鱘源遲鈍愛德華氏菌的分離鑒定與藥敏特性研究

孔 杰，李小義，周 洲，關(guān) 梅，石 婧

(1.貴州省水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004)

鱘魚是一類古老的軟骨硬鱗魚類，素有“活化石”之稱，具有巨大的經(jīng)濟和科研價值。鱘魚幾乎全身是寶，肉質(zhì)鮮美，富含多種人體必需氨基酸；魚鰾含有高級膠質(zhì)可配制上等漆料，還可入藥，而鱘魚卵做成的魚子醬更有“黑色黃金”的美名。強大的市強需求刺激著我國鱘魚養(yǎng)殖市場的發(fā)展與擴大，然而由于沒有規(guī)范的引種與養(yǎng)殖制度，鱘魚養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，使鱘魚細菌性疾病發(fā)生率不斷增加。已有報道的主要致病菌包括：氣單胞菌(Aeromonas)屬革蘭氏陰性菌，如嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、豚鼠氣單胞菌(A.carvia)和類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[1-3]；革蘭氏陽性菌鏈球菌(Streptococcus)，如停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)、海豚鏈球菌(S.iniae)；此外還有魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[4-7]等。

遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)，屬腸桿菌科愛德華氏菌屬，本屬細菌可分為3個種，即遲鈍愛德華氏菌、鲇魚愛德華氏菌(E.ictaluri)和保科愛德華氏菌(E.hoshinae)。遲鈍愛德華氏菌和鲇魚愛德華氏菌已被大量研究證實為重要的魚類病原微生物，而保科愛德華氏菌不能引起魚類疾病。遲鈍愛德華氏菌最初于1962年被日本學(xué)者Hoshina在鰻鱺(Anguillajapancia)中發(fā)現(xiàn)[8]，隨后又分別在人類的排泄物和爬行類中分離到，是一種人魚共患的條件致病菌，也是愛德華氏菌屬里唯一感染人的病原菌，能引起患者腹瀉、腸胃炎、敗血癥及黃疸等疾病。遲鈍愛德華氏菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中危害極大的革蘭氏陰性菌之一，它能引起鰻鱺、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[9-12]等數(shù)十種水產(chǎn)動物疾病。

2013年7月，貴州省惠水縣鱘魚養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的雜交鱘[施氏鱘(Acipenserschrenckii♀)×達氏鰉(Husodauricus♂)]發(fā)生大量死亡，病魚的主要癥狀為腹部出現(xiàn)血點，肛門紅腫，鰓絲變白，部分尾部出現(xiàn)白色潰爛。剖檢發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官無血色，肝臟與腎臟腫大，嚴重的腸壞死穿孔。筆者從具有明顯發(fā)病癥狀的雜交鱘中分離得到一株高致病性病原菌，經(jīng)過生理生化鑒定、回歸感染、16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析對該菌進行了分類鑒定，確定該致病菌為遲鈍愛德華氏菌，并研究了其藥敏特性，以期為鱘魚防治遲鈍愛德華氏菌提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年7月采集瀕死病魚于貴州省水產(chǎn)研究所惠水鱘魚繁育基地；回歸感染用的健康雜交鱘也來自該基地，健康雜交鱘魚放水族箱中暫養(yǎng)7 d，無異常后進行試驗。

1.2 主要試劑

細菌基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂按常規(guī)方法自配，細菌基因組DNA提取試劑盒、taq DNA聚合酶、dNTP等購自TAKARA公司，藥敏試紙片、細菌生化微量鑒定管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化

2014年7月，貴州省惠水鱘魚養(yǎng)殖基地部分養(yǎng)殖池內(nèi)發(fā)生鱘魚規(guī)模性疾病，病死魚頭腹朝天，腹部腫脹并出現(xiàn)明顯的血點，選取具有典型癥狀瀕死鱘魚，用70%酒精對魚體表面進行消毒滅菌，無菌環(huán)境下取病魚腎組織用于細菌分離，用經(jīng)過灼燒的接種環(huán)取少量器官組織劃線于細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，置28 ℃下培養(yǎng)24 h后挑取形態(tài)大小、顏色等菌落特征一致的優(yōu)勢菌落進一步純化，純化后的菌株用含30%甘油的LB培養(yǎng)液于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 理化特性測定

