從分子結(jié)構(gòu)出發(fā)探索 TPP 分子用于生物成像與光學(xué)治療的潛能

張佳麗 孟曉青 孫枝紅 龔 萍

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

物質(zhì)的光學(xué)特性來源于構(gòu)成物質(zhì)最小單位(分子、離子和原子)中的電子與能量相互作用過程中的狀態(tài)改變。不同分子(離子、原子)的光譜特殊性來源于其特殊的電子排布方式，是結(jié)構(gòu)的最好體現(xiàn)[1]，任何一點(diǎn)分子構(gòu)型、構(gòu)象上的改變都有可能造成電子吸收、分子發(fā)射光譜的較大變化。有機(jī)小分子抗干擾性能差，極易受到環(huán)境擾動(dòng)，再加上機(jī)體是一個(gè)動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)，成分復(fù)雜且不斷變化，因此，對于有機(jī)小分子類診療藥物的研究，預(yù)先推測其分子結(jié)構(gòu)在各種因素作用下可能產(chǎn)生的改變具有極強(qiáng)的指導(dǎo)意義和必要性。卟啉類分子不僅是血紅素、葉綠體等多種生物活性大分子的類似物，還是歷史最悠久的光敏劑，被廣泛用于光動(dòng)力治療的研究[2-4]。

目前臨床應(yīng)用的光敏劑大都是卟啉衍生物，按照歷史沿革可大致分為三代。其中，第一代光敏劑是以血卟啉衍生物、二血卟啉醚和光卟啉為代表的混合制劑，穿透深度低于 0.5 cm，且需長時(shí)間避光；第二代光敏劑，如酞菁類、苯卟啉衍生物和亞甲基藍(lán)等，比第一代光敏劑的光敏期更短、穿透深度更大、產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧；第三代光敏劑則是對第二代進(jìn)行改進(jìn)，通過偶聯(lián)一些具有識別特性的生物或化學(xué)分子，進(jìn)一步提高腫瘤靶向性。從這一演進(jìn)過程也可以看出，優(yōu)良光敏劑應(yīng)該具有：較長的激發(fā)波長(穿透深層組織)、較高的熒光量子產(chǎn)率(單線態(tài)氧產(chǎn)生效果)、較強(qiáng)的腫瘤靶向性以及較低毒性。因此，對光敏分子上述性能的評價(jià)是判斷其生物應(yīng)用效果的基礎(chǔ)。

本文研究所用的卟啉分子經(jīng)核磁氫譜確認(rèn)，為 5-(4-羧基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(5-(4-Carboxyphenyl)-10,15,20-Triphenylporphyrin，TPP)[5]，屬于第二代光敏劑。作為卟啉類衍生物，它與其同系物具有類似的光化學(xué)性質(zhì)，可以成為一種有機(jī)小分子前藥。本文從分子結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)檢測 TPP的相關(guān)性能，預(yù)測將其應(yīng)用在生物成像與光學(xué)治療方面的優(yōu)勢和局限[6]。本實(shí)驗(yàn)依次探究了溶液極性、pH 對分子的紫外可見吸收和熒光光譜的影響，計(jì)算其表觀質(zhì)子化常數(shù)，推演質(zhì)子化前后的穩(wěn)態(tài)分子構(gòu)象，并初步測定其在體外細(xì)胞水平的光動(dòng)力效果。另外，從分子結(jié)構(gòu)角度討論造成上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的可能原因，預(yù)測將其用于診療領(lǐng)域所具有的優(yōu)勢和可能面臨的問題。

2 材料與方法

2.1 主要儀器和材料

核磁共振波譜儀(Bruker AM-400，瑞士布魯克/Bruker)；紫外分光光度計(jì)(Lambda 750，美國珀金埃爾默/PerkinElmer)；pH 計(jì)(Sartorius PB-10，德國賽多利斯/Sartorius)；熒光光譜儀(FSP920，英國愛丁堡/Edinburgh Instruments)；激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，德國萊卡/Leica)。

TPP 購于 Frontier Scientific；氘代氯仿(CDCl3，含 TMS，購自 Sigma)；二甲基亞砜(DMSO，AR，購自 Sigma)；乳腺癌細(xì)胞(4t1 Cells，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM，購自 Thermo Fisher)；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA ，購自 Sigma)。

2.2 方法

2.2.1 用核磁共振氫譜(1HNMR)對 TPP 分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征

