幾株適用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌的分離篩選及鑒定

李建 ，李麗 ，彭翠珍 ，羅碧霞 ，曾雄 ，宗緒巖 ，2，*

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

發(fā)酵肉制品是指在自然或人工控制條件下，利用微生物發(fā)酵作用生產(chǎn)的具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，且具有較長保存期的肉制品[1]。雖然不同地方的產(chǎn)品特點(diǎn)各不相同，但微生物的代謝活動(dòng)對其風(fēng)味物質(zhì)形成均起著至關(guān)重要的作用[2]。我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品多采用自然發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，經(jīng)自然富集的微生物發(fā)酵的肉制品有時(shí)會(huì)由于發(fā)酵失敗而使其產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，安全性難以得到保障[3-4]。采用經(jīng)篩選的性能優(yōu)良的菌種作為發(fā)酵劑，定向接種于肉制品發(fā)酵，則可以有效控制發(fā)酵過程，從而提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性、感官及其它特性[5-6]。

乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出來的微生物，在整個(gè)發(fā)酵過程中占有絕對優(yōu)勢[7-8]。其作用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，降低肉制品的pH值[9]。在酸性條件下，肌肉蛋白變性形成膠狀組織，從而提高了肉品的硬度與彈性[10]。另一方面，沙門氏菌、李斯特桿菌等致病菌的生長得到抑制，同時(shí)大多數(shù)乳酸菌能產(chǎn)細(xì)菌素，可進(jìn)一步提高發(fā)酵的競爭力[9]。此外，發(fā)酵所營造的酸性環(huán)境和乳酸菌的觸酶活性，促進(jìn)了亞硝酸鹽的分解，降低了殘留的NO2-與二級胺作用生成亞硝胺的可能性[11]。二是有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。發(fā)酵所產(chǎn)的乳酸雖然沒有典型的風(fēng)味/香氣化合物的特性，但可以賦予肉品特征性的酸味[12]。

目前應(yīng)用于發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中的乳酸菌種類較多，包括植物乳桿菌、清酒乳桿菌、乳酸乳桿菌、乳酸片球菌等[13]。周才瓊[14]研究渝黔地區(qū)傳統(tǒng)酸肉微生物種群發(fā)現(xiàn)，乳酸菌優(yōu)勢菌群主要是片球菌屬和乳桿菌屬。Dertli等[15]研究了乳酸菌對土耳其發(fā)酵香腸的影響，發(fā)現(xiàn)其對于協(xié)調(diào)香腸的彈性及黏度有積極作用。葛平珍等[16]從發(fā)酵酸肉中分離得到1株高效降膽固醇的短乳桿菌，并對其降膽固醇作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，膽固醇降低過程中同化作用大于沉淀作用。Fang Yang[17]對香腸發(fā)酵過程中內(nèi)源蛋白酶以及植物乳桿菌的降解活性進(jìn)行了研究，前者主要降解肌漿蛋白質(zhì)、肌原纖維蛋白質(zhì)，后者主要水解肌肽。鞏洋等[18]將戊糖片球菌和植物乳桿菌、葡萄球菌按不同添加比例制作發(fā)酵劑，研究了低酸度川味香腸的加工工藝。植物乳桿菌在改善風(fēng)味，提高肉制品的食用安全性上效果較好，而清酒乳桿菌則對不同來源肉質(zhì)的適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠保證在整個(gè)發(fā)酵過程中處于生長優(yōu)勢[13]。

本研究采用稀釋平板法對自然發(fā)酵香腸及泡菜水中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，檢測了其產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)黏液等發(fā)酵特性，并研究了其在不同溫度、pH值、NaCl、NaNO2的條件下的生長情況，以期得到適用于肉制品發(fā)酵劑的乳酸菌菌種，為肉制品乳酸菌發(fā)酵劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：菌株分別從泡菜水及自然發(fā)酵香腸中分離得到，泡菜水取樣于自貢市大安區(qū)農(nóng)家，香腸購于自貢市匯東通達(dá)農(nóng)貿(mào)市場；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；L-精氨酸、葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈣、乙酸鉛、硫酸鎂、硫酸錳等（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；脫脂乳粉、豬油、中性紅指示劑：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)高壓滅菌鍋（MLS-3020）：致微（廈門）儀器有限公司；微生物培養(yǎng)箱（LS-I201）：飛世爾實(shí)驗(yàn)器材（上海）有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2000）：湘藝儀器（上海）有限公司；厭氧罐氣體控制系統(tǒng)（Whitley Jar Gassing system）：北京中科星宇商貿(mào)有限公司；電子天平（JE2002）：上海浦春計(jì)量儀器有限公司；筆式酸度計(jì)（PH-100）：浙江力辰儀器科技有限公司；生物顯微鏡（DM300）：徠卡儀器（德國）有限公司；大型臺式恒溫冷凍搖床（MaxQ4000）：上海智城分析儀器制造有限公司；高效落地高速離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀：美國Thermo公司；電泳儀（DYY-12）：北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-best200E）：美國西蒙公司；臺式高速微量（冷凍型）離心機(jī)（D3024）：上海珂淮儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化及初步篩選

