帶魚(yú)腸道中芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抗菌性質(zhì)研究

許本宏，林俊芳，葉志偉，郭麗瓊，陸雅琴，林金德

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，食品生物技術(shù)研究所，廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640)

近年來(lái)，我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大。但過(guò)度依賴提高養(yǎng)殖密度和過(guò)量投餌的養(yǎng)殖方式使得養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)較多嚴(yán)重問(wèn)題，如養(yǎng)殖動(dòng)物的排泄物、殘餌及死亡殘?bào)w等對(duì)水質(zhì)的污染,使得有害藻類(lèi)及病菌大量繁殖，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境日益惡化，各種水產(chǎn)動(dòng)物疾病爆發(fā)，甚至出現(xiàn)水產(chǎn)動(dòng)物大面積的死亡，給整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。目前，抗生素和化學(xué)藥物在解決這一問(wèn)題上發(fā)揮著重要作用。然而，抗生素和化學(xué)藥物只能暫時(shí)抑制病害的發(fā)生，而且會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株、藥物殘留、破壞養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)平衡和降低養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力等問(wèn)題[3]。因此研究開(kāi)發(fā)高效、廣譜、安全的新型水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗生素替代品具有重要意義。

益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物，具有促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫能力和避免耐藥性菌株的產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品、畜牧和水產(chǎn)等領(lǐng)域[4]。芽孢桿菌(Bacillus)被公認(rèn)是一種有發(fā)展前景的應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌，有穩(wěn)定性高(耐高溫、耐酸堿、耐干燥)、易加工、能分泌產(chǎn)生多種酶類(lèi)(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等)、營(yíng)養(yǎng)代謝物質(zhì)、多種抗菌活性物質(zhì)以及可作為一種水質(zhì)調(diào)節(jié)器，凈化養(yǎng)殖水環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[5-8]，使其有望在水產(chǎn)養(yǎng)殖中逐步替代抗生素的使用。

本研究從帶魚(yú)腸道中分離到1株菌株JFL15，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，初步鑒定為暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)。本研究采用牛津杯法對(duì)15種水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌進(jìn)行抑菌效果試驗(yàn)。此外，對(duì)菌株的發(fā)酵上清液的性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，適合開(kāi)發(fā)成微生物制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物及菌種

帶魚(yú)(Trichiurushaumela)購(gòu)自廣東省廣州市某市場(chǎng)，約1～2 kg。

指示菌：嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)4001、美人魚(yú)發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamsela)4002、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)4003、溶藻弧菌(V.alginolyticus)4004，由中山大學(xué)惠贈(zèng)；嗜水氣單胞菌(5101、5102、5103)、大腸桿菌(Escherichiacoli)5105、遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)5111、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)5112、溶藻弧菌(V.alginolyticus)5201、哈維氏弧菌(V.harveyi)5203、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)5205、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)5206、查氏弧菌(V.chagasii)5209由海南大學(xué)海洋學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 5 g，pH 7.27.4。

MSM培養(yǎng)基(1 L)：蔗糖20 g，NH4NO32 g，KH2PO43 g，Na2HPO410 g，MgSO40.2 g，酵母膏0.2 g，CaCl20.7 μg，MnSO41 μg。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和純化

采用平板稀釋法，取帶魚(yú)腸道內(nèi)含物于10 mL無(wú)菌的蒸餾水中，制備懸濁液，分別梯度稀釋獲得濃度為10-7、10-8、10-9的樣品溶液，移取0.1 mL樣品溶液涂布于固體初篩培養(yǎng)基(細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基)平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落反復(fù)劃線純化2～3次，4 ℃冰箱保藏、備用。

1.2.2 篩選菌株的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]中的試驗(yàn)方法，對(duì)菌株形態(tài)及生理生化特性進(jìn)行鑒定。

1.2.2.2 16S rDNA序列測(cè)定

提取菌株的基因組總DNA。16S rDNA的克隆采用細(xì)菌的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1495R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，樣品經(jīng)切膠回收后送深圳華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序的16S rDNA基因序列與GeneBank中已知的核酸序列進(jìn)行Blast分析，同源性較高的序列，用4.1軟件進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 菌株JFL15發(fā)酵上清液的性質(zhì)研究

以哈維氏弧菌[11-12]4003為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定上清液的抑菌活性，將指示菌與冷卻至50 ℃的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻倒平板，培養(yǎng)皿內(nèi)放置直徑為6 mm的無(wú)菌牛津杯，向牛津杯中加入150 μL上清液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。以孔中加入空白培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。分別考察發(fā)酵上清液對(duì)酶、溫度、pH、紫外線耐受性以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性[13]，以初步判斷菌株JFL15產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.2.3.1 酶對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

將發(fā)酵上清液分別用終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、脂肪酶37 ℃中水浴1 h，以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.2 溫度對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

