奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)的快速檢測(cè)及其臨床意義

楊紅英,高 健,劉修權(quán),蘇敬良,韓 博

(1.寧夏吳忠市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,寧夏 吳忠 751100;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

乳汁體細(xì)胞數(shù)是反映奶牛隱性乳房炎的一個(gè)重要指標(biāo),我國(guó)規(guī)定隱性乳房炎的判定標(biāo)準(zhǔn)為體細(xì)胞數(shù)大于50萬(wàn)/mL。目前,檢測(cè)奶樣體細(xì)胞數(shù)的方法包括間接計(jì)數(shù)法和直接計(jì)數(shù)法。間接計(jì)數(shù)法包括加州乳房炎檢測(cè)法(CMT)及其衍生的北京乳房炎檢測(cè)法(BMT)、上海乳房炎檢測(cè)法(SM T)[1]等,均屬定性計(jì)數(shù),多依靠檢測(cè)者的經(jīng)驗(yàn)而定,結(jié)果不夠精確。直接計(jì)數(shù)法包括體細(xì)胞電子計(jì)數(shù)法(ESCC)、桶奶細(xì)胞計(jì)數(shù)法(BMCC)、牛只細(xì)胞計(jì)數(shù)法(ICCC)等[2],可對(duì)SCC進(jìn)行定量檢測(cè),但是檢測(cè)費(fèi)用高,使用不方便。便攜式體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀C-Reader[3]由韓國(guó)研制,具有價(jià)格低廉、輕巧便攜、操作方便和快速準(zhǔn)確等特點(diǎn),能精確測(cè)定SCC。本試驗(yàn)旨在用便攜式體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀C-Reader,定量檢測(cè)奶樣中的SCC,以此快速判定奶牛隱性乳房炎,從而及時(shí)制定治療方案,減少乳房炎引起的損失。

1 材料與方法

1.1 待檢奶樣 自2008年3月份至2008年8月份選擇北京及河北地區(qū)10個(gè)牛場(chǎng)的111頭無(wú)乳房炎癥狀奶牛,無(wú)菌采集428份乳汁,置于冰盒送回實(shí)驗(yàn)室,做SCC檢測(cè)。

1.2 主要儀器 便攜式體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀C-Reader(韓國(guó)Digital Bio Technology公司),立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊公司),電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHX-9073B型(上海福瑪設(shè)備有限公司),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海?，斣O(shè)備有限公司),臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),光學(xué)顯微鏡(Olympus公司),超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),奶樣瓶(北京奶牛中心)。

1.3 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,7.5%氯化鈉甘露醇瓊脂培養(yǎng)基,KF鏈球菌瓊脂,營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-15 e,葡萄球菌屬細(xì)菌生化編碼鑒定管TH-16 S(杭州天和微生物試劑有限公司),TSA瓊脂,TSB肉湯(美國(guó)BD公司),靛基質(zhì),苯丙氨酸,硝酸鹽還原試劑,葡萄糖酸鹽,甲基紅(MR),馬尿酸鹽,溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán),液體石蠟、丙三醇等(杭州天和微生物試劑有限公司),BMT診斷液(北京奶牛中心),含5%去纖維綿羊血的TSA和普通瓊脂平板均自行配制。

1.4 體細(xì)胞數(shù)檢測(cè) 采集A牛場(chǎng)53份奶樣,同時(shí)用BMT法和C-Reader對(duì)其體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。BMT法是根據(jù)測(cè)試盤(pán)上有無(wú)絮狀物及沉淀程度來(lái)判定結(jié)果(判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1);C-Reader可直接顯示出奶樣中的體細(xì)胞數(shù)。

表1 BMT法判斷隱性乳房炎的標(biāo)準(zhǔn)

1.5 隱性乳房炎奶樣的致病菌分離鑒定 將每份隱性乳房炎奶樣(SCC＞50萬(wàn)/mL)5mL加入15mL離心管中,6000 r/min離心5 min,棄上清,無(wú)菌取0.1mL干酪樣沉淀接種于5%去纖維綿羊血-TSA培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h。挑取特征菌落于TSB肉湯中增菌培養(yǎng)18 h,然后分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉甘露醇瓊脂培養(yǎng)基、KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色鏡檢,初步判定致病菌的種屬。挑選純化好的單個(gè)菌落接種于微量發(fā)酵管中,37℃培養(yǎng)24～72 h,做生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMT法與C-Reader法定性和定量檢測(cè)53份奶樣的SCC。見(jiàn)表2。

表2 A牛場(chǎng)乳汁BMT法和C-Reader計(jì)數(shù)法檢測(cè)SCC (×105cells/mL)

