殼寡糖鋅配合物的制備及抑菌活性

盧琪潔，王麗，錢旭，朱雨晴，許鉦，張賓

（浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山316022）

殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）又稱為低聚寡糖、殼聚寡糖或幾丁寡糖，是經(jīng)殼聚糖降解得到的一種低聚合度的堿性氨基寡糖，其具有諸多的生物活性，如提高免疫力、抑制癌腫細胞、降血脂及血壓及消除氧負離子自由基等，已廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、食品及藥品等多個領(lǐng)域[1-2]。殼寡糖分子中含有大量-NH2和-OH，可與多種金屬離子發(fā)生配合反應(yīng)，形成殼寡糖-金屬配合物，從而增強了殼寡糖原有特性或形成了新的生物功能，如制備的殼寡糖-鋅配合物具有促進動物大腦發(fā)育功能[3]、殼寡糖-稀土元素配合物可有效脫除貝類體內(nèi)重金屬元素[4]、殼寡糖-鑭配合物的抑菌活性顯著增強[5]等。

關(guān)于殼寡糖鋅配合物研究，Webster等[6]在均相反應(yīng)條件下，合成了殼寡糖鋅配合物，并優(yōu)化了配合物的合成條件，發(fā)現(xiàn)COS分子中中的-NH2和-OH參與了配位反應(yīng)。唐曉琳等[7]探索了殼寡糖鋅對雌性昆明小鼠生長和繁殖性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該配合物顯著提高了親代和子代小鼠的生長發(fā)育和部分器官指數(shù)的各項指標，并降低了小鼠體內(nèi)甘油三酯和膽固醇的含量。Higazy等[8]以殼聚糖（160 000 Da）為原料，制備了殼聚糖鋅配合物，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制活性。

目前，殼聚糖及殼寡糖的抑菌活性作用已被證實[9-10]，但殼寡糖與金屬元素形成配合物的抑菌活性強弱、是否優(yōu)于單純殼寡糖的抑菌效果等問題，國內(nèi)外還鮮有報道。課題組前期發(fā)現(xiàn)，以分子量范圍500 Da～1 000 Da的殼寡糖為配體制備的殼寡糖鋅配合物，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性較好，且顯著優(yōu)于同濃度的殼寡糖處理效果。因此，本試驗進一步優(yōu)化其制備條件，以期獲得具有最佳抑菌活性的殼寡糖鋅配合物制備方法，為海洋糖類資源的功能開發(fā)與實際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（E.coli，ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（S.Aureus，ATCC 25925):中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；殼寡糖（記為 COS，食品級，500 Da～1 000 Da):山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司；ZnCl2、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸：國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1000冷凍干燥機：日本東京理化器械株式會社；AA-6200原子吸收分光光度計：日本島津公司；SHAB恒溫水浴振蕩器：常州國華有限公司；HS-1300超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MDF-U53V超低溫冰箱：日本SANYO公司；Di RECT-Q超純水裝置：美國MILLIPORE公司。

1.3 COS-Zn2+配合物制備

取適量COS、ZnCl2溶于呈有50 mL蒸餾水的三角瓶中，充分溶解、混合均勻；采用HCl或NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，然后置于一定溫度下的恒溫水浴振蕩器中，反應(yīng)一定時間后取出；向混合體系中加入3倍體積的無水乙醇，醇沉離心后獲得產(chǎn)物；經(jīng)透析去除游離Zn2+后，進行真空冷凍干燥，獲得制備COS-Zn2+配合物。

1.3.1 單因素試驗

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制活性為評價指標，在COS-Zn2+配合物制備過程中，分別考察COS與ZnCl2之間的配比、體系pH值、反應(yīng)時間、體系溫度對制備配合物抑菌活性的影響。

1）COS與ZnCl2配比的影響：混合體系pH值為5，反應(yīng)時間為1 h，反應(yīng)體系溫度為30℃，考察COS與 ZnCl2配比分別為 1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（質(zhì)量比）時，對制備配合物抑菌活性的影響情況。