作為 D2h點(diǎn)群分子，TPP 分子骨架具有高度立體對稱性，3 個(gè)苯環(huán)取代基所處化學(xué)環(huán)境幾乎相同，卟吩母環(huán)上的氫處于相似的屏蔽環(huán)境，且關(guān)于面對稱。這些因素使分子內(nèi)氫的振動(dòng)頻率可分為為數(shù)不多的幾類，因此，用氫核磁共振波譜對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)是一種較為簡潔、高效的表征方式。

主要操作步驟為：首先，試樣經(jīng)硅膠柱分離提純、干燥；然后，取 0.9 mg 試樣溶于 CDCl3；最后，在相應(yīng)磁場中掃描，16 次疊加后經(jīng)傅立葉變換得到二階信號，以便分析。

2.2.2 測定 TPP 在不同含水量溶液中的電子吸收光譜

本文首先研究了卟啉分子在不同比重的水、有機(jī)溶劑溶液中的吸收光譜變化。由于羧基取代基的存在，分子極性增大，選用極性有機(jī)溶劑才能保證較為理想的溶解效果，因此選擇了極性非質(zhì)子型的有機(jī)溶劑 DMSO 來使其充分溶解。雖然由此引入較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)使得光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，但本文主要目的是為了根據(jù)此結(jié)果選定適宜的溶劑含水量，用于后續(xù)質(zhì)子化常數(shù)測定的實(shí)驗(yàn)，而非精確定量與定性，故只需得到分子特征吸收峰的變化趨勢即可。

操作步驟為：(1)將 TPP 溶解于 DMSO，制得濃度為 10 mmol/L 的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋到所需濃度；(2)配制不同比例的 DMSO、水(去離子)混合溶液(DMSO 體積分?jǐn)?shù)依次為 100%、75%、65%、50%、33% 和 25%)，用該系列溶液將母液稀釋至特定濃度(2.5 μmol/L)，依次測定其吸收光譜。

2.2.3 測定 TPP 在不同 pH 溶液中的電子吸收光譜

卟吩母環(huán)中心對稱分布著 4 個(gè)氮原子。其中，2 個(gè)吡咯型的(＝NH)有可能電離出質(zhì)子形成 TPPH－或 TPP2－離子，另外 2 個(gè)吡啶型的(＝N－)，在酸性介質(zhì)中能形成質(zhì)子化的陽離子TPPH3＋或 TPPH42＋。本文采用光度法測定其表觀質(zhì)子化常數(shù)[7]，并對 TPP 酸性環(huán)境中的特征吸收曲線進(jìn)行分析，討論造成這種現(xiàn)象的分子結(jié)構(gòu)層面的原因。

操作步驟為：(1)預(yù)先用 HCl/NaOH 調(diào)節(jié)NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液(按照標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)配置)；(2)配置 pH 值為 1.0～7.0，梯度為 0.1 的系列溶液，再將其與 DMSO 等體積混合，得到含 50%DMSO 的系列 pH 梯度溶液，并用酸度計(jì)標(biāo)定混合溶液的最終 pH 值；(3)選取適宜 pH 的系列溶液稀釋 TPP 原液至 10 μmol/L，25℃ 下依次測定其吸收光譜；(4)計(jì)算該條件下 TPP 的質(zhì)子化常數(shù)(Na＋作為活潑的單價(jià)態(tài)金屬離子幾乎不會影響卟啉類分子發(fā)生絡(luò)合，因此這里選用NaH2PO4/ Na2HPO4緩沖體系)。

2.2.4 測定 TPP 在不同溶液條件中的分子熒光光譜并計(jì)算不同狀態(tài)下的分子穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)

卟啉呈現(xiàn)出非常有利于熒光發(fā)射的分子結(jié)構(gòu)，可能具有很高的熒光量子產(chǎn)率。由于質(zhì)子化前后的 TPP 分子能量、穩(wěn)態(tài)構(gòu)象都有較大變化，而分子結(jié)構(gòu)的變化必然導(dǎo)致光學(xué)性能的改變。因此，本文通過實(shí)驗(yàn)觀測溶液極性(含水量)和 pH對分子熒光的影響，并根據(jù)理論預(yù)測值推演導(dǎo)致熒光信號改變的可能機(jī)理。本節(jié)通過計(jì)算質(zhì)子化前后的分子處于最穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)所具有的能量和結(jié)構(gòu)構(gòu)象，將理論模擬的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相互推演驗(yàn)證。