參考GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》，遵循無菌操作，用滅菌的剪刀剪取25 g香腸肉餡，用225 mL無菌生理鹽水稀釋，用拍打式均質(zhì)機(jī)作均質(zhì)處理。分別將泡菜水、香腸肉餡樣品處理液作10倍系列稀釋，取104、105、106倍稀釋液100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的碳酸鈣）上，于37℃厭氧培養(yǎng)48 h，選取有溶鈣圈且符合乳酸菌菌落形態(tài)（菌落呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊）的菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)劃線純化[4]。對純化好的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗(yàn)，選取過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、不形成芽孢的菌株作為初篩菌株[6]。

1.3.2 菌液光密度值的測定

用紫外分光光度計(jì)在600 nm條件下比色，測定菌液的OD值。分別用相應(yīng)的未接入菌種的培養(yǎng)液作空白[19]。

1.3.3 菌株復(fù)篩試驗(yàn)

作為肉制品的發(fā)酵劑應(yīng)該具備以下特性：在添加6%NaCl和150 mg/kg NaNO2條件下仍然能良好生長，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)黏液，不具有氨基酸脫羧酶活性，對蛋白質(zhì)和脂肪無明顯的分解作用等特點(diǎn)[20]。據(jù)此進(jìn)行以下篩選試驗(yàn)。

耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗(yàn)：將待測菌分別接種于已添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、2%、4%、6%NaCl及質(zhì)量濃度為 0、5、10、15 mg/100 mL NaNO2的 MRS 液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24 h后測定吸光度值的變化[21]。

菌株的生長曲線及產(chǎn)酸能力的測定：將待測菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)24 h，每2 h測定一次菌液的OD值和pH值[22]。

不同溫度條件下菌株的生長能力：將待測菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別于10、20、30、40℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD值[23]。

不同pH值條件下菌株的生長能力：將待測菌株接種于 MRS 液體培養(yǎng)基（pH3.5、4.5、5.5、6.5），37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD值[23]。

產(chǎn)黏性實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶測定實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、乳酸的紙層析分析，參考《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，而蛋白質(zhì)降解活性實(shí)驗(yàn)、脂肪分解活性實(shí)驗(yàn)則參考段艷的方法[23]。

1.3.4 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取，并以所得細(xì)菌的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系和PCR反應(yīng)條件按照參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，條件為 80 V，60 min，Marker為 DL2000，并將PCR產(chǎn)物送至送派森諾生物科技股份有限公司（上海）測序，測序結(jié)果在NCBI基因庫中進(jìn)行BLAST同源性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及純化

挑選溶鈣圈較大的菌落，通過反復(fù)劃線純化培養(yǎng)，并排除革蘭氏陰性及過氧化氫酶陽性菌株，選取紙層析Rf值與0.02 g/mL乳酸接近的菌株，最后共得到14株疑似乳酸菌菌株。其中9株篩選自香腸（編號為 XC-1、XC-2……XC-9），5株篩選自泡菜水（編號為PC-1、PC-2……PC-5）。14株菌的菌落特征基本相似，為凸透鏡狀，呈現(xiàn)出乳白色、表面光滑圓潤、邊緣整齊的特點(diǎn)。

2.2 菌株對NaCl的耐受性

菌株對不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受性見表1。

表1 菌株對不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受性Table 1 NaCl tolerance of different lactic acid bacteria at different NaCl concentration

由表1可知，隨著MRS液體培養(yǎng)基中NaCl添加量的增加，14株受測菌株的生長受到了不同程度的抑制。當(dāng)NaCl的添加量到達(dá)6 g/100 mL時(shí)，僅XC-3、XC-5、XC-9、PC-1、PC-3表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，因此選取這5株菌作進(jìn)一步篩選。

2.3 菌株對NaNO2的耐受性

亞硝酸鹽常用作防腐劑、發(fā)色劑而添加于發(fā)酵肉制品中，而肉制品在其發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生少量的亞硝酸鹽，因此要求菌株對亞硝酸鹽應(yīng)有一定的耐受性[25]。菌株對不同質(zhì)量濃度NaNO2的耐受性見表2。

表2 菌株對不同質(zhì)量濃度NaNO2的耐受性Table 2 NaNO2tolerance of different lactic acid bacteria at different NaNO2concentration

