我國(guó)傳統(tǒng)干酪中生物胺含量檢測(cè)分析

劉 蕾，牛天嬌，陳歷水*，夏 晗，常圓圓，王 冶

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司 品牌食品研發(fā)中心 老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室 營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司，北京 101107）

生物胺是氨分子中1～3個(gè)氫原子被烷基或芳基取代后而生成的物質(zhì)[1]。生物體自身合成的適量生物胺具有促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝活力等生理功能。同時(shí)，生物胺也是一類對(duì)多種行為有潛在效應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，是多數(shù)有精神作用功能的分子和精神類藥物的作用靶點(diǎn)[2]。人體除了自身合成生物胺之外，主要通過(guò)食用微生物參與/混入加工的食品或飲品攝入。發(fā)酵型干酪、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵酒等產(chǎn)品中生物胺含量較高，其含量與原料、加工或發(fā)酵工藝及貯存條件等均直接相關(guān)[3-6]。

消費(fèi)者在食用含過(guò)量酪胺的干酪后出現(xiàn)嚴(yán)重的高血壓癥狀[7]，造成血管膨脹，導(dǎo)致血壓波動(dòng)和頭痛、腸部痙攣、腹瀉和嘔吐等[8-9]。尤其是腐胺、尸胺、精胺和亞精胺可以與食物中的亞硝酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生致癌物質(zhì)亞硝胺，增加了其毒性[10]。有學(xué)者調(diào)查了韓國(guó)市場(chǎng)上發(fā)酵乳制品中生物胺含量，發(fā)現(xiàn)在攪拌型和飲用型酸奶中生物胺分別為2.50～26.66 mg/kg和0.14～17.25 mg/kg，其中攪拌型酸奶中組胺含量相對(duì)較高，但在飲用型酸奶中尸胺含量相對(duì)較高[5]。目前，發(fā)酵乳制品已成為中國(guó)乳制品行業(yè)新的增長(zhǎng)點(diǎn)[11]，但是對(duì)我國(guó)市售發(fā)酵乳制品中生物胺含量方面研究較少，尤其對(duì)我國(guó)邊疆地區(qū)傳統(tǒng)干酪中生物胺含量的調(diào)查鮮有報(bào)道。歐美國(guó)家的干酪種類多樣，以酶凝干酪為主，多種干酪有較長(zhǎng)的后熟過(guò)程。目前，學(xué)者研究了多種不同干酪中生物胺的含量，其中組胺和酪胺是干酪中含量較高的生物胺。IBRAHIM E M等[12]利用高效液相色譜法測(cè)定了埃及市場(chǎng)上切達(dá)干酪、Ras干酪和高德干酪中酪胺、組胺和尸胺的含量，結(jié)果表明切達(dá)干酪中含有最高的酪胺和尸胺含量，分別為221.2 mg/kg和103.6 mg/kg；Ras干酪中組胺含量最高，為174.3 mg/kg。BONETTA S等[13]報(bào)道了意大利羊乳干酪（Robiola di Roccaverano）中的生物胺含量，結(jié)果表明，酪胺是含量最高的生物胺，在樣品中均含有組胺，在后熟的干酪樣品中，酪胺和組胺最高量分別可達(dá)2 067 mg/kg和1786mg/kg。本研究利用反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）法對(duì)我國(guó)市售傳統(tǒng)干酪產(chǎn)品中8種主要生物胺的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的安全生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）、丹磺酰氯（純度＞99%）：美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純）：美國(guó)Merck公司；超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

17種干酪樣品：購(gòu)于內(nèi)蒙古、新疆、西藏、云南、北京等地市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器：日本島津公司；Biofuge Primo離心機(jī)、19.5L（2842）水浴鍋：美國(guó)Thermal Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 干酪中生物胺含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測(cè)定》中的反相高效液相色譜法，具體方法如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