將發(fā)酵上清液分別置于40、60、80、100 ℃處理30 min，另取一份121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻至室溫后，過(guò)濾除菌，以未經(jīng)溫度處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.3 pH對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

將發(fā)酵上清液分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH為1、3、5、7、9、11，室溫處理2 h，再將pH調(diào)回7.0，過(guò)濾除菌，以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.4 紫外線對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

將發(fā)酵上清液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在超凈臺(tái)紫外燈下(功率20 W輻照強(qiáng)度， 樣品與光源距離40 cm)分別照射15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h，過(guò)濾除菌，以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

將發(fā)酵上清液置于4 ℃冰箱里分別儲(chǔ)存1、7、14、21、28 d，以新鮮發(fā)酵上清液為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 菌株JFL15發(fā)酵上清液的抗菌譜測(cè)定

以嗜水氣單胞菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、查氏弧菌15株水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定上清液的抗菌譜，具體操作同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性分析采用Turkey和Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

通過(guò)對(duì)帶魚(yú)腸道內(nèi)含物中微生物的分離篩選，共獲得30株細(xì)菌菌株，其中有7株為芽孢桿菌。經(jīng)過(guò)3次MSM培養(yǎng)基液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其發(fā)酵液的抑菌活性，最終選定一株抗菌活性強(qiáng)的菌株，命名為JFL15。

2.2 菌株JFL15的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌株JFL15在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落為圓形，乳白色，邊緣不規(guī)則，表面皺褶，邊緣翹起，中間內(nèi)陷，不透明，干燥；液體培養(yǎng)后4 ℃靜止放置時(shí)有菌膜形成。革蘭氏染色陽(yáng)性，呈桿狀(圖1)。

圖1 菌株JFL15的菌落形態(tài)(左)和革蘭氏染色(右)

2.2.2 生理生化特征

菌株JFL15生理生化特征檢測(cè)結(jié)果顯示，該菌株能利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、山梨醇、甘露醇等多種碳水化合物作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，能利用硫酸銨、草酸銨、酪氨酸、組氨酸等多種無(wú)機(jī)或有機(jī)氮作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，能水解淀粉和明膠，分別能在45 ℃、pH 58、7.5% NaCl環(huán)境下生長(zhǎng)，主要生理生化特性見(jiàn)表1。

表1 菌株JFL15的生理生化特征

注：“+”：陽(yáng)性；“-”：陰性；“V”：不明顯.

2.2.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

菌株JFL15 16S rDNA基因序列測(cè)序結(jié)果表明，其大小為1538 bp。將測(cè)序獲得的序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，其與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)、暹羅芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，均在97.5%以上。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果(圖 2)顯示，菌株JFL15與暹羅芽孢桿菌在同一分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，初步確定菌株JFL15為暹羅芽孢桿菌。

2.3 暹羅芽孢桿菌JFL15發(fā)酵上清液的理化性質(zhì)研究

2.3.1 對(duì)酶的穩(wěn)定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液經(jīng)各種蛋白酶和脂肪酶處理1 h后，其抑菌活性(抑菌圈直徑大小)有少許下降，但能保持86.8%的抑菌活性(圖3)。說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液中的抗菌活性物質(zhì)對(duì)酶不敏感，同時(shí)說(shuō)明發(fā)酵上清液中的抗菌活性物質(zhì)中蛋白質(zhì)的成分很少，主要成分可能為性質(zhì)穩(wěn)定的脂肽類(lèi)化合物。

2.3.2 對(duì)熱的穩(wěn)定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液分別經(jīng)40、60、80、100 ℃和121 ℃處理30 min后，活性隨著溫度的升高呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖4。在100 ℃下處理30 min，抑菌活性還能保持75.1%，而121 ℃高壓滅菌30 min后發(fā)酵液完全失活，這可能是由于溫度100 ℃時(shí)暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液中抗菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞從而失去活性，但溫度低于100 ℃時(shí)發(fā)酵液具有較好的熱穩(wěn)定性。說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15的抗菌活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 對(duì)酸堿的穩(wěn)定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液經(jīng)不同pH處理后，pH 7時(shí)，暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液的抗菌活性最強(qiáng)。這是因?yàn)殄吡_芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵液的初始pH為7.4，所以在pH 7下處理2 h對(duì)其抑菌活性造成影響。在pH低于或高于7時(shí)，發(fā)酵液活性明顯下降，但在pH 3～9范圍內(nèi)，發(fā)酵液至少還能保持73.1%的活性。但當(dāng)pH低于3或高于9時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性顯著快速降低，在pH為1或11時(shí)，發(fā)酵液完全失去活性(圖5)。說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液對(duì)酸堿具有一定程度的耐受性。

2.3.4 對(duì)紫外線的穩(wěn)定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液在紫外線下照射15～120 min，其抗菌活性略有下降，保持85.3%的活性；120 min后隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌活性明顯下降，照射180 min后還能保持62.4%的活性(圖6)。表明暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)對(duì)紫外線不敏感。

圖2 基于16S rDNA序列同源分析的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 發(fā)酵上清液對(duì)酶的耐受性注：圖中不同字母表示抑菌活性達(dá)到顯著水平，下同.

