酪酸菌MYS66發(fā)酵條件研究

李忠玲，張紅艷，傅 博，岳淑寧*

（1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710043；3.中國科學(xué)院 西北生物農(nóng)業(yè)中心，陜西 西安 710043）

酪酸菌即丁酸梭菌（Clostridium butyricum），存在于土壤、污泥、人和動(dòng)物腸道以及干酪和自然發(fā)酵的酸奶、酒曲和窖泥中[1]。丁酸梭菌作為一種目前正被逐步廣泛使用的益生菌，已被許多研究證明能促進(jìn)動(dòng)物生長、促進(jìn)乳酸菌等其它有益菌群的增殖、產(chǎn)生B族維生素、維生素K、丁酸等物質(zhì)，并能在腸粘膜表面形成微生物屏障，阻止有害菌的定植和入侵，有效地改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡，對(duì)宿主產(chǎn)生各種健康作用[2-3]。丁酸梭菌也能對(duì)一些腸道炎癥有治療效果，HAYASHI A等[4]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌誘使腸道巨噬細(xì)胞增殖以抑制結(jié)腸炎。KANAI T等[5]運(yùn)用待測(cè)序技術(shù)等手段表明，丁酸梭菌可作為益生菌誘發(fā)骨髓分化巨噬細(xì)胞在炎癥黏膜上通過Ⅱ型toll樣受體來抑制炎癥。除了能調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌落平衡，提高免疫力外，也有報(bào)道稱酪酸菌對(duì)肝臟損傷有治療和預(yù)防的效果[6]，而且還有研究表明酪酸菌對(duì)治療癌癥也有一定功效[7-8]。酪酸菌具有耐高溫、耐高壓、耐胃酸及耐膽鹽等生物學(xué)特性，并在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用效果明顯。作為綠色新型活菌制劑，丁酸梭菌有著十分廣泛的研究前景。同時(shí)，有研究表明，酪酸菌還可用于制備丁酸、1,3-丙二醇[9-10]、酶制劑[11]等，隨著相關(guān)研究的深入，酪酸菌必將越來越多的造福人類。目前對(duì)于酪酸菌的進(jìn)一步推廣應(yīng)用，一方面需要更細(xì)化更系統(tǒng)地研究闡明其具體作用機(jī)制，另一方面則是其發(fā)酵工藝的優(yōu)化。酪酸菌的相關(guān)報(bào)道中多以葡萄糖為碳源[12-14]，成本較高，本研究以玉米淀粉糖化液為碳源，對(duì)酪酸菌MYS66的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，為該菌工業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；并且研究了常用抗生素對(duì)該菌存活率影響，為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

酪酸菌（Clostridium butyricum）MYS66：初始菌種購自中國科學(xué)院微生物研究所，經(jīng)陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所誘變篩選并編號(hào)保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.0。115℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L（制成糖化液），豆粕粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏6 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，NaCl 0.5g/L，pH 7.0。115℃滅菌20 min。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

K2HPO4·3H2O、KH2PO4（分析純）：廣西汕頭市西隴化工廠；MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaHCO3、CaCl2、NaCl（均為分析純）：西安化學(xué)試劑廠；胰蛋白胨、蛋白胨和酵母膏（均為生化試劑）：北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸粘桿菌素B：河南普華動(dòng)物藥業(yè)有限公司；桿菌肽：美國Sigma公司；莫能霉素鈉、鹽酸林可霉素、新霉素硫酸鹽、磺胺嘧啶：上海源葉生物科技有限公司；酒石酸泰樂菌素：徐州金牌藥業(yè)有限公司；液化酶、糖化酶：寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；玉米粉、豆粕粉均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

DV-650型桌上式（垂直送風(fēng)）凈化工作臺(tái)：蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；PYX-DHS-35X40-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；YX280蒸汽滅菌鍋：上海三中醫(yī)療器械有限公司；HH-W21-600-S電熱恒溫水溫箱：上海醫(yī)療器械七廠；PHS-3C型酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 種子活化