2）制備體系pH值的影響：COS與ZnCl2比例為2∶1（質(zhì)量比），反應(yīng)時間為1 h，反應(yīng)體系溫度30℃，考察體系pH值分別為2、3、4、5、6時，對制備配合物抑菌活性的影響情況。

3）反應(yīng)時間的影響：COS 與 ZnCl2比例為 2∶1（質(zhì)量比），混合體系pH值為5，反應(yīng)體系溫度為30℃，考察反應(yīng)時間分別為1、2、3、4、5 h時，對制備配合物抑菌活性的影響情況。

4）制備體系溫度的影響：COS與ZnCl2比例為2∶1（質(zhì)量比），混合體系 pH 值為 5，反應(yīng)時間為 1 h，考察體系溫度分別為 25、35、45、55、65 ℃時，對制備配合物抑菌活性的影響情況。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，以COS與ZnCl2配比、制備體系pH值、反應(yīng)時間、制備體系溫度4個因素，以配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制活性為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗。

1.4 COS-Zn2+配合物抑菌活性

首先將COS-Zn2+配合物配成所需藥液，放置一邊備用。在紫外超凈臺進行倒平板，然后將已活化處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別均勻涂布在已滅菌冷凝的營養(yǎng)瓊脂表面，然后將牛津杯小心放置于培養(yǎng)基上面。稍等片刻，用移液器槍取200 μL藥液注入牛津杯中，然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入微生物專用的培養(yǎng)箱。經(jīng)過12 h生長測量與記錄相應(yīng)抑菌圈的直徑長度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 origin 8.0、SPSS、Design Expert 8.0 進行處理，試驗數(shù)據(jù)均為3次平行試驗的平均值，結(jié)果表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果及分析

2.1.1 COS與ZnCl2配比對COS-Zn2+抑菌活性的影響

COS與ZnCl2配比對制備配合物抑菌活性的影響情況，如圖1所示。

圖1 COS與ZnCl2配比對COS-Zn2+抑菌活性的影響Fig.1 Effect of the ratio of COS to ZnCl2on antibacterial activity of COS-Zn2+

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著COS與ZnCl2比例的逐漸升高，制備配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制活性逐漸提高；在二者比例 1∶1（質(zhì)量比）時，COS-Zn2+配合物抑菌活性達到最高值；當糖鹽比例繼續(xù)增大時，COSZn2+配合物的抑菌效果呈現(xiàn)較快速的下降趨勢。有研究表明，殼聚糖與金屬離子Cu2+相互作用，可能以“橋”的方式連接同一或不同糖分子（2∶1），或以離子“懸掛”的方式與糖分子結(jié)合（1∶1）而形成配合物[11-12]，即殼聚（寡）糖與二價金屬離子間以多種配位模式發(fā)生結(jié)合。本試驗發(fā)現(xiàn)，COS-Zn2+當體系中Zn2+離子濃度降低時，制備COS-Zn2+抑菌活性顯著降低，可見Zn2+離子數(shù)量在配合物抑菌活性中影響較大，即COS與Zn2+形成配合物的抑菌活性，可能與配合物內(nèi)部氫鍵、原子空間分布、配位比例等因素密切相關(guān)[13]。

2.1.2 反應(yīng)體系pH值對COS-Zn2+抑菌活性的影響

體系pH值對COS-Zn2+抑菌活性的影響見圖2。

由圖2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值在2～5范圍內(nèi)時，制備COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌的抑制活性變化相對較為平緩，但仍呈逐步升高的趨勢；而對于大腸桿菌的抑制活性，變化相對較大。當體系pH值為5時，COSZn2+對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制活性均達到最大值。在酸性環(huán)境中，COS中氨基（-NH2）容易被質(zhì)子化，致使對Zn2+的配合能力減弱；當pH值升高時（＞5），在反應(yīng)體系中Zn2+容易析出，生成白色絮狀沉淀，也可能降低了COS-Zn2+的形成數(shù)量及相關(guān)的抑菌活性[12-14]。也有研究指出，在pH值接近中性的溶液體系中，殼寡糖中活性基團更易結(jié)合金屬離子，其反應(yīng)機制主要為配位作用[13]。因此，反應(yīng)體系pH值可能影響COS和Zn2+之間結(jié)合關(guān)系，從而改變了COS-Zn2+的抑菌效果。此外，本試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌的抑制效果，明顯優(yōu)于對大腸桿菌的抑制效果。