圖4 發(fā)酵上清液對(duì)溫度的耐受性

圖5 發(fā)酵上清液對(duì)酸堿的耐受性

圖6 發(fā)酵上清液對(duì)紫外線的耐受性

2.3.5 儲(chǔ)存時(shí)間的影響

暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液置于4 ℃下儲(chǔ)存1、7、14、21、28 d后，其抑菌活性隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)。儲(chǔ)存時(shí)間在7 d內(nèi)，發(fā)酵上清液的抑菌活性顯著降低，均保持在對(duì)照組的95%以上；而從儲(chǔ)存8 d開(kāi)始，其抑菌活性下降較為明顯，但發(fā)酵液在儲(chǔ)存28 d后，活性不低于82.2%(圖7)。表明暹羅芽孢桿菌JFL15發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，儲(chǔ)存28 d還能保持較高的抑菌活性，大大增加了其開(kāi)發(fā)成微生物制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的價(jià)值。

2.4 暹羅芽孢桿菌JFL15發(fā)酵上清液的抗菌譜測(cè)定

測(cè)定了暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液對(duì)15株水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌的抑菌活性，結(jié)果表明，暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液對(duì)嗜水氣單胞菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、查氏弧菌均有較強(qiáng)抑制活性(表2)，其中對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的抑菌效果尤為突出。說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15對(duì)水產(chǎn)病原菌具有廣譜抑菌活性，其在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖7 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

表2 暹羅芽孢桿菌JFL15發(fā)酵上清液的抗菌譜

3 討 論

水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的破壞和抗生素濫用引起耐藥性細(xì)菌出現(xiàn)是制約我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素，因此，尋找高效低毒、安全綠色的水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗生素替代品在現(xiàn)階段顯得尤為重要。芽孢桿菌是一類(lèi)好養(yǎng)產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在自然界中分布廣泛，其中部分菌株已經(jīng)成為應(yīng)用廣泛的益生菌[14]。以芽孢桿菌作為抗生素替代品相對(duì)于乳酸菌和雙歧桿菌來(lái)說(shuō)具有許多優(yōu)勢(shì)：第一，穩(wěn)定性好，具有耐高溫、耐酸堿、耐干燥等特點(diǎn)，可以滿足飼料加工和運(yùn)輸、儲(chǔ)存過(guò)程中的要求。且芽孢一旦形成，便能耐受熱、壓力、紫外線、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、真空干燥等各種不利環(huán)境[15]。第二，芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶[16](如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素B、維生素C、維生素K等)，不僅能為水產(chǎn)動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)，而且能提高水產(chǎn)動(dòng)物的消化能力，從而促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)。第三，芽孢桿菌能產(chǎn)生更多種抗菌活性物質(zhì)，據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌能產(chǎn)生細(xì)菌素[17-18]、肽類(lèi)、酶類(lèi)、抗菌蛋白類(lèi)[19-20]、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)[21]、脂肽類(lèi)[22]和聚酮類(lèi)化合物[23]等多種抗菌活性物質(zhì)。因此，芽孢桿菌能更有效的抑菌水產(chǎn)病原菌，提高水產(chǎn)動(dòng)物的防病能力和免疫力。第四，菌種的來(lái)源是進(jìn)行拮抗菌篩選的一個(gè)重要指標(biāo)，直接關(guān)系到拮抗菌的應(yīng)用效果。從宿主本身或者其生存環(huán)境中篩選到的拮抗菌的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于從異種或者完全不同的環(huán)境中分離到的拮抗菌；而且拮抗菌要發(fā)揮抗菌活性必須定殖到水產(chǎn)動(dòng)物腸道的特定部位，這個(gè)過(guò)程中拮抗菌必須要耐受水產(chǎn)動(dòng)物上消化道的各種不利環(huán)境[24]。因此，本試驗(yàn)從帶魚(yú)腸道內(nèi)分離篩選具有廣譜抗菌活性的芽孢桿菌，這樣篩出來(lái)的菌株才能更好的發(fā)揮益生作用。第五，芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)抑制病原菌，而且能迅速降解和轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖環(huán)境中的有機(jī)物，有效降低水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硫化物等有害物質(zhì)的含量，從而有效的改善水質(zhì)，維持良好的生態(tài)環(huán)境[25]。

