尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒性能驗(yàn)證

馮洋

尿微量白蛋白（microalbuminuria，mALB）是指尿液中白蛋白超過(guò)正常水平、但低于常規(guī)試帶法可檢出的范圍，是評(píng)價(jià)腎功能的常見(jiàn)指標(biāo)［1-2］。相對(duì)分子質(zhì)量大于70 000的大分子溶質(zhì)不能通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，69 000的白蛋白則幾乎不能通過(guò)濾過(guò)膜，即便有通過(guò)的也在腎小管被全部重吸收；但當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)功能受損、腎小管重吸收的能力受限時(shí)，尿液中mALB含量就會(huì)升高。因此mALB的升高對(duì)診斷早期或輕微腎損害具有重要的提示作用。mALB檢測(cè)方法較多，試劑質(zhì)量也參差不齊。本研究旨在驗(yàn)證Orion免疫比濁法檢測(cè)mALB的方法學(xué)性能是否滿足臨床需求。

1 材料與方法

1.1 儀器 采用OLYMPUS公司生產(chǎn)的AU640型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品 Orion附帶校準(zhǔn)品的微量白蛋白測(cè)定試劑盒，批號(hào)為1687202和1767794；質(zhì)控品由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供，批號(hào)分別為高值M1303和低值M1301。

1.3 標(biāo)本來(lái)源 采集本院就診患者或正常體檢者的新鮮尿液；生理鹽水為市售醫(yī)用品。

1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T）492-2016文件《臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證》進(jìn)行精密度驗(yàn)證［3］。選擇2個(gè)不同濃度的質(zhì)控品，每天分析1批，連續(xù)測(cè)定5 d，每批分高、低2個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平同一樣品重復(fù)測(cè)定3次；如果出現(xiàn)失控，則應(yīng)刪除數(shù)據(jù)并重新測(cè)定。將以上檢測(cè)結(jié)果根據(jù)公式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV批內(nèi)）、批間變異系數(shù)（CV批間）、批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（S批內(nèi)）和批間標(biāo)準(zhǔn)差（S批間）。

1.4.2 正確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考WS/T 492-2016文件進(jìn)行正確度驗(yàn)證。選擇2個(gè)與定標(biāo)校正品不同批號(hào)的原廠校正品，每天重復(fù)測(cè)定2次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及置信區(qū)間，以驗(yàn)證指定值。

1.4.3 線性范圍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.4.3.1 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A2 文件［4］，挑選新鮮高值和低值臨床尿液樣本各1份，挑選的高值樣本白蛋白含量應(yīng)與試劑盒標(biāo)稱線性范圍上限盡可能相符。按照10L、2H+8L、4H+6L、6H+4L、8H+2L、10H將高值和低值樣本配制為6個(gè)濃度，用OLYMPUS AU640型全自動(dòng)生化分析儀對(duì)6個(gè)濃度的尿液樣本進(jìn)行分析，每個(gè)濃度在同一批次重復(fù)測(cè)定2次。

1.4.3.2 對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每個(gè)濃度2次測(cè)定的均值。將橫坐標(biāo)定義為理論值，縱坐標(biāo)定義為實(shí)測(cè)值的均值，繪制散點(diǎn)圖。觀察實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)，看是否存在較明顯的非線性或離群點(diǎn)，如存在，應(yīng)查找原因。若有明確原因，糾正后修正數(shù)據(jù)；若無(wú)明顯原因，則應(yīng)重新檢測(cè)全部數(shù)據(jù)。

1.4.3.3 根據(jù)公式計(jì)算SDr。

式中，L代表樣本數(shù)，ri1與ri2代表兩次測(cè)定的實(shí)際結(jié)果。

1.4.3.4 將SDr與設(shè)定的不精密度目標(biāo)進(jìn)行比較，本次試驗(yàn)以美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）和美國(guó)醫(yī)療保險(xiǎn)和醫(yī)療補(bǔ)助服務(wù)中心（Centers for Medicare and Medicaid Services，CMS）發(fā)表的臨床實(shí)驗(yàn)室修正法規(guī)1988（CLIA'88）中規(guī)定的允許誤差的1/4為不精密度目標(biāo)。如果SDr大于設(shè)定目標(biāo)，則可能是不精密度欠佳，不能可靠地評(píng)價(jià)線性關(guān)系。此時(shí)應(yīng)檢查生化儀或操作流程，找到引起不精密度欠佳的原因，