從表2看出,53份奶樣分別用C-Reader法和BMT法進(jìn)行定量和定性檢測(cè),45份檢測(cè)結(jié)果是相符的,相符率僅為84.9%。由于BM T法通常是檢測(cè)者依其個(gè)人經(jīng)驗(yàn)主觀判斷,因而使結(jié)果造成較大的誤差。C-Reader法能客觀精確地定量測(cè)定乳汁中的體細(xì)胞數(shù),準(zhǔn)確地反應(yīng)隱性乳房炎的發(fā)病率。

2.2 北京及河北地區(qū)10個(gè)牛場(chǎng)的隱性乳房炎發(fā)病率 隱性乳房炎頭發(fā)病率是至少有一個(gè)乳區(qū)為隱性乳房炎的奶牛頭數(shù)占檢測(cè)的所有奶牛數(shù)的百分比。乳區(qū)發(fā)病率指采集的隱性乳房炎的奶樣占總奶樣數(shù)的百分比。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3、表4和圖1。

表3 各牛場(chǎng)的隱性乳房炎頭發(fā)病率

表4 各牛場(chǎng)體細(xì)胞數(shù)0～20萬(wàn)/mL、20萬(wàn)/mL～50萬(wàn)/mL及50萬(wàn)/mL以上的奶樣數(shù)

從表3和表4可知,北京及河北地區(qū)的隱性乳房炎頭發(fā)病率為54.1%,乳區(qū)發(fā)病率為23.3%。比楊章平等報(bào)道的發(fā)病率低[4]。各牛場(chǎng)的發(fā)病率差異較大,乳區(qū)發(fā)病率比頭發(fā)病率更能客觀地體現(xiàn)出牛場(chǎng)的隱性乳房炎發(fā)病情況。由圖1可知,除F牛場(chǎng)外,其他9個(gè)牛場(chǎng)體細(xì)胞數(shù)在0～20萬(wàn)/mL的奶樣比例均明顯高于體細(xì)胞數(shù)在20萬(wàn)/mL～50萬(wàn)/mL的奶樣比例。10個(gè)牛場(chǎng)體細(xì)胞數(shù)0～20萬(wàn)/mL的奶樣占63.6%,而20萬(wàn)/mL～50萬(wàn)/mL的奶樣占13.1%,前者比例遠(yuǎn)高于后者。

2.3 奶牛隱性乳房炎致病菌的分離及鑒定 100份隱性乳房炎奶樣接種5%去纖維綿羊血-TSA培養(yǎng)基,82份奶樣細(xì)菌培養(yǎng)為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為82.0%。其中,在5%去纖維綿羊血-TSA培養(yǎng)基上,64份奶樣有1種特征性致病菌生長(zhǎng),占78.0%;15份奶樣有2種特征性細(xì)菌生長(zhǎng),占18.3%;僅有3份奶樣有3種特征性致病菌生長(zhǎng),占3.7%。

分離到的主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌在5%去纖維綿羊血-TSA培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基和KF鏈球菌培養(yǎng)基上的形態(tài)特征和革蘭染色結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 乳汁分離菌株的平板培養(yǎng)特性及革蘭染色結(jié)果

隱性乳房炎主要致病菌所占比例:經(jīng)過(guò)致病菌的選擇性培養(yǎng)和生化鑒定,對(duì)采集的100份隱性乳房炎乳樣接種培養(yǎng),致病菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為82.0%。在分離得到的103株致病菌中,鑒定出了7個(gè)種屬的100株致病菌。包括金黃色葡萄球菌64株(64.0%),表皮葡萄球菌11株(11.0%),大腸桿菌8株(8.0%),無(wú)乳鏈球菌8株(8.0%),停乳鏈球菌2株(占2.0%),傷寒沙門(mén)菌 5株(占 5.0%),肺炎克雷伯氏菌2株(2.0%)。見(jiàn)圖2。

上述結(jié)果顯示,在北京及周邊牛場(chǎng)中,引起隱性乳房炎的最主要致病菌為金黃色葡萄球菌。這與李宏勝[5]報(bào)道的停乳鏈球菌占37.78%、大腸桿菌占24.34%、無(wú)乳鏈球菌占15.56%、金黃色葡萄球菌占13.33%、綠膿桿菌占4.44%、克雷伯氏菌占2.22%和變形桿菌占2.22%和易本馳[6]報(bào)道的葡萄球菌占35.63%,鏈球菌占14.94%,革蘭陰性桿菌占49.43%差異較大。這主要與抗生素普遍應(yīng)用使鏈球菌所占比例有較大程度的降低[7]和地域性對(duì)致病菌種屬變化影響較大有關(guān)[8]?？傊?本試驗(yàn)用C-Reader對(duì)北京及河北地區(qū)的奶牛隱性乳房炎進(jìn)行了快速定量檢測(cè),并對(duì)引起隱性乳房炎的主要致病菌進(jìn)行了分離及鑒定,指出北京及河北地區(qū)導(dǎo)致隱性乳房炎的致病菌主要是金黃色葡萄球菌。

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