黃曲霉毒素生物脫毒法研究進展

王少軍，于春娣，唐娟，程果，謝曉麗，楊慶利，*

（1.中華人民共和國青島海關，山東青島266001；2.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島266109）

黃曲霉毒素以其毒性、致癌性、致畸、致突變性著稱，它是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其本質為二氫呋喃香豆素的衍生物，其致癌特性的來源是香豆素結構，毒性來源是二氫呋喃環(huán)結構。目前，根據(jù)黃曲霉毒素分子在紫外照射下熒光顏色的不同分為兩類：發(fā)出藍色熒光的B類（B1、B2）和發(fā)出綠色熒光的 G 類（G1、G2）[1]，此外，還包括一些相似的衍生物，如M1、M2。在黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）被世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC） 列為人類第一類致癌物，被認為是最常見和最強的致癌物質[2]，其毒性是亞硝胺的75倍、砒霜的68倍、氰化鉀的10倍[3]。人類誤食含有黃曲霉毒素的食物可導致黃曲霉毒素急性中毒[4]，并且導致肝臟受到損害，甚至引發(fā)肝癌[5]。家畜食用黃曲霉毒素污染的飼料可導致飼料采食量、生產(chǎn)性能和免疫功能的降低[6]。

黃曲霉毒素的產(chǎn)生受外界環(huán)境因素的影響較大，如在適宜的溫度范圍內（12℃～41℃），濕度越大、水分含量越高，黃曲霉毒素的產(chǎn)生越多；降低氧氣的濃度、提高二氧化碳的濃度，黃曲霉毒素的生成量增加；此外，pH值和光照也會影響黃曲霉毒素的產(chǎn)生[7]。由于黃曲霉毒素廣泛存在于環(huán)境當中，近年來對糧食作物和飼料的污染越來越嚴重。王君等[8]采集了8個省份市售玉米、花生、大米、核桃、松子等284個樣品，經(jīng)檢測：玉米中黃曲霉毒素的檢出率為70.27%，平均含量為36.51 μg/kg，最高為 1 098.36 μg/kg，其中 14.86%的玉米樣品中黃曲霉毒素B1含量超出國家限量標準；花生中黃曲霉毒素檢出率為24.24%，平均含量為80.27 μg/kg，最高為 437.09 μg/kg，其中 3.03%的花生樣品中黃曲霉毒素超出國家及國際食品法典限量標準；大米、核桃、松子污染較輕，未超出國家限量標準。楊曉倩等[9]對2016年采集的山東省9市90份市售鮮玉米樣品采用超高效液相色譜檢測15種真菌毒素，其中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2檢出率分別為 8.88%（8/90）、4.44%（4/90）、2.22%（2/90）和 1.11%（1/90）。徐進棟等[10]調查了2016年山東省各地規(guī)?；瘎游镳B(yǎng)殖場、各大飼料廠及養(yǎng)殖戶的1 037份飼料樣品中黃曲霉毒素B1污染狀況，結果發(fā)現(xiàn)飼料中的玉米、花生餅粕、干酒糟及其可溶物（distillers dried grains with solubles，DDGS）和玉米胚芽粕4種原料的黃曲霉毒素B1含量均超標，超標率分別為27.71%、23.27%、6.90%和4.92%。

黃曲霉毒素在糧食、飼料中污染嚴重，對人類和家畜的健康威脅極大，怎樣去除黃曲霉毒素成為當前科學家們研究的熱點。目前，對于黃曲霉毒素的脫毒方法主要有物理法、化學法和生物脫毒法。物理法主要采取加熱、輻照、溶劑萃取和吸附劑吸附等方法[11-14]。物理法去除黃曲霉毒素，去毒效果雖然好，但是脫毒不徹底，還存在一系列的問題，例如溶劑使用量大可能造成環(huán)境污染，引起操作人員中毒；可能改變物質原來的性質；吸附劑在吸附黃曲霉毒素的同時吸附了營養(yǎng)物質，降低了樣品的營養(yǎng)價值[15]等?；瘜W方法主要采用堿處理法和氧化法（臭氧、過氧化氫處理）等[16-17]。化學法雖然脫毒效果良好，但是極易產(chǎn)生副產(chǎn)物，而且化學處理劑難以完全去除，可能造成食品的二次污染。生物脫毒法較物理、化學等方法具有安全系數(shù)高、特異性強、綠色清潔等獨特優(yōu)勢，被視為最具發(fā)展前景和潛力的脫毒方法[18]，但是目前生物脫毒法去除黃曲霉毒素的技術還沒有廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)。本文綜述了國內外黃曲霉毒素的生物脫毒法，為黃曲霉毒素生物脫毒的深入研究提供參考。