制備色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，并稀釋成0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、15.0 μg/mL、20.0 μg/mL的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合系列溶液。用丙酮配制10.0 mg/mL的丹磺酰氯儲(chǔ)備液。所有溶液均避光保存于4℃冰箱中。

（2）樣品前處理

樣品前處理方法參照GB/T 5009.208—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測(cè)定》，并稍作修改。稱取攪碎后的干酪樣品10.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，混合均勻，勻漿提取30 min，3 600r/min離心10min，收集上清液于50mL容量瓶中；殘?jiān)匦绿崛?。上清液合并，?.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，過(guò)濾至燒杯中。

取15 mL樣品提取液加入50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，在漩渦混合器上混勻2min后靜置分層（或3600r/min離心5 min），棄去正己烷層，再加入10 mL正己烷重復(fù)操作1次，分層后取出正己烷層，保留提取液。

向上述提取液中加入適量NaCl至飽和，移取上述飽和后的提取液置于50 mL離心管中。取10 mL的溶液于50 mL的離心管中，加入1.3 mL 2.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=12。加入5 mL的正丁醇-三氯甲烷（1∶1，V/V），漩渦混合振蕩5 min，3 600 r/min離心10 min，吸取有機(jī)相，重復(fù)萃取2次，合并萃取液于25 mL具塞試管中。加入0.2 mL的1.0mol/L鹽酸，混合后在40℃條件下氮?dú)獯蹈?。加?.5mL的0.1 mol/L鹽酸溶液溶解殘留物，待衍生。

（3）樣品衍生

取0.5mL混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液或樣品，置于具塞試管中，加入200 μL 2.0 mol/L氫氧化鈉溶液，300 μL飽和碳酸氫鈉溶液、10 mg/mL丹磺酰氯溶液1.0 mL，在旋渦振蕩儀上混合振蕩，置于60℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，期間取出振蕩兩次。加入50 mg/mL谷氨酸鈉（用飽和碳酸氫鈉配制）100 μL，振蕩后60 ℃保溫15 min，取出，加入1.0 mL超純水，40℃水浴條件下用氮?dú)獬ケ?。之后加?.0 mL乙醚，旋渦振蕩儀上混合2 min，靜置，待分層后取出上層有機(jī)相，加入3.0 mL乙醚重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃條件下氮?dú)獯蹈?。加?.0 mL甲醇溶解殘留物，振蕩混合。用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，濾液待測(cè)。

（4）反相高效液相色譜法色譜條件

色譜條件：歐姆尼C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相B：甲醇；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。色譜工作站為日本島津公司的LC Solution系統(tǒng)。

表1 利用反相高效液相色譜測(cè)定8種主要生物胺的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of 8 main biogenic amines analysis by RP-HPLC

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

所有的干酪樣品均制備3個(gè)平行樣品，重復(fù)測(cè)定3次。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS（16.0版）計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行方差分析與相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、檢出限和定量限

將0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，按照各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以信噪比（S/N）＞3作為檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以信噪比＞10作為定量限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 生物胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Regression equations of the standard curve,correlation coefficients,linearity range,limits of detection and limit of quantitation of biogenic amines derivatives

由表2可知，各生物胺衍生物線性回歸方程在0.50～20 μg/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2均≥0.990，符合測(cè)定的要求。各生物胺（除了組胺）的檢出限在0.172～0.443μg/mL，定量限在0.520～1.341μg/mL，組胺的檢出限為3.325μg/mL，定量限為10.075 μg/mL。結(jié)果表明該方法對(duì)生物胺（除組胺）靈敏度高，可以滿足樣品測(cè)定的要求。

2.2 精密度試驗(yàn)

在對(duì)10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)衍生樣品連續(xù)進(jìn)樣5次的試驗(yàn)中，色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺測(cè)定，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，保留時(shí)間RSD值均＜2%，生物胺質(zhì)量濃度的RSD值均＜5%（尸胺、組胺除外），精密度符合檢測(cè)要求。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在樣品中加入質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，平行測(cè)定6次，8種生物胺的加標(biāo)回收率見(jiàn)表4。由表4可知，各生物胺的加標(biāo)回收率在94.9%～114.4%，經(jīng)計(jì)算其回收率的RSD值均＜10%，因此該方法準(zhǔn)確可靠，可用于檢測(cè)干酪中生物胺的含量。

