤其是25℃條件下，達(dá)2倍以上；在SS表面，15℃條件下，弱粘附致病性VP是弱粘附非致病性VP的1.5倍，其他溫度下則多于2倍。對(duì)于中粘附性BF，在15℃、GS表面及25℃、PS表面均為致病性菌株形成的；在25℃和37℃、GS表面，一半由致病性菌株生成，一半由非致病性菌株生成。對(duì)于強(qiáng)粘附性BF，在PS表面，3株為非致病性菌株形成，2株為致病性菌株形成；GS表面則均為非致病性菌株形成?？傮w來說，致病性菌株成膜能力明顯強(qiáng)于非致病性菌株（P＜0.05），這可能與致病性、非致病性菌株對(duì)同一外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)不同有關(guān)。Nilsson等[12]指出，致病性1/2a血清型單增李斯特菌成膜能力更強(qiáng)。綜上，致病性VP成膜能力強(qiáng)于非致病性VP，這一特性從側(cè)面說明了為何VP高居微生物性食物中毒首位。

低溫環(huán)境中，致病性VP成膜能力的變異性大于非致病性菌株；25℃條件下，非致病性菌株成膜能力的變異性更大；37℃條件下，致病與非致病性菌株成膜能力的變異性無明顯差別。由此可見，低溫對(duì)致病性菌株成膜能力影響性更大，25℃對(duì)非致病性菌株成膜能力影響更大，37℃對(duì)致病與非致病菌株成膜能力影響類似。由表3（b）可知，較致病性菌株，非致病性菌株在接觸材料表面成膜能力的變異性更大，其中PS表面對(duì)非致病性菌株成膜能力的變異性影響最大。因此，致病與非致病性菌株成膜能力的變異性受溫度和材料的影響，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)溫度的控制及接觸材料表面衛(wèi)生的監(jiān)管，避免因BF污染而導(dǎo)致中毒事件發(fā)生。

3.4 VP-S36在玻璃表面生物被膜CLSM的檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特選取典型菌株VP-S36（見圖1），對(duì)其在GS表面不同溫度條件下形成的三維立體BF結(jié)構(gòu)進(jìn)行CLSM觀察（如圖2）。在4℃下幾乎所有細(xì)胞呈單細(xì)胞分布，細(xì)胞無明顯聚集狀態(tài)，熒光強(qiáng)度最弱；在10℃下大部分細(xì)胞則呈單細(xì)胞分布，少數(shù)細(xì)胞聚集，熒光強(qiáng)度較弱；在15℃下部分細(xì)胞聚集成簇，熒光強(qiáng)度明顯弱于25℃和37℃；在25℃下形成了較厚的BF，幾乎覆蓋了GS材料表面，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；在37℃下形成了多細(xì)胞聚集的BF，該結(jié)構(gòu)覆蓋了大部分的材料表面，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。由CLSM觀察結(jié)果可知：VP-S36在25℃和37℃條件下有大量BF形成，在25℃下BF形成能力最強(qiáng)，在低溫條件下成膜能力明顯減弱。VP-S36在CLSM下觀察到的BF結(jié)構(gòu)與結(jié)晶紫染色法半定量的結(jié)果一致。因此，溫度對(duì)VP菌株BF的形成產(chǎn)生一定的影響，低溫條件下BF的形成能力較弱，37℃條件下，菌株成膜能力較強(qiáng)，25℃條件下，菌株成膜能力

圖2 不同溫度下菌株VP-S36生物被膜CLSM圖片F(xiàn)ig.2 CLSM images of VP-S36 strain biofilm formed at different temperatures.

4 結(jié)語

首次闡釋了VP在5個(gè)溫度、3種接觸材料表面BF的形成情況，結(jié)果顯示，低溫環(huán)境中VP生成BF能力較弱，37℃條件下BF能力相對(duì)較強(qiáng)，25℃條件下更適于VP菌株BF的形成；GS表面BF形成能力較強(qiáng)，其次是PS表面，最后是SS表面；影響B(tài)F形成的外界因素中，溫度影響最大，其次為接觸材料。另外，致病性菌株成膜能力強(qiáng)于非致病菌株。因此，建議今后在食品加工過程中，可通過控溫或改變接觸材料的方式以降低致病性VP菌株BF形成而引發(fā)的食品風(fēng)險(xiǎn)。此研究不僅可為后續(xù)VP菌株BF形成特性的深入研究奠定基礎(chǔ)，而且可為食品加工企業(yè)進(jìn)一步控制和清除食品接觸材料表面產(chǎn)生的BF提供理論依據(jù)。

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