主要步驟為：不同含水量的 DMSO/H2O 的混合液以及不同 pH 的混合溶劑的配置方法與前兩節(jié)相同，而后依次測量各溶液中 TPP 的熒光光譜，繪制熒光變化曲線。利用 Chem3D 對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，計(jì)算質(zhì)子化前后的分子處于最穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)的理論結(jié)構(gòu)參數(shù)和能量數(shù)值。

2.2.5 檢測 TPP 在體外溶液和細(xì)胞水平的光動(dòng)力反應(yīng)

卟啉類的分子是一種歷史悠久的光敏劑，吸收一定波長的光后到達(dá)激發(fā)單重態(tài)(S1)的分子，一部分會通過非輻射或輻射(熒光)直接回到基態(tài)；另一部分會通過系間竄躍到達(dá)躍遷被禁阻的激發(fā)三重態(tài)(T1)并將能量傳遞給周圍的基態(tài)分子氧(3O2)形成單線態(tài)氧(1O2)。其中，1O2是一種最重要的活性氧(ROS)，在光動(dòng)力治療(PDT)中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或?qū)е录?xì)胞壞死，直接殺傷所定位的細(xì)胞[8-10]。

DCFH-DA 探針是一種被廣泛用于檢測細(xì)胞中活性氧水平的熒光探針。其主要原理是，被活性氧氧化后生成具有熒光發(fā)射能力的二氯二氫熒光素(Dichlorofluorescin，DCF)分子(激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長 523 nm)，通過檢測 DCF 的特征熒光強(qiáng)度來檢測活性氧水平，該原理在體外試液中同樣適用[11]。

本文先后測定 TPP 分子在溶液和腫瘤細(xì)胞中可以達(dá)到的實(shí)際光動(dòng)力效果，評估 TPP 分子用于光學(xué)治療，尤其是光動(dòng)力治療的潛能。主要步驟(均在暗室中進(jìn)行)如下：

(1)體外溶液中的光動(dòng)力反應(yīng)效果測定：配制 50% DMSO、pH 7.0 的混合溶劑將母液稀釋至5 μmol/L，分裝到 2 mL 離心管中，激光單獨(dú)照射一定時(shí)間后立即進(jìn)行熒光測量；

(2)細(xì)胞中的活性氧產(chǎn)生的效果測定：將乳腺癌細(xì)胞(4t1)與 TPP(5 μmol/L)在 37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2)中共孵育 30 min 后，施加等時(shí)間間隔的激光照射，觀察 DCF 熒光(488 nm 激發(fā)、523 nm 發(fā)射)。

3 結(jié)果

3.1 TPP 分子的氫核磁圖譜(1HNMR)

用氘代氯仿(Chloroform-d)作溶劑時(shí)，各組核磁峰的化學(xué)位移值(δ)，多重態(tài)(s-單重峰、d-雙重峰、m-多重峰、qt-四個(gè)三重峰)，積分，耦合常數(shù)(J)分別為：1H NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ8.98～8.78 (m, 8H)，8.53 (d,J＝8.2 Hz, 2H)，8.38 (d,J＝8.2 Hz, 2H)，8.31～8.19 (m, 6H)，7.79 (qt,J＝7.5, 1.3 Hz, 9H)，－2.75 (s, 2H)，具體歸屬情況如圖 1 所示。

3.2 TPP 在不同含水量溶液中的電子吸收光譜

TPP 在不同比例混合溶液中的吸收曲線如圖 2 所示。從圖 2(a)可以看出，當(dāng) DMSO 含量為 100% 時(shí)，418 nm 左右為最強(qiáng)吸收帶(Soret 帶，為卟啉類物質(zhì)的特殊 B 帶)，同時(shí)500～700 nm 范圍內(nèi)出現(xiàn) 4 個(gè)較弱的亞吸收帶(QⅣ-Ⅰ帶)。Soret 帶源于電子由a1μ(HOMO 軌道的低能級)躍遷至 eR*(LUMO 軌道簡并能級)，該過程電子在兩個(gè)軌道中產(chǎn)生兩個(gè)躍遷，兩個(gè)躍遷矩之間線性耦合，躍遷幾率大；而 Q 帶源于電子由a2μ(HOMO 軌道的高能級)至 eR*的躍遷，兩個(gè)躍遷矩之間耦合相互抵消，為弱吸收。因此，Soret 帶雖為第二電子激發(fā)態(tài)，強(qiáng)度仍是 Q 帶的 10倍左右，這與同類物質(zhì)的電子吸收光譜類似[12]。圖 2(b)顯示，隨溶劑 DMSO 體積分?jǐn)?shù)的降低(從 75% 降至 25%)，特征吸收峰強(qiáng)度明顯降低且發(fā)生一定紅移(約 16 nm)。由朗伯比爾定律可推知，這極有可能是由于隨著 DMSO 比例的減少，TPP 溶解度隨之降低造成的。