表4 干酪樣品中生物胺的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rate tests of biogenic amines in cheese samples

2.4 中國(guó)傳統(tǒng)干酪樣品中生物胺含量

本研究對(duì)17種中國(guó)傳統(tǒng)干酪樣品中8種主要生物胺含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。在17種干酪樣品中，均可檢測(cè)到不同含量的8種生物胺，不同干酪樣品間生物胺含量在1.296～41.268 mg/kg，原因可能是由于樣品均為自然發(fā)酵而成，原料和環(huán)境因素的不同，直接導(dǎo)致不同干酪樣品中微生物組成不同，進(jìn)而使得不同干酪樣品之間生物胺含量差別較大[14]。王曉雯[14]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了14種新疆哈薩克族傳統(tǒng)奶酪的菌群組成，結(jié)果表明不同樣品中微生物群落表現(xiàn)出一定的種類差異和地區(qū)差異，乳桿菌（Lactobacillus）、腸球菌（Enterococci）、明串珠球菌（Leuconostoc）及微球菌（Micrococci）在樣品中的相對(duì)豐度不高，但在各樣品中均有分布，各樣品間的菌群多樣性表現(xiàn)出差異；蔣利亞等[15]報(bào)道了內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的種類，其中分離得到乳酸菌16株，酵母菌11株。因此，不同地區(qū)干酪樣品中微生物組成存在較大差異。目前，在乳品工業(yè)中作為發(fā)酵劑使用的一些微生物（如瑞士乳桿菌等），已被確認(rèn)具有產(chǎn)組胺的能力。腸球菌是多種手工干酪中天然菌群的重要組成部分，GALGANO F等[16]認(rèn)為在Semicotto Caprino干酪中腸球菌具有較強(qiáng)的脫羧酶活性，可以酪氨酸和苯丙氨酸為底物分別產(chǎn)生酪胺和2-苯乙胺，但不能產(chǎn)生組胺和腐胺。

在17種干酪樣品中，有14種樣品的生物胺含量低于10 mg/kg，只有3種樣品中生物胺含量超過(guò)10 mg/kg，其中干酪樣品10中生物胺含量為41.268mg/kg，為所有樣品中生物胺含量最高的樣品，這是由樣品中腐胺含量較高導(dǎo)致的（21.850 mg/kg）。干酪樣品1中生物胺含量為18.457 mg/kg，主要是由較高的組胺含量引起的（11.360 mg/kg）。目前，在乳制品中生物胺含量還沒(méi)有官方限量規(guī)定，根據(jù)在魚及魚類制品中規(guī)定組胺含量≤100 mg/kg，總生物胺含量≤1 000 mg/kg。但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，組胺是8種主要生物胺中毒性最強(qiáng)的生物胺，干酪樣品1中高含量的組胺可能存在安全隱患[17]。通過(guò)以上樣品中生物胺含量比較可以得出，不同樣品中含量較高的生物胺種類不同。原因可能是不同樣品間原料、加工工藝不同，導(dǎo)致微生物菌群差異，直接造成各樣品中含量較高的生物胺種類不同[18]。

表5 中國(guó)傳統(tǒng)干酪樣品中生物胺含量檢測(cè)結(jié)果Table 5 Detection results of biogenic amines contents in Chinese traditional cheese samples

