超聲提取結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)常見(jiàn)食品中的吡咯素

周凱文，陳曉默，劉慧琳 ，穆琳，王靜

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京100048）

1912年Louis Camille Maillard發(fā)現(xiàn)在加熱氨基酸和還原糖時(shí)會(huì)生成一種棕色混合物[1]，因此后來(lái)將氨基和羰基化合物之間的反應(yīng)稱(chēng)為美拉德反應(yīng)（Maillard reaction），美拉德反應(yīng)在為食品提供香氣、色澤的同時(shí)也會(huì)生成一些對(duì)人體有害的化合物，如晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs），AGEs形成于美拉德反應(yīng)的后期階段，是一類(lèi)穩(wěn)定的化合物，包括吡咯素（ε-2-甲?；?5-羥甲基-1-吡咯-L-亮氨酸，Pyrraline）、羧甲基賴(lài)氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）、羧乙基賴(lài)氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL），丙烯酰胺（acrylamide，AA）等等，AGEs可以通過(guò)膳食進(jìn)入人體內(nèi)并在人體內(nèi)積累，研究表明，在西方飲食中，人類(lèi)每天大概攝入25 mg～75 mg AGEs，主要是CML和吡咯素[2]，AGEs在人體內(nèi)的積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而會(huì)引起一系列的慢性疾病，同時(shí)也會(huì)加速機(jī)體的衰老[3]。大量的臨床實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，吡咯素在人體的積累與一些慢性疾病有著密切的關(guān)系[4-5]。吡咯素作為美拉德反應(yīng)后期階段的重要標(biāo)志物，也作為AGEs定量檢測(cè)的重要化合物，受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。

超聲提取是一種新型的輔助提取法，現(xiàn)已廣泛用于生物、化學(xué)和食品行業(yè)。主要是通過(guò)熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)[6]破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而溶解待提取成分，并進(jìn)一步分離。超聲提取目前主要用于多糖[7-8]、多酚[9]以及黃酮等物質(zhì)的提取[10]，本實(shí)驗(yàn)首次利用超聲提取法提取食品中的吡咯素，結(jié)合高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)不同食品中的吡咯素，具有操作簡(jiǎn)單快速易行的特點(diǎn)，檢測(cè)了牛奶、奶酪、果蔬干、堅(jiān)果、餅干、醬油、奶粉、面包、火腿和咖啡等常見(jiàn)食品中游離吡咯素的含量，對(duì)減少食源性AGEs的攝入有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶、奶酪、果蔬干、堅(jiān)果、餅干、醬油、奶粉、面包、火腿、咖啡：永輝超市；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純）：北京百靈威科技有限公司；無(wú)水甲醇（分析純）：西隴化工股份有限公司；氨水（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。

CR22N高速冷卻離心機(jī)：日立工機(jī)㈱有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：島津（中國(guó)）有限公司；KQ-700GVDV三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；PT2500 E勻漿機(jī)：瑞士Buchi（布奇）公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi（布奇）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲條件的優(yōu)化

1.2.1.1 料液比的優(yōu)化

稱(chēng)取8 g奶粉，分別分散于40、80、160 mL甲醇（含5%氨水）中，使料液比為1∶5、1∶10、1∶20（g/mL）。在溫度為45℃，頻率為80 KHz條件下超聲30 min后，5 590 r/min條件下離心10 min，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸干后，復(fù)溶于2 mL超純水中，利用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1.2 超聲頻率的優(yōu)化

稱(chēng)取8 g奶粉，分散于80 mL甲醇（含5%氨水）中，在溫度為45℃，頻率分別為45、80、100 KHz條件下超聲30 min后，5 590 r/min條件下離心10 min，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸干后，復(fù)溶于2 mL超純水中，利用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1.3 時(shí)間的優(yōu)化

稱(chēng)取8 g奶粉，分散于80 mL甲醇（含5%氨水）中，在溫度為45℃，頻率為80 KHz條件下分別超聲15、30、45、60 min 后，5 590 r/min 條件下離心 10 min，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸干后，復(fù)溶于2 mL超純水中，利用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1.4 溫度的優(yōu)化