3.3 TPP 在系列 pH 溶液中的電子吸收光譜及其質(zhì)子化常數(shù)

由于羧基取代基的存在，為保證吸收曲線隨 pH 的變化能夠用于反應(yīng)吡啶型的氮原子(＝N－)質(zhì)子化過程，需要使滴定前溶液的 pH約等于或略低于 TPP 分子的表觀解離常數(shù)，即主要以 TPPH2的分子態(tài)存在。參考苯甲酸在水中的電離常數(shù)(Ka＝6.4×10－5，25℃)，并通過反復(fù)優(yōu)化，將 pH 區(qū)間選定為 1.5～5.0，測定該區(qū)間范圍內(nèi)的溶液中 TPP 分子的特征吸收峰強(qiáng)度隨 pH的變化，結(jié)果如圖 3(a)所示。需要說明的是，在本小節(jié)中，TPP、TPPH2均代表卟啉分子。

卟啉在不同 H＋濃度的溶液中質(zhì)子化反應(yīng)為：

質(zhì)子化常數(shù)和平衡體系中各物質(zhì)濃度關(guān)系為：

在實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)濃度與吸光度近似遵循朗伯-比耳定律，則在一定波長下有：

圖1 TPP 分子結(jié)構(gòu)及其氫核磁譜表征Fig. 1 Characterization of TPP molecular structure by 1HNMR

圖2 不同比例混合溶劑中卟啉(2.5 μmol/L)的紫外-可見光吸收光譜Fig. 2 UV-vis spectra of TPP in DMSO/Water mixture solvent (CTPP＝2.5 μmol/L)

圖3 pH 滴定曲線及相對應(yīng)的 lg[(A1－A)/(A－A2)]～pH 關(guān)系曲線Fig. 3 Titration absorption curves of pH (1.5, 1.7, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0)(a) and corresponding plot of lg[(A1－A)/(A－A2)]-pH (b) at 25℃

其中，K為質(zhì)子化常數(shù)；pH 為酸度計(jì)測得的DMSO 與磷酸鹽緩沖液(PBS)體積比為 1∶1 混合溶液的 pH 值；A1、A、A2分別為 pH 5.0(分子等電點(diǎn))、一定酸度(系列溶液測量值)、pH 1.5(完全酸化為 PH42＋)時(shí)最大吸收峰(440 nm)處的吸光度。

計(jì)算結(jié)果如表1 所示。由此繪制得到lg[(A1－A)/(A－A2)]～pH 關(guān)系曲線(圖 3(b))。通過計(jì)算可得：當(dāng) lg[(A1－A)/(A－A2)]＝0 時(shí)，lgK(25℃)＝2 pH＝7.557 0。

表1 不同 pH 溶液中的 lg[(A1－A)/(A－A2)]值Table 1 lg[(A1－A)/(A－A2)]-pH calculated from absorbances at 440 nm

3.4 質(zhì)子化前后的分子的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)參數(shù)及不同條件溶液中的熒光發(fā)射光譜

利用 Chem3D 軟件依次計(jì)算 TPPH2和TPPH42+分子經(jīng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的最理想狀態(tài)下的構(gòu)象及所具有的最低能量，計(jì)算結(jié)果如表2 所示。圖 4 為相應(yīng)狀態(tài)分子不同角度的三維模擬圖?？梢钥吹?，即便處于能量最低狀態(tài)，由于分子內(nèi)結(jié)合氫離子數(shù)目的增加，TPPH42＋分子的共平面性比 TPPH2仍有所降低。這可能造成實(shí)際溶液條件中二者的構(gòu)象差異更大，從而在不同質(zhì)子化程度下表現(xiàn)出極為不同的熒光量子產(chǎn)率。