1 黃曲霉毒素生物脫毒方法

生物脫毒方法由于具有安全、高效、不可逆等因素存在巨大的應用和發(fā)展?jié)摿?。生物脫毒法包括生物吸附法、生物酶解法、生物提取物抑制法[19]。目前，對于黃曲霉毒素的生物降解，大多數(shù)的研究集中在生物吸附劑的發(fā)掘，降解黃曲霉毒素的微生物的篩選和分離，對黃曲霉及其產(chǎn)毒性能具有抑制作用的活性成分的分離提取上。近年來，菌類提取物以及植物提取活性成分對黃曲霉毒素的降解及抑制的研究逐漸發(fā)展起來。

1.1 生物吸附法

生物吸附法是通過生物體（主要是酵母菌和益生菌等）吸附黃曲霉毒素，這些生物體與黃曲霉毒素結合后形成復合物，從而達到去除黃曲霉毒素的目的。目前對于吸附黃曲霉毒素的微生物，國內外科學家研究最多的是酵母菌和乳酸菌，它們通過非共價方式與黃曲霉毒素結合形成復合物，黏附在細胞壁上，這種復合物狀態(tài)穩(wěn)定，難以被機體吸收，大部分被排出體外[20]。錢潘攀等[21]用麝香草酚裂解酵母細胞獲得的細胞壁物質吸附黃曲霉毒素B1，結果發(fā)現(xiàn)：細胞壁提取物對黃曲霉毒素的吸附能力達到2.5 μg/mg。Shetty等[22]從西非國家加納本土食品Kenkey（玉米制成的面團）和高粱啤酒中分離出18株酵母菌，研究其對黃曲霉毒素的吸附作用，結果發(fā)現(xiàn)這些菌株能夠吸附超過60%的黃曲霉毒素，而且大部分菌株能夠吸附15%以上的黃曲霉毒素B1。Fazeli等[23]發(fā)現(xiàn)提取于伊朗傳統(tǒng)面包和乳制品中的干酪乳桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌能夠結合黃曲霉毒素B1，其中干酪乳桿菌與黃曲霉毒素B1的結合能力最強。Oluwafemi等[24]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵玉米中分離出來的嗜酸乳桿菌，可以吸附黃曲霉毒素，在玉米粒中人為添加不同濃度的黃曲霉毒素后，隨著添加濃度的增加，嗜酸乳桿菌和黃曲霉毒素的結合率從54%降到23%。張建梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)在畜禽霉變飼料中添加生物脫霉劑能夠促進黃曲霉毒素B1隨糞便排出。微生物吸附黃曲霉毒素是一種物理吸附，吸附力較弱，毒素只是吸附在微生物表面形成毒素-微生物復合物，毒素吸附不完全，吸附過程可逆，當復合物進入動物體內時有可能重新釋放出毒素，因此生物吸附黃曲霉毒素具有一定的局限性。

1.2 生物酶解法

因為生物吸附法不能從根本上徹底去除黃曲霉毒素，生物酶降解黃曲霉毒素成為近年來研究的熱點。生物酶解法是利用生物酶制劑催化降解黃曲霉毒素的一種方法，通過破壞黃曲霉毒素的毒性基團，將黃曲霉毒素降解為低毒或是無毒物質被生物利用或是排除體外，達到去除黃曲霉毒素的目的。生物酶解法主要分為真菌降解和細菌降解兩大類，其作用特點是具有特異性、高效性，反應條件溫和，反應過程不可逆。通過生物降解作用，將黃曲霉毒素降解轉化成低毒或是無毒物質。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細菌、真菌及其代謝產(chǎn)生的酶[26]能夠降解黃曲霉毒素，其中能降解黃曲霉毒素的細菌包括分枝桿菌[27]、橙色黃桿菌[28]、紅串紅球菌[29]、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌[30]、彎曲乳酸桿菌[31]、沃氏葡萄球菌[32]、枯草芽孢桿菌[33]等，能降解黃曲霉毒素的真菌有黑曲霉、莖點霉、根霉菌等[34]。