圖2 體系pH值對COS-Zn2+抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on the antibacterial activity of COS-Zn2+

2.1.3 反應(yīng)時間對COS-Zn2+抑菌活性的影響

反應(yīng)時間對COS-Zn2+抑菌活性的影響較大，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)時間對COS-Zn2+配合物抑菌活性的影響Fig.3 Effect of time on antibacterial activity of COS-Zn2+

在0～2 h范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，COS-Zn2+的抑菌活性增加；反應(yīng)時間為2 h時，COS-Zn2+的抑菌活性達到峰值；隨著反應(yīng)時間繼續(xù)增加，COS-Zn2+的抑菌活性反而逐漸降低，可能是由于制備時間達到一定程度時，形成COS-Zn2+配合物的數(shù)量已經(jīng)飽和，繼續(xù)延長反應(yīng)時間可能會導致COS-Zn2+本身結(jié)構(gòu)的破壞或影響其配合穩(wěn)定性[15]，而致使COS-Zn2+抑菌活性有所降低。

2.1.4 反應(yīng)溫度對COS-Zn2+抑菌活性的影響

溫度對COS-Zn2+抑菌活性的影響見圖4。

圖4 溫度對COS-Zn2+抑菌活性的影響Fig.4 Effect of temperature on antibacterial activity of COS-Zn2+

由圖4結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度在25℃～45℃范圍內(nèi)，COS-Zn2+的抑菌活性隨反應(yīng)溫度上升而逐漸增大；反應(yīng)溫度在45℃左右時，COS-Zn2+表現(xiàn)出最優(yōu)的抑菌效果；溫度繼續(xù)上升（＞45℃），COS-Zn2+對兩種菌的抑制效果均有不同程度的降低。本試驗中COS-Zn2+抑菌活性的變化，其原因可能是由于適當提高反應(yīng)溫度有利于增加反應(yīng)體系的動能，從而提高了COS和Zn2+之間的反應(yīng)效率；而當溫度過高時，COS上活性基團或特定化學鍵發(fā)生變化[6]，從而影響其本身及配合物的抑菌活性。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

2.2.1 因素選取及設(shè)計

綜合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，試驗因素和水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計各因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface design

2.2.2 COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌抑制活性的響應(yīng)面分析

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

金黃色葡萄球菌響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果（金黃色葡萄球菌）Table 2 Experimental design and results for response surface analysis（S.aureus）

使用Design-Expert 8對表格數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑Y(jié)1對以上4個因素的二次多項回歸模型方程為：

對該模型進行方差分析，結(jié)果如表3。

表3 二次回歸方程模型的方差分析（金黃色葡萄球菌）Table 3 Variance analysis for response surface quadratic model（S.aureus）

續(xù)表3 二次回歸方程模型的方差分析（金黃色葡萄球菌）Continue table 3 Variance analysis for response surface quadratic model（S.aureus）

由表3可知，模型達到極顯著程度（P＜0.01），表明此模型與試驗數(shù)據(jù)具有較高的吻合度。失擬項P值為0.127 3＞0.05，P值不顯著表明回歸方程擬合度較高?；貧w決定系數(shù)R2=0.931 0，變異系數(shù)為1.79%，表明該模型試驗誤差較小，具有較好的可行度。因此，可使用該模型用于研究具有抑制金黃色葡萄球菌活性的COS-Zn2+配合物制備的最優(yōu)工藝。

