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    襄麥冬多糖提取物體外抗氧化活性的光譜學(xué)分析

    2018-03-24 03:01:00潘婉蓮楊佳娣葉國(guó)棟趙苗余海忠
    食品研究與開發(fā) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:麥冬清除率提取物

    潘婉蓮,楊佳娣,葉國(guó)棟,趙苗,余海忠

    (湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院,湖北襄陽441053)

    襄麥冬(Liriope spicata var.prolifera),即湖北麥冬,又叫麥門冬,味甘、微苦,性微寒,常用于治療肺燥干咳、虛勞咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘、咽白喉等癥[1]。襄陽歐廟被譽(yù)為中國(guó)麥冬之鄉(xiāng),位居中國(guó)三大麥冬產(chǎn)地之首,單產(chǎn)高于川、杭麥冬,品質(zhì)優(yōu),具有“白、干、凈、勻、大”的特點(diǎn)。麥冬多糖是動(dòng)物體中降血糖最主要的有效成分,可降低正常小鼠的血糖,同時(shí)對(duì)葡萄糖、腎上腺素、四氧嘧啶所導(dǎo)致的小鼠高血糖有明顯的抑制作用[2]。已有學(xué)者完成了川麥冬、杭麥冬多糖的抗氧化性測(cè)試[3-5],但是鮮見關(guān)于襄麥冬多糖提取物抗氧化能力的報(bào)道。本研究采用α-脫氧核糖法、鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、ABTS法、亞油酸體系法及鐵氰化鉀還原法等方法,利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)襄麥冬多糖提取物的體外抗氧化活性及還原能力進(jìn)行評(píng)價(jià),以期能為新的天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論支持,也為襄麥冬多糖的綜合利用提供一種新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    襄麥冬塊根:采自湖北襄陽歐廟襄麥冬GAP基地。

    1.2 儀器

    UV-2500紫外-可見光分光光度計(jì):日本島津公司;JA5003B型電子分析天平:上海越平科學(xué)儀器有限公司;3K15型小型冷凍高速離心機(jī):德國(guó)Sigma公司;Finnpipette移液槍:美國(guó)熱電公司;FZ-102微型植物粉碎機(jī):天津泰斯特公司;KH3200DB超聲波清洗器:昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;DKB-501A超級(jí)恒溫水槽:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;G-1磁力攪拌器:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;GZX-9030-MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

    1.3 試劑

    DPPH:美國(guó) Sigma公司;乙醚、FeSO4、EDTA、α-脫氧核糖、磷酸、H2O2、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、Tris-HCl、鄰苯三酚、HCl、亞油酸、鎢酸鈉、甲醇、Tween-20、鐵氰化鉀:上海國(guó)藥(集團(tuán))公司;生育酚:購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    1.4 襄麥冬多糖提取物的制備

    將新鮮襄麥冬塊根洗凈瀝干后60℃烘干至恒重,粉碎。稱取100 g樣品于燒杯中,加入4倍體積95%乙醇,攪拌,過濾,如此重復(fù)操作3次,使其充分脫脂,濾渣放入烘箱中烘干。然后,稱取脫脂烘干后的樣品80 g,按料液比1∶10(g/mL)加蒸餾水,80℃恒溫水浴磁力攪拌2 h,提取2次,合并兩次提取液進(jìn)行離心,取上清液置透析袋中透析48 h后減壓濃縮得浸膏,再用4倍體積95%乙醇對(duì)浸膏進(jìn)行醇沉,產(chǎn)物依次經(jīng)過無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后,真空干燥,獲得襄麥冬多糖提取物[6]。制備的提取物分別用甲醇或乙醇梯度稀釋成 6.25、12.5、25、50、100、150、200 mg/mL 樣品溶液,備用。

    1.5 襄麥冬多糖提取物體外抗氧化活性測(cè)定

    1.5.1 對(duì)·OH清除活性的測(cè)定

    采用α-脫氧核糖法[7],準(zhǔn)確移取0.20 mL的FeSO4-EDTA混合液(10 mmol/L)于具塞試管中,加入 0.20 mL α-脫氧核糖溶液(10 mmol/L),然后各管再依次加入1 mL不同濃度的樣品溶液、0.4 mL磷酸緩沖液(pH7.4,0.1mol/L)以及0.2mLH2O2(10mmol/L),混勻后將具塞試管置于37℃水浴恒溫保持1 h;然后再加入1mL2.8%(質(zhì)量比)三氯乙酸溶液和1.0mL 1.0%(質(zhì)量比)硫代巴比妥酸溶液,迅速搖勻置沸水浴中加熱10 min,冷水冷卻后在532 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)S。不加襄麥冬多糖提取物,同上操作處理,測(cè)定其對(duì)比吸光值A(chǔ)C。不加襄麥冬多糖提取物且不在37℃水浴中反應(yīng),其它處理同上,測(cè)定空白吸光值A(chǔ)0,每個(gè)樣品重復(fù)3次,按下式計(jì)算清除率:

    1.5.2 對(duì)·O2-清除活性的測(cè)定

    采用鄰苯三酚自氧化法[8],移取pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于具塞試管中,放入25℃水浴20 min,然后在各管分別加入0.4 mL不同濃度的樣品溶液和0.1 mL 25℃保溫的鄰苯三酚溶液,混勻,25℃下準(zhǔn)確反應(yīng)4min,立即用10 mol/L HCl溶液2滴終止反應(yīng),在325 nm處測(cè)定吸光值。對(duì)照品以蒸餾水代替糖液,緩沖液加蒸餾水作為空白,每個(gè)樣品重復(fù)3次,按下式計(jì)算清除率:

    1.5.3 對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定

    采用DPPH法[9],移取3.9 mL DPPH甲醇溶液(25 mg/mL)于不同的具塞試管中,分別加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液,混勻后,將試管放入暗處反應(yīng)0.5 h后立刻取出,在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值A(chǔ),空白用甲醇代替樣品測(cè)得空白吸光值為A0,其它方法都一樣。每個(gè)樣品重復(fù)3次,按下式計(jì)算清除率:清除率/%=[(A0-A)/A0]×100。

    1.5.4 對(duì)ABTS自由基清除活性的測(cè)定

    采用ABTS法[10],移取7.4 mmol/L的ABTS溶液0.2 mL,加入2.6 mmol/L K2S2O8溶液 0.2 mL,混勻,在室溫條件下放入黑暗區(qū)域12 h,再用95%的乙醇稀釋40倍,此時(shí)在734 nm處測(cè)得吸光度值為0.7±0.02即可。取不同的具塞試管,分別加入0.8 mL上述溶液和0.2 mL不同濃度的樣品溶液,劇烈振搖10s,靜置6min后,立刻在734nm處測(cè)得其吸光值A(chǔ)S??瞻子靡掖即鏈y(cè)得吸光值為A0,每個(gè)樣品重復(fù)3次,按下式計(jì)算清除率:清除率/%=(1-AS/A0)×100。

    1.5.5 抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定

    采用亞油酸體系法[11],稱取0.29 g亞油酸和0.29 g Tween-20,再加50 mL 0.2 mol/L pH=7.5的KH2PO4-NaOH緩沖溶液。吸取不同濃度的樣品溶液,移入試管中,加2 mL樣油,37℃恒溫水浴15 h,加6 mL 60%(體積比)甲醇溶液終止反應(yīng),在234 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以空白作參比,每個(gè)樣品重復(fù)3次,按下式計(jì)算其抗氧化活性:抗氧化活性/%=[(A空白-A樣品)/A空白]×100。

    1.5.6 還原能力的測(cè)定

    采用鐵氰化鉀還原法[12],取不同濃度樣品溶液于具塞試管中,加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)及2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合,將混合好的溶液置50℃水浴保溫20 min,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻,靜置10 min后,用分光光度計(jì)于700 nm處測(cè)其吸光值。以吸光值大小表示還原能力大小,每個(gè)樣品重復(fù)3次,求其平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對(duì)·OH清除能力的測(cè)定結(jié)果

    Fenton反應(yīng)體系在催化劑作用下,過氧化物能產(chǎn)生兩種活潑的氫氧自由基,從而引發(fā)和傳播自由基鏈反應(yīng),加快有機(jī)物和還原性物質(zhì)的氧化,從而產(chǎn)生·OH。本研究考察在襄麥冬多糖提取物存在時(shí),·OH對(duì)α-脫氧核糖分子的氧化、破壞情況,從而來確定麥冬多糖對(duì)·OH的清除活性,結(jié)果見圖1。

    由圖1可以看出,襄麥冬塊根多糖溶液對(duì)羥自由基的清除活性,隨著其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng),在濃度達(dá)到100 mg/mL之前,清除率保持較大的增幅,此后,盡管隨濃度的增大而清除率繼續(xù)增強(qiáng),但是增幅明顯降低,清除活性維持在51%左右。而陽性對(duì)照生育酚的清除率,從50 mg/mL濃度開始,增幅顯著減小,總體上清除率維持在80%左右。

    圖1 襄麥冬多糖提取物的體外清除羥基自由基的能力Fig.1 In vitro scavenging hydroxyl radical ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