早在二十世紀六十年代，科學家們就開始研究通過生物降解去除黃曲霉毒素，最早被確認可以降解黃曲霉毒素的細菌是黃桿菌[35]。Liang等[36]分離出一株新嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株，能夠降解85.7%的黃曲霉毒素B1。Samuel等[37]發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌能夠很高效率的降解黃曲霉毒素B1，24小時混合培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中不能檢測出黃曲霉毒素B1。Adebo等[38]分離出的梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)48小時后能降解61.3%的黃曲霉毒素B1，培養(yǎng)60小時后黃曲霉毒素B1全部降解。王寧等[39]對具有降解黃曲霉毒素B1活性的黏細菌的產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件后，該菌株降解黃曲霉毒素B1的能力提高到78.2%。李冰等[40]從300株細菌、真菌和放線菌中篩選出3株具有降解AFB1能力的菌株，包括一株乳酸菌、一株米曲霉和一株黑曲霉，其中黑曲霉降解能力最佳，降解率達93.28%，其降解活性主要來自黑曲霉胞外的代謝產(chǎn)物，從而得出黑曲霉對黃曲霉毒素B1的降解為酶促生化反應過程。Hackbart等[41]發(fā)現(xiàn)里氏木霉和稻根霉在PDA培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5天后能夠降解100%的黃曲霉毒素B1，但是沒有試驗證明在食品基質中存在這兩種霉菌。Zeinvand-Lorestani等[42]發(fā)現(xiàn)漆酶（活力30 U/mL）在含有20%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，35℃、pH值4.5，酶解反應兩天后，能夠去除67%的黃曲霉毒素B1。王勇[43]將黃曲霉毒素降解酶添加到肉仔雞的基礎日糧中，黃曲霉毒素降解酶可改善AFB1對肉仔雞生長性能和肝臟酶活的影響，基本消除AFB1毒性。溫思霞等[44]通過克隆表達得到假蜜環(huán)菌的黃曲霉毒素氧化酶，該酶的比活力為234U/mg，具有較好的黃曲霉毒素B1轉化活性。目前對于生物酶降解黃曲霉毒素方面的研究還主要集中在菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化上。對于酶分子的結構的剖析、作用機制的研究仍處于初步發(fā)展階段。