芽孢桿菌家族菌株種類(lèi)繁多、數(shù)量龐大，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定非常復(fù)雜。傳統(tǒng)的芽孢桿菌的分類(lèi)方法主要有經(jīng)典分類(lèi)法(表型特征)、分子分類(lèi)法和化學(xué)分類(lèi)法[26]?，F(xiàn)在的分類(lèi)研究大多采用多相分類(lèi)法，即將形態(tài)、生理生化、化學(xué)、分子等方法相結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行綜合分析，從而得出相對(duì)精確的分類(lèi)結(jié)果。但由于芽孢桿菌種類(lèi)繁多，不同種之間親緣關(guān)系非常接近，以至于在形態(tài)、生理生化特征、化學(xué)以及16S rDNA序列都非常相似，從而無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)鑒定；甚至一些分類(lèi)學(xué)家對(duì)某些已經(jīng)鑒定完成的芽孢桿菌的分類(lèi)地位仍存在爭(zhēng)議[27-28]。本研究中對(duì)菌株JFL15進(jìn)行分類(lèi)鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，菌株JFL15在形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌都非常接近，雖然在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中菌株JFL15與暹羅芽孢桿菌在同一分支，親緣關(guān)系最近，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將其初步確定為暹羅芽孢桿菌；但實(shí)際上暹羅芽孢桿菌JFL15的16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌之間只有幾個(gè)(甚至個(gè)別)堿基的不同，而這少數(shù)幾個(gè)堿基的不同有可能是菌株在生長(zhǎng)或基因測(cè)序過(guò)程中突變引起的，造成菌株分類(lèi)鑒定出現(xiàn)偏差。因此，多相分類(lèi)法在分類(lèi)鑒定芽孢桿菌方面還存在一定的局限性。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量代表性的模式生物基因組計(jì)劃和微生物基因組計(jì)劃相繼開(kāi)展，截止目前，已經(jīng)有超過(guò)1000株芽孢桿菌完成全基因組測(cè)序并將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中?；诨蚪M和比較基因組序列分析逐漸成為判定微生物分類(lèi)及親緣進(jìn)化關(guān)系的一個(gè)常規(guī)方法。平均核苷酸同源性[29]是基于物種全基因組序列，通過(guò)比較基因組學(xué)分析不同物種之間同源基因序列來(lái)判定物種間的遺傳關(guān)聯(lián)性。平均核苷酸同源性的計(jì)算涉及大量的基因，與單基因(如16S rDNA、管家基因gyrB等)相比，具有全面性和精確性優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)多相分類(lèi)法在分類(lèi)鑒定芽孢桿菌方面的局限性。對(duì)本試驗(yàn)中篩選出來(lái)的暹羅芽孢桿菌JFL15進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(登錄號(hào)：LFWQ00000000)。接下來(lái)將對(duì)菌株JFL15進(jìn)行基于全基因組的平均核苷酸同源性分析，以期獲得更準(zhǔn)確的分類(lèi)地位。

本試驗(yàn)中對(duì)暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液進(jìn)行了性質(zhì)研究，結(jié)果表明，發(fā)酵上清液中的抗菌活性物質(zhì)對(duì)酶、溫度、酸堿度、紫外線都很穩(wěn)定，并且在4 ℃下儲(chǔ)存28 d后還能保持較高的活性，說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和環(huán)境適應(yīng)性。對(duì)暹羅芽孢桿菌JFL15的抗菌譜的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液對(duì)嗜水氣單胞菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、查氏弧菌均具有較強(qiáng)抑制活性，說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)具有廣譜抑菌活性。Liu等[30]對(duì)莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis)J7和短小芽孢桿菌(B.pumilus)B16的發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的抑菌活性較弱(抑菌圈直徑小于14 mm)。Nair等[31]對(duì)蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)TC-2的發(fā)酵液進(jìn)行抗弧菌研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)哈維氏弧菌和副溶血弧菌的抑菌活性分別13 mm和12 mm。Thongjun等[32]對(duì)7株芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)進(jìn)行粗提取，而粗提物對(duì)副溶血弧菌的抑菌圈小于14 mm。以上研究表明，不同種類(lèi)的芽孢桿菌產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的能力可能不同，且培養(yǎng)條件和提取方法對(duì)抗菌活性有較大影響。本研究中暹羅芽孢桿菌JFL15的發(fā)酵上清液在未進(jìn)行任何培養(yǎng)條件優(yōu)化和抗菌物質(zhì)粗提取的條件下對(duì)15株水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌的抑菌圈直徑最低為17 mm，說(shuō)明暹羅芽孢桿菌JFL15具有高產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)和抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)。綜上所述，暹羅芽孢桿菌JFL15的這些突出特性有利于其被開(kāi)發(fā)成微生物制劑，部分或者完全取代抗生素，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，這將成為今后水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治方面的研究熱點(diǎn)。

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