糾正后重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果方法性能與以前評(píng)估重復(fù)性時(shí)一致，重復(fù)測(cè)量次數(shù)增多1倍（4次），這樣可以將均值的標(biāo)準(zhǔn)差降低約40%。

1.4.3.5 進(jìn)行回歸分析，計(jì)算一階、二階、三階回歸方程及回歸標(biāo)準(zhǔn)誤。利用t檢驗(yàn)對(duì)二階（b2）、三階（b2、b3）回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，如果3個(gè)回歸系數(shù)與0比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），則可認(rèn)定其為一級(jí)線性，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則判斷為非線性。若為非線性，則應(yīng)比較各標(biāo)準(zhǔn)誤大小，選擇標(biāo)準(zhǔn)誤最小者為最適多項(xiàng)式，并分析最適多項(xiàng)式在各個(gè)濃度上的線性偏差（deviation from linearity，DL）。

1.4.4 參考區(qū)間驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考CLSI C28-A2文件［5］，抽取20例健康體檢合格者作為甲組，其測(cè)定值如果有18例及以上在設(shè)定的參考值范圍內(nèi)，即95%以上，則設(shè)定的參考區(qū)間便可以接受；如果低于95%，則需重新抽取另外20例健康體檢合格者作為乙組再次檢測(cè)。若乙組的測(cè)定結(jié)果95%以上在所設(shè)定的參考范圍內(nèi)，則仍然可以認(rèn)為驗(yàn)證有效；若乙組有超過(guò)2例在參考區(qū)間以外，則應(yīng)首先判斷檢測(cè)程序、檢測(cè)系統(tǒng)性能是否可靠，然后再分析人群生物特性是否可能對(duì)該項(xiàng)目的參考區(qū)間驗(yàn)證產(chǎn)生影響，重新選定合適的生物參考區(qū)間，必要時(shí)可自建生物參考區(qū)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 2003對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果 共檢測(cè)10個(gè)標(biāo)本。高濃度水平、低濃度水平質(zhì)控品的CV批內(nèi)分別為0.7%和1.0%，CV批間分別為1.5%和1.8%。CLIA'88允許誤差為10%，CV批內(nèi)均小于CLIA'88允許誤差的1/4；CV批間均小于CLIA'88允許誤差的1/3。

2.2 正確度驗(yàn)證結(jié)果 共檢測(cè)10個(gè)標(biāo)本。高濃度水平校正品靶值為87 mg/L，均值為86.8 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為0.34 mg/L，上置信限為87.1 mg/L，下置信限為86.4 mg/L，置信區(qū)間包括靶值；低濃度水平校正品靶值為24 mg/L，均值為23.9 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為0.29 mg/L，上置信限為24.2 mg/L，下置信限為23.6 mg/L，置信區(qū)間包括靶值。因此可以證實(shí)正確度。

2.3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果 共檢測(cè)12個(gè)標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯的非線性和離群值，SDr小于不精密度目標(biāo)。對(duì)二階（b2）、三階（b2、b3）回歸系數(shù)的 t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，回歸系數(shù)與0比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），判斷為一次方程呈線性。其線性范圍評(píng)價(jià) r＝0.999 5，r2＝0.998 9，預(yù)期值與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性良好?；貧w方程為y＝1.001 6x＋2.142，說(shuō)明書(shū)的線性范圍為6～150 mg/L，驗(yàn)證線性范圍為6.45～151.40 mg/L。

2.4 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果 20例實(shí)驗(yàn)對(duì)象的結(jié)果均在現(xiàn)行參考區(qū)間內(nèi)，因此可判定現(xiàn)行參考區(qū)間有效。現(xiàn)行參考區(qū)間為0～20 mg/L，驗(yàn)證參考區(qū)間為7.8～11.7 mg/L。