表2 TPPH2 和 TPPH42＋ 最穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象和能量信息Table 2 The molecular structure information of TPPH2 and TPPH42＋ after optimization

圖4 質(zhì)子化前(TPPH2)、后(TPPH42＋) 穩(wěn)定狀態(tài)下的模擬結(jié)構(gòu)Fig. 4 Optimized molecular structures of TPPH2 and TPPH42＋

圖5 不同極性、pH 條件下的分子熒光光譜 (C＝2.5 μmol/L)Fig. 5 The fluorescent spectra of TPP in solvents with decreasing fraction of DMSO and different pH values

圖5 為不同極性、pH 條件下的分子熒光光譜。圖 5 顯示，在 DMSO/H2O 體系(室溫)中，420 nm 激發(fā)光照下 TPP 分子的最強(qiáng)發(fā)射峰出現(xiàn)在 650 nm 附近，并在 720 nm 左右出現(xiàn)較弱的伴峰，這兩個(gè)特征峰是由S1→S0躍遷產(chǎn)生，對應(yīng)吸收光譜中 Q 帶；同時(shí)，440 nm 處在 pH 較高時(shí)有一個(gè)弱熒光發(fā)射峰，這是由S2→S0躍遷產(chǎn)生，對應(yīng) 420 nm 處的 Soret 吸收帶。Soret 帶的強(qiáng)吸收并沒有產(chǎn)生該能級對應(yīng)的強(qiáng)熒光，而是在位移超過 200 nm 的位置熒光最強(qiáng)。這是因?yàn)?，?qiáng)吸收并不意味著強(qiáng)發(fā)射——物質(zhì)吸收光后電子由基態(tài)躍遷至不同的激發(fā)態(tài)，但只有從由亞穩(wěn)態(tài)再回到基態(tài)時(shí)才有熒光發(fā)射，激發(fā)態(tài)電子需要以熱輻射釋放出能量轉(zhuǎn)移到亞穩(wěn)態(tài)，這些能量損失就表現(xiàn)為吸收與發(fā)射光譜間的斯托克斯位移。

從圖 5(a)可以看到，分子熒光強(qiáng)度隨著溶液極性的增加(含水量提高)而迅速降低。當(dāng)含水量超過 68%(DMSO 低于 33%)時(shí)，分子熒光降至基線。這是因?yàn)?，隨著體系極性的增大，探針分子的聚集程度增大，導(dǎo)致熒光淬滅。可推知，卟啉分子在水溶液中的分散性較差，則用于生物體時(shí)需要注意改造分子結(jié)構(gòu)、選擇適宜的給藥方式。

由圖 5(b)可見，在不同 pH 溶液(均含 50%DMSO)中，pH 2.5～9.5 范圍內(nèi)，pH 越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，且 pH 達(dá) 10.0 以上不再增加(pH 過高時(shí)有降低趨勢)。這似乎與紫外吸收光譜的趨勢相悖(圖 3(a))，但從分子質(zhì)子化前后的三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果來看，也許不難理解：圖 4(a)顯示，完全質(zhì)子化后的分子剛性降低，且分子總能量增加，卟啉分子內(nèi)部及與介質(zhì)之間的負(fù)面作用增加，分子內(nèi)轉(zhuǎn)換幾率增加，使得熒光發(fā)射減弱。

圖6 TPP 在體外溶液(a, b)及腫瘤細(xì)胞(c)中的光動(dòng)力效果Fig. 6 ROS production of TPP in DMSO/Water solution(a, b) and tumor cells (c) after different irradiation time

3.5 體外溶液和腫瘤細(xì)胞中的光動(dòng)力效果

圖6 (a)為含有過量 DCFH-DA(10 μmol/L)的TPP(2.5 μmol/L)溶液，經(jīng)不同時(shí)間激光照射后，檢測得到的 DCF 分子特征熒光光譜(ex 485 nm)的變化；圖 6(b)是計(jì)算得到的(a)中最大發(fā)射波長(523 nm)處的熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間的變化；圖6(c)是對應(yīng)的細(xì)胞水平光動(dòng)力反應(yīng)效果：由 DCF熒光強(qiáng)度的增加反映活性氧的產(chǎn)生。