由表2可知，亞硝酸鹽的添加一定程度上影響了受測菌株的生長代謝。當(dāng)添加量到達(dá)15 mg/100 mL時(shí)，5株菌仍能生長，這表明受測菌株對亞硝酸鹽均具有較好的耐受力，可用作進(jìn)一步篩選。

2.4 篩選菌株的發(fā)酵特性

菌株的發(fā)酵特性見表3。

表3 篩選菌株的主要發(fā)酵特性Table 3 Fermentation characteristics of selected strains

由表3可知，5株受測菌株均不產(chǎn)黏液，不產(chǎn)H2S，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，不具備蛋白質(zhì)、脂肪分解能力，因此可對其產(chǎn)酸能力、不同pH值、溫度條件下的生長情況等作進(jìn)一步研究。

2.5 菌株的產(chǎn)酸能力

產(chǎn)酸能力是篩選乳酸菌的一個(gè)重要指標(biāo)，發(fā)酵所產(chǎn)的乳酸能夠賦予發(fā)酵肉制品特征性的酸味[26]。此外，在酸性條件下，沙門氏菌、李斯特桿菌等致病菌的生長得到抑制[27]。菌株的產(chǎn)酸曲線見圖1。

圖1 分離菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.1 Production acid rate curve of isolated strain

由圖1可知，5株菌的培養(yǎng)基pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先迅速下降后趨于平緩的特點(diǎn)。培養(yǎng)24 h后，除PC-1外，其余4株受測菌株所處的培養(yǎng)基的pH值均下降到了4.0左右，符合肉制品發(fā)酵劑的產(chǎn)酸要求。

2.6 菌株的生長曲線

菌株的生長曲線見圖2。

由圖2可知，4株受測菌株均具備良好的環(huán)境適應(yīng)能力，延滯期相對較短。接種后迅速生長繁殖，菌體濃度顯著增加，隨后生長曲線趨于平緩，進(jìn)入穩(wěn)定增長期。

圖2 分離菌株的生長曲線Fig.2 Growth rate curves of selected strains

2.7 菌株在不同溫度下的生長能力

通常要求應(yīng)用于肉制品發(fā)酵的乳酸菌在15℃～40℃條件下能夠生長，低溫條件下仍具備較強(qiáng)的生長能力，最適生長溫度為30℃～37℃[3]。菌株在不同溫度下的生長能力見圖3。

圖3 分離菌株在不同溫度下的生長能力Fig.3 Effect of different temperature on the growth of selected strains

由圖3可知，不同培養(yǎng)溫度對4株受測菌株影響不同，但均滿足要求。

2.8 菌株的在不同pH下的生長能力

菌株在不同pH下的生長情況見圖4。

圖4 分離菌株在不同pH值下的生長能力Fig.4 Effect of different pH on the growth of selected strains

由圖4可知，4株受測菌株在不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中均能生長。肉品發(fā)酵結(jié)束后其pH值多低于5.3，而本試驗(yàn)篩選得到的4株菌均能夠在pH4.5的條件下較好地生長，因此適合作為肉制品的發(fā)酵劑。

2.9 菌株16S rRNA序列分析

對篩選得到的4菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乳酸菌的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 The electrophoresis of 16S r DNA PCR amplification of LAB

在約為1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。之后將產(chǎn)物送至測序公司測序，將所測得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性分析，結(jié)果如表4所示。

表4 4株菌株的序列分析Table 4 Sequence analysis of selected strains

由表4可知，從香腸中篩選得到3株菌XC-3、XC-5、XC-9與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）有99%的同源性。而從泡菜水中篩選得到菌株P(guān)C-3與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）有99%的同源性。當(dāng)16S r RNA序列同源性高于97%時(shí)，可認(rèn)為是屬內(nèi)的同種，因此確定XC-3、XC-5、XC-9為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），PC-3為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus strain）。

3 結(jié)論

乳酸菌在改善發(fā)酵肉制品風(fēng)味，提高產(chǎn)品安全性方面具有重要的作用，為篩選得到適合于肉制品發(fā)酵的乳酸菌，分別以泡菜水、自然發(fā)酵香腸為樣品，從中分離篩選得到14株乳酸菌疑似菌株。參考肉制品發(fā)酵劑對乳酸菌的要求，分別檢測了菌株對NaCl、NaNO2的耐受性、是否產(chǎn)黏液等發(fā)酵特性以及產(chǎn)酸、不同溫度、pH值條件下的生長能力，最終排除了9株對NaCl的耐受性較差以及1株產(chǎn)酸能力較弱的菌株，將4株符合要求的菌株進(jìn)行測序，經(jīng)形態(tài)學(xué)及同源性分析，結(jié)果表明：從香腸中篩選得到的3株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），而從泡菜水中篩選得到1株菌為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。

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