選取純化分離菌株，測定溫度5、15、20、28、35、42 ℃下的生長情況；測定鹽度(即NaCl質(zhì)量分數(shù))為0～7%下的生長情況；測定pH值為3.0～10.0下的生長情況。應(yīng)用細菌生化微量鑒定管進行細菌的常規(guī)生理生化測定。

1.3.3 16S rDNA基因序列的測定與分析

純化培養(yǎng)的菌株，按照DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。PCR擴增引物使用細菌16S rDNA通用引物(27f：5′-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3′，1492r:5′-GGTTACCTTGTTA-CGACTT-3′)；PCR擴增產(chǎn)物由生工生物工程上海(股份)有限公司進行測序。用BLAST在線同源性查詢軟件查詢菌株的16S rDNA序列屬性。從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得同源性為98%的8株菌的16S rDNA序列，并選擇鲇魚愛德華氏菌模式菌株、保科愛德華氏菌模式菌株共4株、與愛德華氏菌進化關(guān)系較近的阪崎腸桿菌(Enterobactursakazakii)的16S rDNA序列進行同源性序列比對分析，然后構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.4 回歸感染試驗

選取體長10～12 cm的健康雜交鱘，設(shè)試驗組、平行試驗組、對照組和平行對照組，每組10尾。將純培養(yǎng)的菌落制成菌懸液，用麥氏比濁法測定并調(diào)節(jié)菌密度為1×109cfu/mL，分別對試驗組與平行試驗組鱘魚進行胸鰭基部注射，每尾注射0.3 mL，對照組與平行對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水。試驗期間，水溫控制在23～25 ℃，充氧，隔日換水，連續(xù)觀察11 d至無新增死亡，記錄魚的發(fā)病和死亡情況，并對瀕死魚及時剖檢并再次分離純化鑒定致病菌。

1.3.5 藥物敏感性測定

對分離并經(jīng)鑒定的菌株采用瓊脂擴散紙片法進行常用抗菌類藥物的敏感性測定，以明確這些菌株的耐藥情況并為臨床防治的用藥提供參考。藥敏試驗結(jié)果判別按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會相關(guān)標準[13]執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌的分離純化

從病魚的腎中分離到菌落形態(tài)相同的優(yōu)勢菌，28 ℃培養(yǎng)24 h的菌落在LB固體培養(yǎng)基上呈圓形光滑、半透明、邊緣整齊、灰白色菌落。革蘭氏陰性桿菌，將病原菌編號為K9。

2.2 生理生化鑒定

經(jīng)測定，鹽度為0～30時菌株K9生長正常，40以上鹽度不生長；pH為5～8時生長正常，最適pH為7。其他生理生化特性見表1，菌株ET81126[14]、菌株HC010907-1[10]、菌株HN005[15]均為已鑒定的遲鈍愛德華氏菌，除了對蔗糖的利用與ET81126和HN005不同外，菌株K9的其他特性與遲鈍愛德華氏菌株表現(xiàn)一致。

表1 菌株K9的生理生化特性

注：+表示陽性，-表示陰性，+/-表示介于+與-之間.