    2.2 對(duì)·O2-清除能力的測(cè)定結(jié)果

    在堿性條件下(pH8.2)鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成超氧陰離子自由基(·O2-)和中間產(chǎn)物,該中間產(chǎn)物在325 nm處有一特征吸收峰。當(dāng)加入自由基清除劑時(shí),·O2-的生成會(huì)受到抑制作用,自氧化過程也會(huì)受阻,中間產(chǎn)物生成減少,在325 nm處的吸收減弱。因此,可以通過測(cè)定A325的變化來評(píng)價(jià)襄麥冬多糖提取物對(duì)·O2-的清除能力,不同濃度的樣品溶液清除結(jié)果見圖2。

    圖2 襄麥冬多糖提取物的體外清除·O2-的能力Fig.2 In vitro scavenging·O2-of L.spicata var prolifera polysaccharide

    由圖2可知,不同濃度的襄麥冬多糖提取物與生育酚均對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)有一定的抑制作用,即對(duì)·O2-有一定的清除能力,隨著多糖濃度的增加,二者清除自由基的能力也逐漸增加,且清除率保持著類似的上升趨勢(shì)。但是,總體上來看,襄麥冬多糖對(duì)·O2-的清除活性并不是太強(qiáng),其清除率也僅維持在20%,遠(yuǎn)低于同濃度的生育酚的52%左右。

    2.3 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

    DPPH被甲醇溶解后形成一種穩(wěn)定以氮為中心的質(zhì)子的自由基(DPPH·),甲醇溶液呈紫紅色,在515 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH·的孤對(duì)電子配對(duì),而使其顏色消退,在最大吸收波長(zhǎng)處減弱,其中褪色程度與其接受的電子呈定量的一種關(guān)系。這種顏色變淺的狀況與配對(duì)電子數(shù)呈定量的關(guān)系可用于評(píng)價(jià)DPPH·的清除情況。不同濃度的襄麥冬多糖提取物清除DPPH·的活性測(cè)試結(jié)果見圖3。

    圖3 襄麥冬多糖提取物的體外清除DPPH自由基能力Fig.3 In vitro scavenging DPPH radical ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

    從圖3可以看出,襄麥冬多糖提取物體外清除DPPH·的活性較強(qiáng),隨著濃度的增加其清除DPPH自由基的能力也在逐漸增強(qiáng),并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,在濃度達(dá)到100 mg/mL之后,其清除率總體維持在59%左右,這表明襄麥冬多糖提取物對(duì)DPPH自由基有比較好的清除能力。同時(shí),由圖3還可發(fā)現(xiàn),在濃度達(dá)到25 mg/mL之前,低濃度的樣品溶液其清除DPPH自由基的活性,要高于同濃度的生育酚。

    2.4 對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

    ABTS溶液在合適的氧化劑的作用下,會(huì)自動(dòng)氧化成綠色的ABTS溶液,在734 nm處可以測(cè)定其吸光度。但是在抗氧化劑存在的情況下,ABTS自由基的產(chǎn)生會(huì)被抑制,溶液的顏色會(huì)變淺。因此,通過測(cè)定ABTS自由基在734 nm處的吸光度變化,即可測(cè)定出樣品的總抗氧化活性大小。

    襄麥冬多糖不同濃度的提取物體外清除ABTS自由基的測(cè)定結(jié)果見圖4,由圖4可知,隨著提取物濃度的增大其清除ABTS自由基的能力越強(qiáng),并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系:在供試溶液濃度達(dá)到100 mg/mL之前,不論是標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品,其清除率的增幅隨濃度的增大而增加。此后,盡管二者清除率依然會(huì)隨濃度的增大而繼續(xù)增加,但是增幅急劇減小,二者對(duì)ABTS自由基的清除活性維持在50%和80%左右。

    圖4 襄麥冬多糖提取物的體外清除ABTS自由基的能力Fig.4 In vitro scavenging ABTS radical ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

    2.5 抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定結(jié)果

    脂質(zhì)的自動(dòng)氧化也稱脂質(zhì)的過氧化作用。脂質(zhì)的過氧化一般定義為多不飽和脂肪酸或脂質(zhì)的氧化變質(zhì)。若糖類物質(zhì)含量較高的情況下也會(huì)抑制脂質(zhì)的氧化,襄麥冬多糖提取物的體外抗脂質(zhì)過氧化活性見圖5。

    圖5 襄麥冬多糖提取物的體外抗脂質(zhì)過氧化活性Fig.5 In vitro anti lipid peroxidation activity of L.spicata var prolifera polysaccharide

    由圖5可知,襄麥冬多糖提取物能明顯的抑制亞油酸的自氧化,同生育酚相比,雖然低濃度的多糖對(duì)亞油酸的抑制作用偏低,但隨其濃度加大,其抑制脂質(zhì)過氧化活性越強(qiáng),且抑制增幅接近于生育酚的趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/mL之后,襄麥冬多糖提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率保持在55%左右,顯示出較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化特性。