3 討論

白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為69 000，帶負(fù)電荷，是腎小球在發(fā)揮其濾過(guò)作用時(shí)所能允許通過(guò)的最大相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)之一，主要由肝臟分泌，經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)的白蛋白在近曲小管基本全部被主動(dòng)重吸收，重吸收后的尿液中只存有很少的白蛋白，通常在隨機(jī)尿樣本中的含量＜20 mg/L。如果腎小球基底膜發(fā)生病變，通過(guò)腎小球的白蛋白大量增加，使得腎小管無(wú)法全部重吸收時(shí)，尿中的白蛋白將會(huì)增加［6］。mALB對(duì)于早期診斷具有重要意義，研究表明，mALB既是評(píng)估高血壓性腎?。?］和糖尿病性腎病［8］的早期敏感指標(biāo)，還已被證實(shí)是心血管系統(tǒng)疾病的重要危險(xiǎn)因子［9-10］，同時(shí)mALB也是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損的標(biāo)志，能夠預(yù)測(cè)大血管病變［11］。另外，mALB對(duì)于監(jiān)控腎移植術(shù)后感染［12］及重癥過(guò)敏性紫癜的治療［13］也有一定的意義。

當(dāng)隨機(jī)尿樣本中白蛋白濃度為20～150 mg/L時(shí)，由于低于尿常規(guī)試帶法的可檢出范圍，常常導(dǎo)致其無(wú)法檢出，因此需要使用其他方法對(duì)mALB進(jìn)行檢測(cè)。mALB的檢測(cè)方法較多，如放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫比濁法等。目前放射免疫法被認(rèn)為是檢測(cè)mALB的金標(biāo)準(zhǔn)，這種方法應(yīng)用最早，靈敏度和準(zhǔn)確性較好［14］，但缺點(diǎn)是使用的儀器較貴，且存在放射性污染的問(wèn)題，在臨床應(yīng)用上具有局限性?；瘜W(xué)發(fā)光法是近年新興的方法，這種方法的靈敏度和準(zhǔn)確性也較好，但缺點(diǎn)是成本較高。ELISA法雖然成本較低，但操作繁瑣，影響因素較多，結(jié)果的可靠性較差。免疫比濁法是mALB測(cè)定的常用方法，其理論基礎(chǔ)是抗原、抗體在特殊緩沖液中能迅速形成抗原-抗體復(fù)合物，成為均勻分散于反應(yīng)體系中的顆粒，這些顆粒具有光學(xué)特性，可使反應(yīng)體系在濁度儀下出現(xiàn)度數(shù)，如果在反應(yīng)體系中加入過(guò)量的抗體，隨抗原量增加形成的復(fù)合物也會(huì)增加，反應(yīng)體系的濁度亦隨之增加［15］。免疫比濁法根據(jù)濁度儀檢測(cè)的反應(yīng)體系是透射光還是散射光而分為免疫透射濁度法和散射濁度法。其中免疫透射濁度法測(cè)定透射光，依據(jù)的是朗伯-比爾定律；而免疫散射濁度法測(cè)定散射光，依據(jù)的是雷萊定律。免疫透射比濁法具有儀器構(gòu)造簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、結(jié)果可靠、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，可整合在生化分析儀上，目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)廠商生產(chǎn)的生化分析儀都有免疫透射比濁功能，方法易于普及［16］；而免疫散射比濁法需要特殊的免疫散射比濁儀，很難整合在全自動(dòng)生化分析儀上，目前國(guó)內(nèi)臨床檢驗(yàn)工作中主要在既時(shí)檢驗(yàn)（point of care testing，POCT）中使用。

Orion mALB檢測(cè)試劑盒是利用免疫透射比濁法檢測(cè)mALB。本資料經(jīng)過(guò)對(duì)Orion mALB檢測(cè)試劑盒性能的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該試劑盒的正確度高，精密度好，線性范圍符合說(shuō)明書(shū)要求，參考區(qū)間有效。該試劑盒在OLYMPUS AU640全自動(dòng)生化分析儀上能滿足臨床檢驗(yàn)的要求。

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