2.2 病原菌的16S rDNA鑒定

菌株K9經(jīng)PCR擴增所獲得的16S rDNA基因序列長度為1468 bp，GeneBank 登錄號為：KY489780；在GeneBank 數(shù)據(jù)庫上進行同源性比對分析，結(jié)果顯示，菌株K9與遲鈍愛德華氏菌的同源性為98%。在EZTaxon上進行同源序列比對，結(jié)果顯示，K9菌株與愛德華氏菌ET833(T) (JRGQ01000134)、鲇魚愛德華氏菌ATCC_33202(T) (AFJI01000002)、保科愛德華氏菌NBRC105699T (BAUC01000062)、遲鈍愛德華氏菌NBRC_105688(T) (BANW01000030)的相似性分別為98.34%、97.99%、97.91%、97.71%。選擇以上序列以及腸桿菌科中的阪崎腸桿菌構(gòu)建進化樹，結(jié)果見圖1，菌株K9與遲鈍愛德華氏菌聚為1支。細菌分類學(xué)上，通常將16S rRNA基因同源性大于97.5%的菌株定為同種菌株[16-17]，因此綜合生化指標、16S rDNA基因序列分析以及進化樹的分析結(jié)果，可將菌株K9鑒定為遲鈍愛德華氏菌。

圖1 根據(jù)菌株K9 16S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 回歸感染試驗結(jié)果

分離遲鈍愛德華氏菌K9通過接種感染，顯示對雜交鱘有強致病力。在11 d的感染中，試驗組感染24 h后開始發(fā)病死亡，1 d內(nèi)死亡4尾，之后2 d又死亡3尾，至第11 d共死亡8尾。試驗過程中，死亡魚腹部兩側(cè)出現(xiàn)紅點，肛門紅腫，鰓絲變白，在試驗后期死亡的魚背部出現(xiàn)白色潰爛，腸部穿孔。病癥與自然發(fā)病鱘魚基本一致。平行試驗組11 d的觀察中，共死亡7尾，而對照組與平行對照組在感染試驗期內(nèi)，沒有發(fā)病死亡病例。從感染死魚中再次分離菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定，與從自然發(fā)病鱘魚中所分離的菌株為同一株。

2.4 藥物敏感試驗結(jié)果

分離遲鈍愛德華氏菌K9對20種藥物敏感性研究結(jié)果表明，遲鈍愛德華氏菌K9對鏈霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、阿齊霉素、新霉素、氯霉素(禁藥)等6種抗生素敏感，對頭孢噻肟、阿莫西林、頭孢唑啉、氨芐西林、紅霉素(禁藥)等5種抗生素等中度敏感，對青霉素G、妥布霉素、麥迪霉素等9種抗生素耐藥(表3)。

表2 遲鈍愛德華氏菌K9對鱘魚的致性病試驗

表3 分離遲鈍愛德華氏菌K9藥敏試驗結(jié)果

注：S，敏感；I，中度敏感; R，抗性.

3 討 論

遲鈍愛德華氏菌于1962年首次在鰻鱺中被發(fā)現(xiàn)，隨后在大口黑鱸(Micropterussalmoides)[18]、美洲紅點鮭(Salvelinusfontinalis)[19]、羅非魚(Oreochromis)[20]、褐牙鲆[10]、大菱鲆[21]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[15]、尖吻鱘(Acipenseroxyrinchus)[22]、斑馬魚(Daniorerio)[23]等數(shù)十種水產(chǎn)品種中均有報道。本研究從患病的雜交鱘腎臟組織中分離到1株革蘭氏陰性桿菌K9，人工感染試驗表明K9能使健康鱘魚致病死亡，表現(xiàn)出與自然感染下相似的臨床癥狀。遲鈍愛德華氏菌對斑馬魚與透明四帶無須鲃(Puntiustetrazona)[23]的人工感染試驗表明，當(dāng)菌液密度達到106cfu/mL時，能分別引起90%和80%的死亡率；在遲鈍愛德華氏菌株ET81126在對歐洲鰻(A.anguilla)的致病性試驗中[14]，當(dāng)菌液密度為106cfu/mL時，歐洲鰻的死亡率達到了100%；尖吻鱘源遲鈍愛德華氏菌的死亡率為50%[22]；本研究中，遲鈍愛德華氏菌K9的人工感染試驗結(jié)果顯示，在菌液密度為109cfu/mL時，引起鱘魚75%的死亡率，表明遲鈍愛德華氏菌對鱘魚的致病性較其他水生動物弱。