4 討論

4.1 溶液含水量對 TPP 吸收光譜的影響

含有共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子外層價(jià)電子躍遷至激發(fā)態(tài)所需能量一般位于近紫外和可見光波范圍，因此紫外可見吸收常用于共軛分子特別是芳香性分子的定性定量分析[13]。物質(zhì)結(jié)構(gòu)的細(xì)微改變都會導(dǎo)致吸收光譜有較大的改變。卟啉類物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)是在卟吩母環(huán)的不同位置共價(jià)鍵合各種取代基。其中，卟吩是一個(gè)具有 11 個(gè)共軛雙鍵的高度共軛環(huán)狀分子，為強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，環(huán)上氮(N)原子的孤對電子以及環(huán)外取代基可能具有的助色效應(yīng)，使分子的價(jià)電子發(fā)生 π→π*躍遷所需能量進(jìn)一步降低，最大吸收波長進(jìn)一步紅移，從而呈現(xiàn)出獨(dú)特的紫外-可見吸收光譜。

溶劑效應(yīng)對卟啉類物質(zhì)的 Soret 帶影響較大：隨著含水量的增加，最大吸收波長由 418 nm(100% DMSO)逐漸移動(dòng)到 436 nm(25% DMSO)附近，紅移約 20 nm 且吸收強(qiáng)度明顯降低(圖2(b))。這極可能是因?yàn)楹吭黾訒r(shí)，溶劑極性增大，一方面 π→π*能級差減小，價(jià)電子躍遷所需能量減少，故吸收帶紅移；另一方面，極性增大導(dǎo)致分子聚集程度增加，游離態(tài)分子的濃度降低，由近似的 Lambert-Beer 定律可知分子的特征吸收強(qiáng)度將隨之降低。

4.2 溶液 pH 對 TPP 吸收光譜的影響及其質(zhì)子化能力

患病生物體內(nèi)常呈現(xiàn)出特殊的 pH 水平。例如，腫瘤和膿腫發(fā)生部位的組織液中都表現(xiàn)出微酸性(低于 6.0)[14]。因此作為一種光學(xué)治療試劑，卟啉的質(zhì)子化能力對于其在病灶部位的治療(特別是用于實(shí)體瘤的光動(dòng)力治療時(shí))效果有很大影響。此外，機(jī)體中的存在著豐富的 K＋、Ca2＋、Na＋、Mg2＋等各種金屬離子，而分子的質(zhì)子化常數(shù)與其金屬絡(luò)合能力緊密相關(guān)[15]。因此，檢測卟啉分子的質(zhì)子化能力對于理解并預(yù)測其在生物體中可能產(chǎn)生的作用效果具有重要意義。

從 pH 滴定吸收曲線(圖 3(a))可見，在pH 1.5～5.0 范圍內(nèi)，隨 pH 降低，最大吸光強(qiáng)度顯著增加。這可能主要有兩個(gè)方面的原因，一是在該區(qū)間內(nèi)，隨 pH 降低，分子內(nèi)會逐漸形成 4個(gè)吡咯型(＝NH)氮，電荷分布更加均勻，π 電子離域性增加，躍遷幾率增加，因此特征吸收峰強(qiáng)度增加；反之，隨 pH 增加，質(zhì)子化水平降低，躍遷幾率降低，特征吸收減弱吸收。二是，隨酸度增加，TPP 溶解程度增加，由朗伯比爾定律推知吸光度將顯著增強(qiáng)。此外，可以看到最大吸收峰位置在 pH 升高的同時(shí)發(fā)生藍(lán)移，但由于在所選 pH 范圍內(nèi)藍(lán)移極小(～2 nm)，故可將其視作擾動(dòng)，近似忽略，仍將 440 nm 作為等吸收點(diǎn)，根據(jù)此波長處的吸光強(qiáng)度計(jì)算質(zhì)子化常數(shù)。

4.3 溶液含水量及 pH 對 TPP 熒光發(fā)射光譜的影響

熒光是一種被應(yīng)用于材料、醫(yī)藥、檢測等領(lǐng)域的光致發(fā)光現(xiàn)象，具有瞬時(shí)性、可見性。能夠發(fā)射較強(qiáng)熒光的有機(jī)分子，都具有一些共性：(1)分子是大 π 共軛結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)楣曹棾潭仍酱螅x域 π 電子分布越均勻就越容易被激發(fā)，即電子激發(fā)的總數(shù)增加；(2)剛性的平面共軛結(jié)構(gòu)有助于減少激發(fā)態(tài)的分子內(nèi)部及分子之間的其他能量耗散過程，如振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、系間竄越等，使激發(fā)態(tài)電子能夠更多地從第一激發(fā)態(tài)S1發(fā)射熒光返回基態(tài)S0；(3)具有－NH2、－CN、－OH 等供電子型取代基，進(jìn)一步擴(kuò)大分子的共軛程度。