有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，干酪中檢測(cè)出的生物胺主要有酪胺、組胺、尸胺、腐胺、色胺和β-苯乙胺等，其中酸凝干酪的生物胺含量最高，平均含量為1 460 mg/kg，其次是水洗干酪（220～388 mg/kg），藍(lán)紋干酪（188～351 mg/kg）和硬質(zhì)干酪（167～318 mg/kg），新鮮干酪（32.1～172 mg/kg）中生物胺含量最低。干酪中生物胺的產(chǎn)生主要在后熟過(guò)程中，是微生物在干酪后熟過(guò)程中使蛋白質(zhì)水解及氨基酸脫羧而產(chǎn)生的。有研究發(fā)現(xiàn)意大利Semicotto Caprino干酪中所有生物胺在后熟過(guò)程中均呈增加的趨勢(shì)，其中腐胺、色胺和酪胺的增加比較多。在后熟的前15 d之內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到組胺，但在后熟結(jié)束（60 d）時(shí)能檢測(cè)到104 mg/kg的組胺。在后熟過(guò)程中，生物胺含量的增加與游離氨基酸含量的增加呈現(xiàn)相關(guān)性，其中產(chǎn)生物胺的菌株都具有較好的水解蛋白質(zhì)的活性[16]。在本研究中，由于采用的我國(guó)傳統(tǒng)干酪樣品均采用自然發(fā)酵，沒(méi)有長(zhǎng)的后熟過(guò)程，以新鮮干酪為主，因此，其中生物胺的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)外經(jīng)過(guò)后熟的干酪中生物胺的含量[16]。

2.5 干酪樣品中生物胺含量的相關(guān)性分析

為探索生物胺相互之間的關(guān)系，本研究對(duì)干酪中不同種類生物胺含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如表6所示。由表6可知，色胺除了與苯乙胺顯著相關(guān)外（P＜0.01），與其他6種生物胺均沒(méi)有顯著相關(guān)性；腐胺與尸胺、酪胺、亞精胺之間均具有顯著相關(guān)性（P＜0.01）；尸胺與腐胺、酪胺、亞精胺和精胺之間均具有顯著相關(guān)性（P＜0.01）；組胺與精胺（P＜0.01），酪胺和亞精胺之間具有顯著相關(guān)性（P＜0.01）。原因可能是游離氨基酸含量不同，也就是生物胺產(chǎn)生的底物濃度之間沒(méi)有相關(guān)性、還有產(chǎn)脫羧酶活性的細(xì)菌、非發(fā)酵劑等不一致[20-21]，比如一些乳酸菌（Lactobacilli）的混合菌可生成組胺、酪胺和尸胺，而一些耐鹽的Lactobacilli可以生成大量的尸胺，一定程度上也形成酪胺；腸桿菌（Enterobacteriaceae）則可能有生成腐胺和尸胺的能力等[22]。

表6 生物胺含量之間的相關(guān)性Table 6 Correlation of the biogenic amines contents

3 結(jié)論

本研究利用反相高效色譜法對(duì)中國(guó)市場(chǎng)上傳統(tǒng)干酪中生物胺的含量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，反相高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于測(cè)定干酪中生物胺含量。在所采集的17個(gè)樣品中8種生物胺含量多少不一，生物胺總量在1.296～41.268 mg/kg范圍內(nèi)，均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求，僅有3個(gè)樣品生物胺含量較高，其中有14個(gè)樣品的生物胺總量低于10 mg/kg。第10號(hào)干酪生物胺含量為41.268 mg/kg，為所有樣品中含量最高，其次為第1號(hào)樣品和第9號(hào)樣品，分別為18.457 mg/kg和10.353 mg/kg。但與國(guó)外干酪相比，中國(guó)干酪中生物胺含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于危害含量。相關(guān)性分析顯示，色胺與苯乙胺，腐胺與尸胺、酪胺、亞精胺之間，組胺與精胺之間，酪胺與精胺之間在0.01水平上具有顯著相關(guān)性，具體產(chǎn)生機(jī)理需進(jìn)一步研究。

[1]SHALABY A R.Significance of biogenic amines to food safety and human health[J].Food Res Int,1996,29(7):675-690.

[2]SANTOS M H S.Biogenic amines:their importance in foods[J].Int J Food Microbiol,1996,29(2):213-231.