2.2.2.2 響應(yīng)面法作圖分析結(jié)果

兩因素交互作用對金黃色葡萄球菌抑制作用的響應(yīng)面圖見圖5。

結(jié)果表明，交互項 AD 顯著，C、A2、B2、C2、D2在該模型中為極顯著變量，說明各個因素與對金黃色葡萄球菌的抑制效果不是簡單的線性關(guān)系。各因素對金黃色葡萄球菌抑制效果的影響為：糖鹽比例＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間＞pH值。由圖5結(jié)果可知，隨著pH值和反應(yīng)時間的變化，COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌的抑制效果，呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢；當糖鹽比例在1∶1（質(zhì)量比）以上時，COS-Zn2+抑菌效果減低較為明顯；隨著反應(yīng)溫度和pH值的升高，COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，呈現(xiàn)先上升后下降趨勢；隨反應(yīng)溫度增加，對金黃色葡萄球菌抑制效果，表現(xiàn)為明顯的先上升后下降趨勢。

圖5 兩因素交互作用對金黃色葡萄球菌抑制作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of two factors interactive effects on inhibition of S.aureus

2.2.2.3 最佳參數(shù)確定與驗證試驗

利用Design-Expert軟件，計算得到具有最佳抑菌活性的COS-Zn2+配合物制備工藝參數(shù)：pH 4.81，反應(yīng)時間 1.67 h，糖鹽比 1.05∶1（質(zhì)量比），反應(yīng)溫度 44.48℃，預測對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為33.27 mm。結(jié)合實際情況，將制備條件優(yōu)化為pH 5，反應(yīng)時間2 h，糖鹽比1∶1（質(zhì)量比），反應(yīng)溫度45℃，在此條件下作驗證試驗，3組平行試驗取平均值。實際測得抑菌圈直徑為33.08 mm，相對誤差為0.19 mm，說明預測值與實測值比較相符，響應(yīng)面優(yōu)化獲得數(shù)據(jù)結(jié)果有一定借鑒價值。

2.2.3 COS-Zn2+配合物對大腸桿菌抑制活性的響應(yīng)面分析

2.2.3.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

大腸桿菌響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果（大腸桿菌）Table 4 Experimental design and results for response surface analysis（E.coli）

使用Design-Expert 8對表格數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到對大腸桿菌抑菌圈直徑Y(jié)2對以上4個因素的二次多項回歸模型方程為：

對該模型進行方差分析，結(jié)果如表5。

表5 二次回歸方程模型的方差分析（大腸桿菌）Table 5 Variance analysis for response surface quadratic model（E.coli）

由表5可知，模型達到極顯著程度（P＜0.01），表明此模型與試驗數(shù)據(jù)具有較高的吻合度。失擬項P值為0.321 2＞0.05不顯著，P值不顯著表明回歸方程擬合度較高?；貧w決定系數(shù)R2=0.943 2，變異系數(shù)為2.13%，說明該模型試驗誤差較小。因此，可以用該模型用于研究具有抑制大腸桿菌活性的COS-Zn2+配合物制備的最優(yōu)工藝。

2.2.3.2 響應(yīng)面法作圖分析結(jié)果

兩因素交互作用對大腸桿菌抑制作用的響應(yīng)面圖見圖6。

根據(jù)已知的二次多項回歸方程，分別繪制響應(yīng)面曲面圖，模型中 C、D、A2、B2、C2、D2極顯著，B 顯著，AD交互作用顯著，說明各個因素與對大腸桿菌抑制效果不是簡單的線性關(guān)系。各因素對大腸桿菌抑制效果的影響為：糖鹽比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間＞pH值。由圖6結(jié)果可知，COS-Zn2+對大腸桿菌的抑菌效果，隨著pH值的上升和反應(yīng)時間延長，表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢；隨著pH值和糖鹽比例的增加，抑菌圈直徑的大小先上升后下降，其中糖鹽比例影響抑菌活性的下降過程相對較明顯；反應(yīng)溫度對抑菌效果的影響顯著，反應(yīng)溫度低于45℃后，抑菌活性開始下降；隨糖鹽比例的增加和反應(yīng)時間的延長，抑菌圈直徑的大小，呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