盡管在上述因素的綜合作用下，TPP 顯示出了良好的熒光發(fā)射潛力，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：雖然TPP 在人體體液的正常生理 pH 區(qū)間(7.0～7.4)內(nèi)有較強(qiáng)的熒光信號，但須注意 Q 帶吸收的最大波長也只有 650 nm 左右，則光穿透組織的深度理論上不足 0.7 cm，且熒光發(fā)射波長所處波段與生物的背景熒光波段重合，將受到很大干擾，這使其在光學(xué)成像方面的應(yīng)用具有很大局限[16]。

4.4 體外的光動(dòng)力反應(yīng)效果

光動(dòng)力反應(yīng)有 3 個(gè)影響因素：光敏劑、氧分子和光照[17]。本文固定其他變量，僅改變光照時(shí)間，由圖 6(a)、6(b)可見，隨著激發(fā)光照時(shí)間的延長，0～21 min 內(nèi) DCF 熒光持續(xù)地等比例增強(qiáng)，且加入活性氧清除劑的對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度明顯降低。這說明，DCF 的熒光強(qiáng)度可以反映溶液中的活性氧水平，且激光照射時(shí)間越長，1O2產(chǎn)率越高。在長達(dá) 20 多分鐘內(nèi)，這一趨勢都幾乎沒有衰減。可見，這種卟啉分子具有優(yōu)良的光動(dòng)力反應(yīng)能力。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(圖 6(c))效果也充分支持了這一結(jié)論：在細(xì)胞耐受的光劑量內(nèi)，隨著激光照射時(shí)間的延長，DCF 信號顯著增強(qiáng)，說明 ROS 產(chǎn)量隨光照增加。

5 結(jié) 論

卟啉類分子被廣泛應(yīng)用到諸多領(lǐng)域，如太陽能電池、仿生催化、分子識別等，對其分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的研究也較為透徹。Yao 等[18]利用密度泛函理論對具有對稱取代基的四苯基卟啉的幾何構(gòu)型、電荷密度、分子軌道進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)計(jì)算結(jié)果指認(rèn)電子吸收和紅外光譜的特征峰，發(fā)現(xiàn)相關(guān)分子結(jié)構(gòu)與光譜的變動(dòng)范圍隨著 meso 位取代基吸電子能力單調(diào)增加，說明取代基的電子效應(yīng)對分子性質(zhì)有很大影響。這可能是本文中的羧基取代四苯基卟啉與已經(jīng)報(bào)道的其他四苯基卟啉的光學(xué)性能有所不同的重要原因。與胡珍珠等[19]對其他類似結(jié)構(gòu)分子的研究結(jié)果對比，本文分子具有更大的質(zhì)子化常數(shù)(差值約 1.0)。造成這種顯著差異的原因，一方面來自溫度、試劑等實(shí)驗(yàn)條件的改變，另一重要方面則是取代基效應(yīng)等對分子結(jié)構(gòu)本身的影響。

5-(4-羧基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(TPP)分子熒光的最大激發(fā)和發(fā)射波長均位于可見光區(qū)，并且紫外吸收和熒光發(fā)射光譜受環(huán)境溶液的極性、pH 影響很大，若將其直接用于生物體成像，很可能出現(xiàn)組織穿透力低、受機(jī)體熒光背景干擾嚴(yán)重等問題。在光動(dòng)力效果方面，TPP 在溶液和細(xì)胞的前期實(shí)驗(yàn)中均展現(xiàn)了優(yōu)異的活性氧產(chǎn)生能力，可作為一種性能優(yōu)良的光敏劑用于腫瘤的光學(xué)治療。結(jié)合上述結(jié)果，我們將尋找適宜的方法，對 TPP 分子進(jìn)行改造，克服其結(jié)構(gòu)上的弊端，將其作為腫瘤的光學(xué)診療試劑開展進(jìn)一步研究。

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