    2.6 還原能力的測(cè)定結(jié)果

    三價(jià)鐵離子具有氧化性,還原糖可將其氧化。若反應(yīng)體系中存在有還原性物質(zhì)時(shí),鐵氰化鉀會(huì)被還原成亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng),生成普魯士藍(lán),在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。故吸光值越大,表示待測(cè)還原性物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)。

    抗氧化劑清除自由基的機(jī)理是通過自身的還原作用給出電子來清除的,一般來說,吸光值越大,還原能力就越強(qiáng),其抗氧化性就越好,襄麥冬多糖提取物的體外還原能力見圖6。

    圖6 襄麥冬多糖提取物的體外還原能力Fig.6 In vitro reduction ability of L.spicata var prolifera polysaccharide

    由圖6可以看出,隨著襄麥冬多糖提取物濃度的增大,處理后的樣品溶液其吸光值也逐漸增大,即對(duì)鐵氰化鉀的還原能力也增強(qiáng),當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/mL之后,其吸光值增幅顯著減小,數(shù)值逐漸維持在0.073上下,這表明盡管濃度在不斷增大,但是襄麥冬多糖的還原能力趨于穩(wěn)定。

    3 小結(jié)與討論

    目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于麥冬多糖的抗氧化活性報(bào)道,幾乎全部集中在麥冬Ophiopogon jaonicus上,鮮見襄麥冬Liriope spicata var.prolifera的。本文采用α-脫氧核糖法、鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、亞油酸體系法、ABTS法以及鐵氰化鉀還原法等方法,對(duì)產(chǎn)自湖北襄陽的道地藥材——襄麥冬多糖提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,襄麥冬多糖的清除自由基活性與其提取物的濃度呈線性關(guān)系,濃度越高,其清除自由基能力和還原能力就越強(qiáng)。除了對(duì)超氧陰離子的清除率僅為20%之外,麥冬多糖對(duì)其它自由基的清除率都超過50%,尤其對(duì)DPPH自由基最高,維持在59%左右。同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn),襄麥冬多糖提取物對(duì)鐵氰化鉀的還原能力以及抗脂質(zhì)過氧化活性,均是隨著多糖質(zhì)量濃度的增高而增強(qiáng)。

    嚴(yán)碧歌采用超聲波處理提取川麥冬多糖,發(fā)現(xiàn)雖然不會(huì)影響多糖的單糖組成,但是會(huì)改變多糖的微觀結(jié)構(gòu),提高多糖的抗氧化活性[13]。趙凱的報(bào)道則顯示,經(jīng)超聲波處理所得麥冬多糖,除超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用喪失外,其它抗氧化活性均得到提高[14]。研究還發(fā)現(xiàn),超聲功率對(duì)麥冬多糖的抗氧化活性具有顯著影響:隨著超聲功率的增大,麥冬多糖的抗氧化活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì),且超聲功率為400 W時(shí)其抗氧化活性最高[15]。王艷翠[16]對(duì)麥冬體外抗氧化測(cè)試結(jié)果顯示麥冬的氯仿/甲醇提取物和正丁醇萃取物具有較好的抗氧化活性,而粗多糖的抗氧化活性較低。李明[17]研究發(fā)現(xiàn)麥冬多糖可提高長(zhǎng)期負(fù)荷訓(xùn)練大鼠的免疫功能,抑制過氧化損傷和糖原的耗竭,具有良好的開發(fā)前景。張力妮[18]測(cè)試了經(jīng)過硫酸化、磷酸化以及羧甲基化修飾的8種麥冬多糖的體外抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)它們均具有一定的抗氧化活性,尤其對(duì)于DPPH自由基,清除率最高可達(dá)70%。陳剛[19]實(shí)驗(yàn)證明具有很好的吸濕保濕性能,具有很好的還原能力,為麥冬多糖開發(fā)成保健品或化妝品提供了一定的理論依據(jù)。張婭芳的實(shí)驗(yàn)表明6種麥冬多糖均具有體外抗氧化活性,且呈劑量依賴關(guān)系,其中POJ-SS體外抗氧化性最強(qiáng),她推測(cè)這可能與其具有β-(1,3)鍵合的葡聚糖骨架有關(guān)系[20]。

    襄麥冬是一種藥食兩用植物,目前已開發(fā)出麥冬酒、麥冬茶、麥冬酸奶等產(chǎn)品,本文對(duì)其多糖展開的抗氧化性研究,將非常有助于襄麥冬資源的綜合利用,尤其是為植物性天然食品抗氧化劑的開發(fā),提供了一種新的思路。

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