2.2.3.3 最佳參數(shù)確定與驗證試驗

利用Design-Expert軟件，計算得到具有最佳抑菌活性的COS-Zn2+配合物制備工藝參數(shù)：pH值5.15，反應(yīng)時間為1.84 h，糖鹽比1.09∶1（質(zhì)量比），反應(yīng)溫度45.92℃，預測對大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為32.43 mm。結(jié)合實際情況，將制備條件優(yōu)化為pH值5，反應(yīng)時間 2 h，糖鹽比 1∶1（質(zhì)量比），反應(yīng)溫度 45 ℃。在此參數(shù)下作驗證試驗，3組平行試驗取平均值。實際測得抑菌圈直徑為32.23 mm，相對誤差為0.20 mm，說明預測值與實測值比較相符，響應(yīng)面優(yōu)化得到的數(shù)據(jù)結(jié)果有一定借鑒價值。

圖6 兩因素交互作用對大腸桿菌抑制作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of two factors interactive effects on inhibition of E.coli

3 結(jié)論

利用單因素試驗、中心組合Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，以對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑制活性為目標，對殼寡糖鋅（COS-Zn2+）配合物的制備工藝進行了研究，獲得最佳制備參數(shù)為：pH值5，反應(yīng)時間2 h，糖鹽比例1∶1（質(zhì)量比），反應(yīng)溫度45℃。在此參數(shù)條件下，制備COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑為33.08 mm和32.23 mm，該結(jié)果與建立模型的預測值基本相符。后續(xù)將對COS-Zn2+對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌機制開展深入研究。

[1]XIA W S,LIU P,ZHANG J L,et al.Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides[J].Food Hydrocolloids,2011,25(2):170-179

[2]LOGITHKUMAR R,KESHAVNARAYAN A,DHivya S,et al.A review of chitosan and its derivatives in bone tissue engineering[J].Carbohydrate Polymers,2016,151(20):172-188

[3]丁琳琳.殼寡糖螯合鋅對小鼠學習記憶能力的影響比較研究[D].大連:遼寧師范大學,2013

[4]黃國清,李志茹,朱常龍,等.殼寡糖-金屬配合物對太平洋牡蠣體內(nèi)中Cd脫除效果的研究[J].中國食品學報,2012,12(4):121-126

[5]馮小強,李小芳,楊聲.殼寡糖鑭配合物的抑菌活性及其與牛血清白蛋白的相互作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(8):1022-1026

[6]WEBSTER A,HALLING M D,Grant D M.Metal complexation of chitosan and its glutaraldehyde cross-linked derivative[J].Carbohydrate Research,2007,342(9):1189-1201

[7]唐曉琳,丁琳琳,楊洋,等.殼寡糖螯合鋅對雌性昆明小鼠生長和繁殖性能的影響[J].營養(yǎng)學報,2013,35(3):262-267

[8]HIGAZY A,HASHEM M,ELSHAFEI A,et al.Development of antimicrobial jute packaging using chitosan and chitosan-metal complex[J].Carbohydrate Polymers,2010,79(4):867-874

[9]SUN T,QIN Y,XU H,et al.Antibacterial activities and preservative effect of chitosan oligosaccharide Maillard reaction products on Penaeus vannamei[J].International Journal of Biological Macromolec-ules,2017,105(1):764-768

[10]COSTA E M,SILVA S,VEIGA M,et al.Investigation of chitosan’s antibacterial activity against vancomycin resistant microorganisms and their biofilms[J].Carbohydrate Polymers,2017,174:369-376

[11]BRAIER N C,JISHI R A.Density functional studies of Cu2+and Ni2+binding to chitosan[J].Journal of Molecular Structure:Theochem,2000,499(1/3):51-55

[12]WANG A,SHAO S,ZHOU J,et al.Synthesis and characterization of chiotan-Cu complexes[J].Acta Polymerica Sinica,2000,275(15):11222-11228

[13]蔡健.殼聚糖及其衍生物與鋅配合物的合成及研究[D].西安:西北大學,2003

[14]田金花,楊華,遲光偉,等.殼寡糖鋅(Ⅱ)配合物的合成與結(jié)構(gòu)表征[J].高分子通報,2011(1):71-74

[15]VARMA A J,DESHPANDE S V,KENNEDY J F.Metal complexation by chitosan and its derivatives:a review[J].Carbohydrate Polymers,2004,55(1):77-93