1.3 生物提取物抑制法

繼吸附法、酶解法后，研究人員發(fā)現(xiàn)從微生物或植物體內提取的某些活性成分，對黃曲霉具有抑制作用或能夠降解黃曲霉毒素，這些方法統(tǒng)稱為生物提取物抑制法。Reverberi等[45]研究發(fā)現(xiàn)從香菇中提取的多糖物質對寄生曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素具有抑制作用。Zjalic等[46]研究發(fā)現(xiàn)來自于白腐菌的β-葡聚糖也能夠抑制黃曲霉毒素的合成。李紅波等[47]研究了香菇多糖、海帶多糖、石耳素、燕麥β-葡聚糖等十余種不同結構的多糖對黃曲霉菌的生產(chǎn)和產(chǎn)毒的影響，其中海帶多糖、馬鈴薯直鏈淀粉、香菇纖維素、香菇多糖能夠明顯降低黃曲霉菌絲產(chǎn)毒能力。上述多糖主要是β-葡聚糖通過激活了轉錄因子hsf-2，從而延遲產(chǎn)生黃曲霉毒素的相關基因的表達，以此抑制黃曲霉的產(chǎn)毒。除多糖外，一些植物水提物對黃曲霉及其產(chǎn)毒性能也具有抑制作用。吳清華[48]研究了茶葉中抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的組分，其中沒食子酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素、香豆素對黃曲霉產(chǎn)毒抑制較強，槲皮素的抑制強度最強。王淼焱等[49]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素是通過激活抗氧化系統(tǒng)轉錄因子Yap1，導致黃曲霉體內的抗氧化酶系統(tǒng)活性的增加，從而抑制產(chǎn)生黃曲霉毒素基因的表達。李浩等[50]研究了云南大葉種曬青毛茶提取物對黃曲霉產(chǎn)毒的影響，結果表明云南大葉種茶能有效抑制黃曲霉AS3.4408產(chǎn)AFB1和AFB2，AS3.4408在云南大葉種茶中可能產(chǎn)生了黃曲霉毒素的前體物質，但茶葉中的某種物質抑制了合成該毒素的關鍵酶。此外，其他植物提取物也對黃曲霉的生長及產(chǎn)毒具有抑制作用，如梁丹丹等[51]研究發(fā)現(xiàn)植物提取物肉桂醛、檸檬醛和丁香酚對黃曲霉生長及產(chǎn)毒均具有抑制作用。許多研究發(fā)現(xiàn)許多中藥提取物中含有多種活性物質可用于黃曲霉毒素的解毒，如鄭海平[52]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對黃曲霉毒素B1致大鼠肝癌具有抑制作用，其主要是通過調節(jié)基因的表達阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮作用。張學梅[53]對黃芩提取物及其黃酮類化合物的研究發(fā)現(xiàn)，其能夠通過抑制細胞色素P450的活性，從而阻止黃曲霉毒素轉化成高致癌物質的過程，從而保護生物機體。張馨如等[54]研究了中草藥提取物作為飼料添加劑的效果，各中草藥提取物對黃曲霉具有抑制作用，用作飼料的防霉劑效果良好，使用含有中草藥提取物的飼料的豬的血清抗氧化性能增強，其中公丁香提取物的效果最佳。此外，油茶籽及其餅粕[55]、半枝蓮提取物[56]等對黃曲霉及其毒素的產(chǎn)生也具有抑制作用。

植物提取物中雖然含有多種抑制黃曲霉生長及產(chǎn)毒的活性物質，但由于黃曲霉分布廣泛，環(huán)境中的黃曲霉毒素未進入生物體前不會產(chǎn)生任何危害作用，清除環(huán)境中所有的黃曲霉也是不切實際的，盡管近年來國家和社會各界對黃曲霉污染越來越重視，并且加大了市場的監(jiān)管力度，但是，黃曲霉毒素還是會進入人類飲食和家畜的飼料中，而且丟棄輕度黃曲霉毒素污染的飼料會造成資源的浪費，近年來的研究逐漸轉向增強生物體對黃曲霉毒素的解毒方向轉變。

2 總結和展望

黃曲霉毒素是目前已知的霉菌毒素中毒性最強的一種，具有很強的致癌、致突變和致畸作用。近年來，因黃曲霉毒素嚴重污染糧食和飼料，對人類及動物健康造成嚴重危害，對于黃曲霉毒素的脫毒方法研究已成為各國科研工作者的一個熱點。相對于物理、化學等黃曲霉毒素脫毒方法，生物脫毒法具有安全系數(shù)高、特異性強、綠色清潔等優(yōu)勢，是最具發(fā)展前景和潛力的脫毒方法。雖然生物脫除黃曲霉毒素是一種安全而又高效的方式，但目前大多數(shù)的研究均集中在生物吸附劑的發(fā)掘、降解黃曲霉毒素的微生物的篩選和分離以及對黃曲霉及其產(chǎn)毒性能具有抑制作用的活性成分的分離提取上，而對于活性成分降解黃曲霉毒素的結構、黃曲霉毒素降解后產(chǎn)物的安全性評價以及將實驗室研究的理論向產(chǎn)業(yè)轉型的問題研究較少。后期研究應將黃曲霉毒素的生物脫毒方法從實驗室小規(guī)模的理論研究轉型到大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，切實發(fā)揮出實際應用價值。