本研究的藥敏結(jié)果顯示，遲鈍愛德華氏菌K9只對鏈霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、阿齊霉素、新霉素、氯霉素等6種藥物敏感，對青霉素G、妥布霉素、麥迪霉素、呋喃唑酮等9種抗生素表現(xiàn)出很強的耐藥性。與分離自斑馬魚中菌株Z1[23]相比，在Z1表現(xiàn)為敏感的藥物中，如青霉素G、妥布霉素、頭孢唑啉、慶大霉素、紅霉素、卡那霉素，K9表現(xiàn)均為中度敏感甚至耐受。與分離自牙鲆[10]中的遲鈍愛德華氏菌相比，K9對該菌株表現(xiàn)為敏感的頭孢曲松、妥布霉素、呋喃唑酮和耐藥的青霉素、克林霉素均表現(xiàn)耐受性，表明K9耐藥性較為強烈。葛慕湘等[24]對35株遲鈍愛德華氏菌的耐藥檢測顯示，大部分菌株耐抗菌類藥物達7～9種。本次試驗分離到的遲鈍愛德華氏菌耐受9種抗生素，與其研究結(jié)果相同，進一步表明遲鈍愛德華氏菌的耐藥性嚴重性。本研究中遲鈍愛德華氏菌表現(xiàn)為耐藥性的抗生素，并非意味著該菌株對這些抗生素完全耐受，從刁菁等[25]的研究中可以看出，雖然遲鈍愛德華氏菌在低抗生素含量下表現(xiàn)為耐受，但是隨著抗生素含量的增加細菌的生長受到抑制。因此，遲鈍愛德華氏菌K9表現(xiàn)為耐受的抗生素，也可能會在增加抗生素含量后表現(xiàn)為敏感。需注意的是，在本次藥敏試驗所用抗生素中，氯霉素、紅霉素和呋喃唑酮為國家禁用抗生素，僅供試驗研究用，嚴禁用于生產(chǎn)中。因此，防治遲鈍愛德華氏菌引起的疾病，可以考慮采用其他遲鈍愛德華氏菌K9敏感的抗生素，如阿米卡星、左氧氟沙星、阿齊霉素、新霉素。遲鈍愛德華氏菌感染魚體通常是由水溫升高所致[22]，因而建議養(yǎng)殖中注意控制水溫，當(dāng)疾病發(fā)生后，除給藥外，還應(yīng)同時采取相應(yīng)的降溫措施。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中對細菌性疾病的防治仍以抗生素為主，而長期使用抗生素極易產(chǎn)生耐藥菌株，本研究中分離到具有較強耐藥性菌株K9，可能就是由于生產(chǎn)上長期使用抗生素導(dǎo)致。中草藥不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小，成為研究抗菌藥物的熱點。楊移斌等[26]就曾對鱘源的3種致病菌進行過中草藥研究，結(jié)果表明，烏梅、石榴皮、地榆、杞子對防治鱘魚細菌性疾病效果良好。而不同來源的遲鈍愛德華氏菌也開展過許多中草藥抑菌研究，如五倍子與石榴皮對斑馬魚源的遲鈍愛德華氏菌抑菌作用明顯[23]，最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均≤6.25 mg/mL；五倍子、訶子、黃芩、秦皮和紅藤對牙鲆源的遲鈍愛德華氏菌抑菌作用明顯[27]，最小抑菌質(zhì)量濃度<12.5 mg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度<50 mg/mL；五倍子+黃芩、五倍子+大黃、黃連+黃芩和大黃+黃芩對石斑魚源的遲鈍愛德華氏模式菌具有明顯的強力殺菌作用[28]，最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均≤3.125 mg/mL；陳言峰等[29]研究表明，20種中草藥中五倍子的殺菌能力極強，最小抑菌質(zhì)量濃度為1.5626 mg/mL；從以上數(shù)據(jù)可以看出，五倍子對防治遲鈍愛德華氏菌具有明顯的作用，在防治鱘源遲鈍愛德華氏菌中不僅可以考慮本文中給出的抗生素藥物，還可以考慮中草藥的防治方法。

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