取-20℃甘油管保藏的菌種，以1%接種于裝有10 mL種子培養(yǎng)基的厭氧管中，37℃條件下靜態(tài)厭氧活化20 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)

將活化的種子液以5%的接種量接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中。置培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)20h。

1.3.3 玉米粉糖化液的制備

玉米粉20 g/L，添加0.5 mg/g原料的CaCl2，在80～85 ℃條件下添加10 U/g原料的液化酶，保溫至液化結(jié)束，液化終點(diǎn)用稀碘液檢測(cè)，稀碘液不變藍(lán)；將液化液升溫95～100℃保溫10 min進(jìn)行滅酶，之后，降溫至55～60℃，調(diào)pH 4.5，添加300 U/g原料的糖化酶，保溫2 h。

1.3.4 培養(yǎng)方法

將生長好的種子液以5%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL厭氧瓶中。置于培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。

1.3.5 菌體濃度測(cè)定

采用平板活菌計(jì)數(shù)法：取培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵液按10倍稀釋法稀釋成不同濃度稀釋液，分別吸取3種合適的稀釋液各0.1mL置于事先融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏、蛋白胨倒好的固體肉湯平板上，用無菌涂布棒涂均勻，每一個(gè)稀釋度涂3個(gè)平皿，涂完后倒置厭氧罐中37℃培養(yǎng)48h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.6 芽孢計(jì)數(shù)方法

菌液于80℃，10 min熱處理殺滅營養(yǎng)體后，采用上述活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算芽孢濃度，并以芽孢數(shù)與菌體濃度的比記為芽孢率。

1.3.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

以菌體濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同水平溫度、初始pH、接種量、無機(jī)鹽添加量對(duì)菌體濃度的影響，確定發(fā)酵參數(shù)。

1.3.8 抗生素添加方法

將相應(yīng)抗生素按不同濃度過濾除菌后混入降溫至50℃的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，同時(shí)以不加抗生素的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線

將液體菌種按5%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)32 h，定時(shí)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制生長曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，該菌株在8 h達(dá)到生長對(duì)數(shù)期，18 h達(dá)到穩(wěn)定期。

圖1 酪酸菌MYS66的生長曲線Fig.1 Growth curve ofClostridium butyricumMYS66

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵的影響

溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能以及細(xì)胞膜的流動(dòng)性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，過低的溫度會(huì)抑制酶活性，降低細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)。分別在33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃條件下培養(yǎng)20h，觀察培養(yǎng)溫度對(duì)酪酸菌MYS66菌體濃度的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在溫度低于37℃時(shí)隨著溫度的升高菌體濃度有一定的增長，在37℃達(dá)到最大值，之后隨著溫度的提高菌體濃度呈下降趨勢(shì)。因此，確定酪酸菌MYS66的最適培養(yǎng)溫度為37℃。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of Clostridium butyricumMYS66

2.3 初始pH值對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響

pH可通過影響蛋白質(zhì)等生物大分子所帶電荷的變化引起細(xì)胞膜電荷變化，導(dǎo)致微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力改變，因此培養(yǎng)基的pH對(duì)微生物的生長有重要影響。試驗(yàn)將初始pH設(shè)為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，37℃條件下靜置培養(yǎng)20 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，考察pH對(duì)菌株MYS66生長的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌體濃度隨著初始pH的升高有一定的增長，在初始pH為7.2時(shí)達(dá)到最大，之后隨著初始pH的升高呈下降趨勢(shì)，因此，確定酪酸菌MYS66的最適初始pH為7.2。在整體變化趨勢(shì)上，初始pH在7.0～7.6比較平穩(wěn)，說明此區(qū)間是該菌的耐受范圍，在此區(qū)間之外菌體濃度下降趨勢(shì)明顯。

圖3 初始pH對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on the growth ofClostridium butyricum MYS66