稱(chēng)取8 g奶粉，分散于80 mL甲醇（含5%氨水）中，在溫度分別為25、45、75℃，頻率為80 KHz條件下超聲30 min后，5 590 r/min條件下離心10 min，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸干后，復(fù)溶于2 mL超純水中，利用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)際樣品預(yù)處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取或量取牛奶、奶酪、果蔬干、堅(jiān)果、餅干、醬油、奶粉、面包、火腿和咖啡等實(shí)際樣品各8 g或8 mL于50mL離心管中，根據(jù)方法1.2.1確定的最優(yōu)料液比加入相應(yīng)體積的提取劑后，用勻漿機(jī)攪拌成勻漿，并進(jìn)行超聲處理，而后將提取劑進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸干后，復(fù)溶于2 mL超純水中，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 HPLC法檢測(cè)吡咯素

1.2.3.1 配制吡咯素標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)取吡咯素純品，配制成濃度為2mmol/L的母液。用超純水將母液稀釋成以下濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L，并放入離心管中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 HPLC條件

根據(jù)Portero-Otin法[4]，并做一定的修改，采用In-ertsil ODS-SP 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A 為0.1%TFA的水溶液，流動(dòng)相B為乙腈水溶液（體積比=1 ∶1），梯度洗脫程序?yàn)?1 min～10 min，0%～15%B；10 min～30 min，15%～20%B；30 min～35 min，20%～100%B；35 min～40 min，100%～0%B；40 min～45 min，0%B，流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量為 5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為297 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形的繪制，Spss 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取條件的優(yōu)化

超聲提取能通過(guò)熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)[6]破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而溶解待提取成分，并進(jìn)一步分離。影響提取效果的主要因素是超聲波強(qiáng)度、聲波頻率、液體的表面張力、黏滯系數(shù)以及溫度和提取時(shí)間。本文選取對(duì)吡咯素提取量影響較大的4個(gè)因素，分別為料液比、超聲頻率、超聲時(shí)間和溫度。料液比對(duì)吡咯素提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)吡咯素提取量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the pyrraline yield

從圖 1可以看出，料液比達(dá)到 1∶10（g/mL）時(shí)，奶粉中吡咯素的提取量達(dá)到最大值。當(dāng)保持其它條件不變時(shí)，隨著料液比逐漸增加，細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度增大，更有利于吡咯素的溶出，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）后，當(dāng)溶劑再增加時(shí)，吡咯素的提取量反而下降，原因可能是奶粉中的其他物質(zhì)溶解，阻礙了吡咯素的溶出，從而使吡咯素的提取量降低[11]。超聲頻率對(duì)吡咯素提取量的影響見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，當(dāng)超聲頻率達(dá)到80 KHz時(shí)，奶粉中吡咯素的提取量達(dá)到最大值。當(dāng)保持其它條件不變時(shí)，隨著超聲頻率逐漸增加，導(dǎo)致機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)增加，能更有效的破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，有利于吡咯素的溶出，增加吡咯素的提取量，但是當(dāng)頻率過(guò)高時(shí)會(huì)引起熱效應(yīng)，導(dǎo)致提取液中氨氣的揮發(fā)，從而降低了吡咯素的提取量。超聲時(shí)間對(duì)吡咯素提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖2 超聲頻率對(duì)吡咯素提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic frequency on the pyrraline yield

圖3 超聲時(shí)間對(duì)吡咯素提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the pyrraline yield

從圖3可以看出，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，奶粉中吡咯素的提取量達(dá)到最大值。當(dāng)保持其它條件不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，奶粉中的吡咯素提取量逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min后，吡咯素的提取量反而下降。由動(dòng)力學(xué)方程可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取量越大，但增大幅度會(huì)下降[12]，繼續(xù)增加提取時(shí)間，提取量反而會(huì)下降。原因可能是提取時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致熱效應(yīng)，從而引起提取液中氨氣揮發(fā)，降低了吡咯素的提取量。超聲溫度對(duì)吡咯素提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)吡咯素提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the pyrraline yield