[3]LORENZO C,BORDIGA M,PEREZ-áLVAREZ E P,et al.The impacts of temperature,alcoholic degree and amino acids content on biogenic amines and their precursor amino acids content in red wine[J].Food Res Int,2017,99(Part 1):328-335.

[4]MANETTA A C,DI GIUSEPPE L,TOFALO R,et al.Evaluation of biogenic amines in wine:determination by an improved HPLC-PDA method[J].Food Control,2016,62:351-356.

[5]MIN J S,LEE S O,JANG A,et al.Quantitative analysis of biogenic amines in raw and processed foods of animal origin on Korean domestic market[J].As Aus J An,2004,17(17):1764-1768.

[6]ZHANG Q Q,JIANG M,RUI X,et al.Effect of rose polyphenols on oxidation,biogenic amines and microbial diversity in naturally dry fermented sausages[J].Food Control,2017,78:324-330.

[7]DOEGLAS H M G,HUISMAN J,NATER J P.Histamine intoxication after cheese[J].Lancet,1967,290(7530):1361-1362.

[8]LADERO V,CALLESENRIQUEZ M,FERNANDEZ M,et al.Toxicological effects of dietary biogenic amines[J].Curr Nutr Food Sci,2010,6(2):145-156.

[9]TEN B B,DAMINK C,JOOSTEN H M,et al.Occurrence and formation of biologically active amines in foods[J].Int J Food Microbiol,1990,11(1):73-84.

[10]LIU J,REN J,SUN K.J.Safety of biogenic amines in foods[J].Food Sci,2013,34(5):322-326.

[11]FUQUAY J W.Encyclopedia of Dairy Sciences[M].Londen:Elsevier Science Publishing Co.Inc.,2011:652-660.

[12]IBRAHIM E M,AMER A A.Comparison of biogenic amines levels in different processed cheese varieties with regulatory specifications[J].World J Dairy Food Sci,2010,5(2):127-133.

[13]BONETTA S,BONETTA S,CARRARO E,et al.Detection of biogenic amine producer bacteria in a typical Italian goat cheese[J].J Food Prot,2008,71(1):205-209.

[14]王曉雯.新疆塔城地區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中非發(fā)酵劑乳酸菌多樣性的研究[D].石河子：石河子大學(xué)，2016.

[15]蔣利亞，潘 波.中國(guó)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌和酵母菌的分離鑒定[J].北京農(nóng)業(yè)，2011，24（12）：109-110.

[16]GALGANO F,SUZZI G,FAVATI F,et al.Biogenic amines during ripening in'Semicotto Caprino'cheese:role ofEnterococci[J].Int J Food Sci Tech,2001,36(2):153-161.

[17]PRADENAS J,GALARCE-BUSTOS O,HENRIQUEZ-AEDO K,et al.Occurrence of biogenic amines in beers from Chilean market[J].Food Control,2016,70:138-144.

[18]馬德勝，張國(guó)農(nóng)，解國(guó)富，等.干酪成熟初期產(chǎn)生生物胺影響因素的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2007，35（5）：22-25.

[19]BIMALC，張國(guó)農(nóng)，顧敏鋒.干酪中的生物胺[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33（1）：38-42.

[20]KEBARY K M K,El-SONBATY A H,BADAWI R M.Effects of heating milk and accelerating ripening of low fat Ras cheese on biogenic amines and free amino acids development[J].Food Chem,1999,64(1):67-75.

[21]SCHNELLER R,GOOD P,MARTIN J.Influence of pasteurized milk,raw milk and different ripening cultures on biogenic amine concentrations in semi-soft cheeses during ripening[J].Z Lebensm Unters Forsch A,1997,204(4):204-272.

[22]VALSAMAKI K,MICHAELIDOU A,POLYCHRONIADOU A.Biogenic amine production in feta cheese[J].Food Chem,2000,71(2):259-266.