腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)因子FOXP3在乳腺癌中的表達及臨床病理分析

宮國良，陳靜寧，張元鑫，吳盛桂

(1.汕頭潮南民生醫(yī)院 病理科，廣東 汕頭515044；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 病理科；3.汕頭市金平區(qū)婦幼保健院 婦產(chǎn)科)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，目前臨床多采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、免疫治療等聯(lián)合治療方法。其中，免疫治療是近年來研究的熱點，是繼手術(shù)、放化療和靶向治療之后新興且前景遠大的治療方法，腫瘤的免疫微環(huán)境作為免疫治療的核心理論，尤其受到重視，但機制尚不十分清楚[1]。叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3)是腫瘤免疫微環(huán)境標志性因子，廣泛用于腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)研究[2，3]。因此，本研究選取乳腺癌為研究對象，選擇免疫微環(huán)境標志性因子FOXP3及與其表達密切相關(guān)的CD8、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)三種抗體，探討FOXP3與患者年齡、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、分子分型及中醫(yī)證型等臨床病理特征的關(guān)系，并對FOXP3、 CD8及 TGF-β1三者的表達進行相關(guān)性分析，旨在進一步明確腫瘤免疫微環(huán)境與乳腺癌臨床病理特征間的密切聯(lián)系，及其各因子間的調(diào)控機制，為乳腺癌的免疫治療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料收集汕頭潮南民生醫(yī)院2014年3月-2017年1月手術(shù)治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病例82例，手術(shù)前均未接受過抗癌治療?；颊呔鶠榕?，年齡分布31-66歲，平均48.5±17.5歲，所有患者均進行術(shù)前中醫(yī)辨證分型。術(shù)后標本精確測量腫瘤最大直徑后石蠟包埋，4 μm切片，蘇木素-伊紅染色，并常規(guī)進行了PR、ER、HER-2及Ki-67免疫組織化學(xué)染色，進行分子分型。

1.2方法標本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及染色。免疫組化采用EnVision兩步法，F(xiàn)OXP3多克隆抗體購自英國Abcam公司，CD8(克隆號：C8/144B)單克隆抗體及TGF-β1多克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。組織切片65℃烤片后脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗，PBS沖洗5 min×3，滴加—抗室溫孵育1.5 h，PBS沖洗5 min×3，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min×3，DAB顯色，鏡下控制陽性細胞呈棕色為止，充分蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染1分鐘，脫水，封片。免疫組化均設(shè)陽性對照及陰性對照。FOXP3主要表達于細胞漿，CD8表達于細胞膜，TGF-β1表達于細胞漿。

2 結(jié)果

2.1FOXP3在乳腺癌中的表達情況FOXP3以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(圖1)，F(xiàn)OXP3在乳腺癌中最常見的表達部位為細胞漿，其次為細胞漿與細胞核共同表達， 最少見的表達模式是細胞核表達，因此選取陽性表達部位的不同，實驗結(jié)論差異較大。我們選取最常見的細胞漿表達模式作為觀察統(tǒng)計的重點。結(jié)果采用半定量計分方法， 陽性細胞數(shù)按無著色、 陽性細胞數(shù)≤20%、21%-50%和>50%分別判為0、1、2、3分，著色強度按細胞漿無著色、淺黃色、深黃色和棕黃色分別判為0、1、2、3分。兩項評分結(jié)果相乘>6視為高表達，<6分為低表達。我們檢測的82個乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病例中，80例出現(xiàn)細胞漿陽性表達，僅2例陰性，按照高表達和低表達情況分為兩組，其中高表達組50例(60.98%)，低表達32例(39.02%)。

2.2FOXP3的表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系FOXP3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分子分型有關(guān)， 與患者年齡、腫瘤直徑及中醫(yī)證型無關(guān) (表1)。

表1 FOXP3的表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3CD8在乳腺癌中的表達及其與FOXP3相關(guān)性分析本研究計數(shù)腫瘤間質(zhì)中CD8陽性細胞的浸潤密度，腫瘤間質(zhì)CD8陽性細胞指腫瘤浸潤邊界以內(nèi)的間質(zhì)中未與癌細胞直接接觸的淋巴細胞(圖2)。低倍鏡下選取淋巴細胞最豐富的區(qū)域5個，高倍視野下對該區(qū)域CD8陽性淋巴細胞進行計數(shù)。結(jié)果以5個視野細胞平均值表示CD8陽性細胞的浸潤密度。在本研究中CD8陽性細胞的浸潤密度為50.34±31.64個/HPF，與FOXP3的相關(guān)性分析顯示，兩者呈負相關(guān)，r=-0.225，P<0.001。

2.4TGF-β1在乳腺癌各中醫(yī)證型中的表達情況及其與FOXP3相關(guān)性分析TGF-β1主要表達于癌組織細胞漿(圖3)，按無著色、陽性細胞數(shù)≤20%、21%-50%和>50%分別判為陰性、+、++、+++。相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)OXP3與TGF-β1無明顯相關(guān)性，r=0.113，P=0.317。

圖1乳腺癌組織FOXP3細胞漿陽性表達EnVision法高倍放大圖2CD8在腫瘤間質(zhì)淋巴細胞中出現(xiàn)強陽性表達EnVision法高倍放大圖3TGF-β1癌組織細胞漿陽性表達EnVision法高倍放大