從圖4可以看出，當(dāng)提取溫度為45℃時(shí)，奶粉中吡咯素的提取量達(dá)到最大值。當(dāng)保持其它條件一定時(shí)，隨著提取溫度的增加，吡咯素的提取量增加，因?yàn)闇囟鹊纳?，加快了分子的運(yùn)動(dòng)速度，有利于擴(kuò)散傳質(zhì)。當(dāng)溫度達(dá)到45℃后，吡咯素的提取量下降，原因是溫度過(guò)高導(dǎo)致提取液中的氨氣揮發(fā)，影響吡咯素的提取。

因此選擇最優(yōu)超聲提取條件為料液比1∶10（g/mL），時(shí)間 30 min，溫度 45 ℃，頻率 80 KHz，此條件下測(cè)得的奶粉中吡咯素的含量為0.58 μg/g奶粉。

2.2 HPLC法測(cè)定不同食品樣品中吡咯素的含量

固態(tài)、液態(tài)食品樣品中游離吡咯素的含量見(jiàn)表1、表2。

表1 固態(tài)食品樣品中游離吡咯素的含量Table 1 The content of free pyrraline in solid food samples

續(xù)表1 固態(tài)食品樣品中游離吡咯素的含量Cotinue table 1 The content of free pyrraline in solid food samples

表2 液態(tài)食品樣品中游離吡咯素的含量Table 2 The content of free pyrraline in liquid food samples

由表1、2可知，牛奶、奶酪、果蔬干、堅(jiān)果、餅干、醬油、奶粉、面包、火腿腸和咖啡中均檢測(cè)到了吡咯素，其中醬油和咖啡中吡咯素的含量較其他食品中高，最高可達(dá)18.42 μg/mL醬油、11.27 μg/g咖啡。因?yàn)獒u油是發(fā)酵型產(chǎn)品，在發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種小分子物質(zhì)，游離的氨基酸和還原糖增加[13]，所以導(dǎo)致醬油中游離的吡咯素要比其它食品中含量高，卞華偉等對(duì)不同種類(lèi)的食品中CML的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，老抽中的CML的含量較其它食品中高，達(dá)到了（796.35±24.67）μg/mL 食品[14]?？Х榷菇?jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)暮姹禾幚恚梢l(fā)咖啡豆中多糖、脂肪、蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[15]，生成揮發(fā)性呈香物質(zhì)，如吡咯類(lèi)、醛酮類(lèi)等等[16]，其中3-DG是形成吡咯素的前體物質(zhì)。液態(tài)牛奶中吡咯素的含量為（0.15±0.00）μg/mL～（0.31±0.03）μg/mL 樣品，奶粉中吡咯素的含量為（0.13±0.00）μg/g～（1.71±0.00）μg/g 樣品，牛奶中的蛋白質(zhì)主要以大分子的形式存在，因此游離的吡咯素含量較少，而全脂牛奶中吡咯素的含量較高，因?yàn)槿Ｄ讨兄镜暮扛?，Han等人研究表明油脂能夠引發(fā)·OH的產(chǎn)生[17]，可能會(huì)導(dǎo)致吡咯素生成量的增加。面包和餅干中蛋白質(zhì)也主要以大分子的形式存在，因此游離的吡咯素含量較低。奶酪和堅(jiān)果中油脂和蛋白的含量高但是碳水化合物的含量很低[18]，因此吡咯素的含量較低。而果蔬干中碳水化合物的含量很高，但是油脂和蛋白的含量較低，因此吡咯素的含量也相對(duì)較少。類(lèi)似的，黃油和奶酪火腿腸中吡咯素的含量比其他種類(lèi)的火腿腸高。

3 結(jié)論

采用超聲提取結(jié)合HPLC法對(duì)不同的食品樣品中游離吡咯素進(jìn)行測(cè)定，不同來(lái)源的食品中吡咯素的含量有很大的差異，醬油和咖啡中吡咯素的含量最高可達(dá)18.42 μg/mL醬油和11.27 μg/g咖啡，而其他食品中吡咯素的含量相對(duì)較少，主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)主要以大分子物質(zhì)的形式存在，因此游離的吡咯素含量較少。

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