2.4 接種量對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響

接種量的大小決定生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短延滯期，減少雜菌的生長機(jī)會(huì)。但接種量過大會(huì)因前期營養(yǎng)消耗過快而使最終菌體濃度降低，同時(shí)，接種量過大會(huì)移入過多代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；相反，接種量過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵的生產(chǎn)效率。試驗(yàn)分別采用2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%的接種量，37℃靜置培養(yǎng)20 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌體濃度隨著接種量的增大而增加，在接種量為4%時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著接種量的增大菌體濃度呈下降趨勢(shì)。因此，確定酪酸菌MYS66的最適接種量為4%。

圖4 接種量對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth ofClostridium butyricum MYS66

2.5 無機(jī)鹽對(duì)生長的影響

某些金屬離子可促進(jìn)菌體生長（如K+、Ca2+和Mg2+等）；也有報(bào)道稱添加適量CO32-可緩沖酸度變化，并且釋放出的CO2有助于芽孢生成[15]。該試驗(yàn)主要研究了K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaHCO3、CaCl2和NaCl添加量對(duì)發(fā)酵的影響，各無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)條件為初始pH7.2，37℃靜置培養(yǎng)20h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

表1 無機(jī)鹽優(yōu)化單因素試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor experiments for inorganic salt optimization

由表1和圖5可知，各無機(jī)鹽最佳添加量分別為：KH2PO41.0g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，NaHCO31.0 g/L，CaCl20.2 g/L，NaCl 1.0 g/L。

經(jīng)過以上試驗(yàn)，得到了最佳培養(yǎng)條件和各無機(jī)鹽單因素最佳添加量，并以此條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，即將培養(yǎng)基組成優(yōu)化為玉米粉20 g/L（制成糖化液），豆粕粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏6 g/L，K2HPO4·3H2O 1.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，NaHCO31.0g/L，CaCl20.2g/L，NaCl1.0g/L，在pH7.2，接種量4%，37℃的條件下靜置培養(yǎng)20h，此時(shí)菌體濃度達(dá)到2.66×108CFU/mL。

圖5 無機(jī)鹽對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on the growth ofClostridium butyricum MYS66

2.6 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵

以優(yōu)化的條件進(jìn)行50 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)，即50 L發(fā)酵罐，優(yōu)化后的培養(yǎng)基裝料量35 L，接種量4%，37℃靜置發(fā)酵32 h，測(cè)菌體濃度，芽孢濃度，計(jì)算芽孢率，結(jié)果見圖6。經(jīng)50L發(fā)酵罐發(fā)酵，在發(fā)酵32h，菌體濃度為2.64×108CFU/mL，芽孢濃度達(dá)到2.49×108CFU/mL，芽孢率達(dá)到94.3%。

圖6 酪酸菌MYS66在50 L發(fā)酵罐中的生長情況Fig.6 Growth ofClostridium butyricumMYS66 in 50 L fermenter

2.7 幾種常用抗生素對(duì)酪酸菌存活率的影響

大量試驗(yàn)證明，將益生素分別與抗生素、寡糖、酸化劑、中草藥、肽等合理配伍表現(xiàn)出了理想的使用效果[16]。在生產(chǎn)中因動(dòng)物防病和治病的需要可能會(huì)使用某些抗生素類藥物，這些藥物也許會(huì)對(duì)飼用益生菌酪酸菌MYS66的生長產(chǎn)生影響，因此研究常用抗生素對(duì)該菌的影響非常必要，希望對(duì)其在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用有所幫助。主要研究了硫酸粘桿菌素B、桿菌肽、莫能霉素鈉、鹽酸林可霉素、新霉素硫酸鹽、磺胺嘧啶、酒石酸泰樂菌素8種抗生素對(duì)酪酸菌MYS66存活率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 幾種常用抗生素對(duì)酪酸菌MYS66存活率的影響Fig.7 Effects of several common antibiotics on the survival rate of Clostridium butyricumMYS66

由圖7可知，各抗生素對(duì)酪酸菌存活率的影響由低到高的順序?yàn)榱蛩嵴硹U菌素B＜莫能霉素鈉＜鹽酸林可霉素＜酒石酸泰樂菌素＜桿菌肽＜磺胺嘧啶＜新霉素硫酸鹽＜鹽酸金霉素。