3 討論

1889年學(xué)者提出“種子和土壤”的假說，將腫瘤細胞比作種子,把腫瘤細胞所處的環(huán)境比作土壤,也就是我們說的腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境是由非腫瘤基質(zhì)細胞構(gòu)成，包括成纖維細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞等共同構(gòu)成的關(guān)系到腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境[4,5]。而腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞又構(gòu)成了免疫微環(huán)境，免疫微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境有機整體的重要組成部分發(fā)揮著監(jiān)視和防御作用[6,7]，是腫瘤與免疫系統(tǒng)正式交鋒的地點。免疫微環(huán)境可以直接影響腫瘤的預(yù)后，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用，其中也包括乳腺癌，在乳腺癌中，免疫微環(huán)境既有積極的免疫監(jiān)視和防御作用，亦有促進腫瘤生長、侵襲的作用，出現(xiàn)這些現(xiàn)象的具體機制尚不十分清楚，這也是研究者們關(guān)注的重點。

FOXP3是腫瘤免疫微環(huán)境標志性因子，廣泛用于腫瘤免疫微環(huán)境機制研究。FOXP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，2001年由Bmnkow等首次報道，早期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3特異地表達在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，與其發(fā)育和功能密切相關(guān)，隨后學(xué)者們發(fā)現(xiàn)FOXP3在很多惡性腫瘤的癌細胞中也有表達，并且與這些惡性腫瘤的預(yù)后有著密切關(guān)系[8-10]。

有關(guān)FOXP3與乳腺癌的關(guān)系，也有少量文獻報道，大都認為FOXP3與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。研究者選用免疫組織化學(xué)染色，來觀察FOXP3在癌細胞中的表達，與乳腺癌各臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果不完全一致，這和所選不同廠家的FOXP3抗體及觀察的免疫組化陽性表達模式有關(guān)。在乳腺癌組織中，F(xiàn)OXP3以細胞漿陽性最多見， 其次為細胞漿與細胞核均表達， 最少見的表達模式是僅細胞核表達，因此，選擇不同的陽性部位進行觀察，對結(jié)果影響較大，甚至是完全相反的結(jié)論。本文選擇最常見的細胞漿陽性模式，通過研究我們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織FOXP3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分子分型有密切關(guān)系，與患者年齡、腫瘤直徑及中醫(yī)證型無關(guān)。乳腺癌實質(zhì)FOXP3蛋白表達與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在FOXP3高表達組中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為56%，而FOXP3低表達組中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率僅為25%，兩者存在顯著差異，提示FOXP3在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，其作用機制可能為FOXP3抑制體內(nèi)免疫微環(huán)境的抗腫瘤效應(yīng)，使乳腺癌細胞發(fā)生腫瘤逃逸，從而促進了腫瘤浸潤進展和轉(zhuǎn)移。

同時，我們對FOXP3的表達與乳腺癌分子分型的關(guān)系做了進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)在LuminalA組中，F(xiàn)OXP3的高表達率最高。李靜平等[11]對FOXP3細胞核陽性、細胞質(zhì)陽性與乳腺癌分子分型的關(guān)系分別作了統(tǒng)計， 在LuminalA型乳腺癌組織中，F(xiàn)OXP3細胞核表達率最高，而三陰型乳腺癌中細胞質(zhì)FOXP3表達率最高，并認為FOXP3在乳腺癌細胞核中的表達，發(fā)揮改善乳腺癌預(yù)后的作用，而細胞質(zhì)表達與預(yù)后不良相關(guān)，國外也有類似的研究結(jié)果[12]。這一結(jié)論與我們得出的結(jié)論不太一致，原因除了和所選的抗體及免疫組化條件有關(guān)外，可能還有較復(fù)雜的機制，乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境對分子分型的影響，不能簡單的分析為僅受幾個因子的影響，還需要較深入的研究。

FOXP3的陽性表達，在不同腫瘤直徑及不同年齡組中無明顯差異。本文首次對FOXP3的表達與乳腺癌中醫(yī)證型的關(guān)系進行了分析，結(jié)果兩者無明顯相關(guān)性，但不同中醫(yī)證型組乳腺癌CD8與TGF-β1存在明顯差異性表達，說明中醫(yī)證型和腫瘤免疫微環(huán)境還是有密切關(guān)系。

在腫瘤免疫微環(huán)境中，CD8和TGF-β1也是兩個重要的因子[13，14]。而且CD8和TGF-β1與FOXP3在理論上有著密切關(guān)系，CD8+T細胞是腫瘤免疫微環(huán)境中最重要的效應(yīng)執(zhí)行細胞，抑制其活性，能夠有效影響機體的免疫防御功能。FOXP3可以抑制或殺傷CD8+T細胞，達到腫瘤細胞免疫逃逸的目的，我們的實驗結(jié)果也證實了該理論。在本研究中CD8陽性細胞的浸潤密度與FOXP3表達的相關(guān)性分析顯示，兩者呈現(xiàn)負相關(guān)，r=-0.225，P<0.001，也就是說FOXP3可以抑制或殺傷CD8+T細胞的作用是明確的，其理論機制有兩種可能性，其一為FOXP3直接抑制或殺傷CD8+T細胞，其二為FOXP3通過調(diào)控TGF-β1間接抑制或殺傷CD8+T細胞，因此我們又對FOXP3與TGF-β1的相關(guān)性做了分析，發(fā)現(xiàn)兩者無明顯相關(guān)性，因此，我們認為，F(xiàn)OXP3是直接抑制或殺傷CD8+T細胞，達到調(diào)控免疫微環(huán)境的作用，從而促使了腫瘤細胞的免疫逃逸。

綜上所述，腫瘤免疫微環(huán)境標志性因子FOXP3表達于乳腺癌，并通過直接抑制或殺傷CD8+T細胞發(fā)揮作用,從而說明腫瘤免疫微環(huán)境與乳腺癌的密切關(guān)系，為乳腺癌的免疫治療提供新的思路及理論依據(jù)。

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