3 結(jié)論

通過對(duì)酪酸菌發(fā)酵條件的研究，得到了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為玉米粉20 g/L（制成糖化液），豆粕粉10 g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏6g/L，K2HPO4·3H2O1.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.2 g/L，NaHCO31.0 g/L，CaCl20.2 g/L，NaCl 1.0 g/L；確定最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.2，培養(yǎng)溫度37.0℃，接種量4%。經(jīng)50L發(fā)酵罐發(fā)酵32h時(shí)，菌體濃度為2.64×108CFU/mL，芽孢濃度為2.49×108CFU/mL，芽孢率達(dá)到94.3%。通過常用抗生素對(duì)該菌存活率影響的研究，結(jié)果表明：各抗生素對(duì)酪酸菌存活率影響由低到高的順序?yàn)榱蛩嵴硹U菌素B＜莫能霉素鈉＜鹽酸林可霉素＜酒石酸泰樂菌素＜桿菌肽＜磺胺嘧啶＜新霉素硫酸鹽＜鹽酸金霉素。以上研究結(jié)果為酪酸菌MYS66進(jìn)一步生產(chǎn)及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1]夏會(huì)麗，陳思思，陳 雄，等.丁酸梭菌的鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2017，38（8）：56-62.

[2]陳旻遠(yuǎn)，賈聰慧，洪奇華，等.丁酸梭菌對(duì)動(dòng)物腸道生態(tài)的影響及作用機(jī)制[J].飼料研究，2016（6）：5-8.

[3]李賢宇，張 蕊，周 博.酪酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].天津化工，2010，24（1）：22-24.

[4]HAYASHI A,SATO T,KAMADA N,et al.A single strain ofClostridium butyricuminduces intestinal IL-10-producing macrophages to suppress acute experimental colitis in mice[J].Cell Host Microbe,2013,13(6):711-722.

[5]KANAI T,MIKAMI Y,HAYASHI A．A breakthrough in probiotics:Clostridium butyricumregulates gut homeostasis and anti-inflammatory response in inflammatorybowel disease[J].J Gastroenterol,2015,50(9):928-939.

[6]田口信洋.具有預(yù)防及治療肝臟損害功能的丁酸梭菌，以及由其培養(yǎng)物制成的肝保護(hù)劑、食品和飼料CN1246144[P].2000-03-01.

[7]呂建平，徐秀麗，付孟莉.酪酸梭菌的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].臨床合理用藥雜志，2010，3（20）：159-160.

[8]MASAHIDE S,MANO H,TAKASHI Y,et al.Clostridium butyricum MIYAIRI 588 shows antitumor effects by enhancing the release of TRAIL from neutrophils through MMP-8[J].Int J Oncol,2013,42(3):903-911.

[9]CHATZIFRAGKOU A AGGELIS G,KOMAITIS M,et al.Impact of anaerobiosis strategy and bioreactor geometry on the biochemical response ofClostridium butyricumVPI 1718 during 1,3-propanediol fermentation[J].Bioresource Technol,2011,102(22):10625-10632.

[10]PAPANIKOLAOU S,FICK M,AGGELIS G.The effect of raw glycerol concentration on the production of 1,3-propanediol byClostridium butyricum[J].J Chem Technol Biot,2004,79(11):1189-1196.

[11]姜芳芳，李圣杰，丁 軻，等.丁酸梭菌C.L24蛋白酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，37（1）：63-67.

[12]余國蓮，杜云平，梁健良，等.丁酸梭菌培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2013（5）：31-32.

[13]劉 寅，和晶亮，毛多斌，等.嗜熱丁酸梭菌厭氧丁酸發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)，2013，34（6）：50-53.

[14]江 丹.丁酸梭菌的培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)醇甘薦渣和小桐子果殼產(chǎn)氯氣的研究[D].北京：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2016.

[15]陳秋紅，孫 梅，施大林，等.益生菌酪酸菌CB-7發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究[J].飼料研究，2009（4）：7-10.

[16]喬家運(yùn)，王志祥，李?；ǎ?益生素與幾種飼料添加劑的配伍在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用[J].獸藥與飼料添加劑，2005（1）：15-17.