基于環(huán)境DNA 宏條形碼的紅楓湖魚類多樣性研究

許龍飛，姚鄧雕，郭星辰，楊原偉，李君軼，姜海波，安苗，邵儉

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430223；3.貴州大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025）

魚類是水生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成之一[1]，常被作為評(píng)判水域環(huán)境健康的指示生物，其物種多樣性和種群穩(wěn)定完整是水生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[2]，因此，科學(xué)監(jiān)測(cè)水域環(huán)境魚類多樣性是維護(hù)區(qū)域水生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要舉措[3,4]。目前，魚類多樣性監(jiān)測(cè)主要依靠傳統(tǒng)捕撈、水聲學(xué)等技術(shù)手段。傳統(tǒng)捕撈需進(jìn)行長(zhǎng)期樣品收集，調(diào)查結(jié)果準(zhǔn)確度受投入人力和資源限制和鑒定人員主觀判斷影響。水聲學(xué)監(jiān)測(cè)可快速得到監(jiān)測(cè)水域魚類組成及空間分布，但該技術(shù)對(duì)魚類物種識(shí)別應(yīng)用較少，大部分魚類暫不能通過該技術(shù)識(shí)別[5]。環(huán)境DNA（environmental DNA,eDNA）技術(shù)為水生生物監(jiān)測(cè)提供了一種新手段，可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)魚類監(jiān)測(cè)和水聲學(xué)等技術(shù)的不足，具有較大的應(yīng)用潛能[6，7]。

環(huán)境DNA（eDNA）通常來源于生物體掉落在環(huán)境中的皮膚碎屑、配子、黏液、糞便等[8]。通過提取環(huán)境樣品中的DNA，引物擴(kuò)增、高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析等對(duì)環(huán)境樣本中的物種序列進(jìn)行定性或定量分析。eDNA 技術(shù)最早應(yīng)用于監(jiān)測(cè)土壤微生物，F(xiàn)icetola 等[9]利用eDNA 技術(shù)成功在水環(huán)境中檢測(cè)到了美國(guó)牛蛙（Rana catesbeiana），隨后eDNA 技術(shù)快速運(yùn)用到了瀕危魚類監(jiān)測(cè)[10]、生物入侵魚類監(jiān)測(cè)[11]、魚類多樣性監(jiān)測(cè)等研究領(lǐng)域[12,13]。目前eDNA技術(shù)在國(guó)內(nèi)應(yīng)用水生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)用空間巨大，特別是特殊環(huán)境和時(shí)段的投入應(yīng)用，如保護(hù)區(qū)、禁漁區(qū)（期）、高原、溶巖洞穴等地區(qū)的水域具有明顯優(yōu)勢(shì)。

紅楓湖位于貴州省清鎮(zhèn)市，是貓?zhí)犹菁?jí)水電站攔河而成的人工水庫，為典型的喀斯特高原型深水湖。紅楓湖流域面積1 596 km2，蓄水量6.01 億m3，發(fā)揮生活、工農(nóng)業(yè)用水，維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等重要功能。在過去的幾十年間，人類活動(dòng)和自然因素破壞了紅楓湖水生態(tài)系統(tǒng)[14]，水體富營(yíng)養(yǎng)化，人工引種放流等使得紅楓湖魚類種群狀況更加復(fù)雜。因此，研究紅楓湖魚類組成及空間分布尤為迫切。該研究利用eDNA 宏條形碼技術(shù)調(diào)查紅楓湖魚類種群結(jié)構(gòu)、多樣性特征及湖魚類資源現(xiàn)狀，為其水生生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)資料，也檢驗(yàn)該技術(shù)在喀斯特高原水域魚類資源監(jiān)測(cè)方面的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和處理

根據(jù)喀斯特地貌和水域特征，將紅楓湖分為南、北湖區(qū)域，參考《淡水浮游生物調(diào)查技術(shù)規(guī)范（SC/T9402-2010）》設(shè)置6 個(gè)樣點(diǎn)，南湖：老將點(diǎn)兵S1、南湖中S2、取水口S3；北湖：花魚洞S4、大壩S5、北湖中S6（圖1）。2020 年11 月采集樣本，各樣點(diǎn)水體清洗采水器5 次以上，并靜置5 min 以上。用容量為5 L 的采水器分別在各樣點(diǎn)上（1 m）、中（5 m）、下層（10 m）各采集5 L 水樣后混合，各樣點(diǎn)留取2 L 水樣于收集瓶中，低溫避光保存，送至實(shí)驗(yàn)室后立即抽濾（確保24 h 內(nèi)完成）。使用隔膜真空泵和砂芯玻璃過濾裝置抽濾水樣，采用濾膜收集eDNA，濾膜材質(zhì)為混合纖維素酯，規(guī)格50 mm，孔徑0.45 μm。樣本抽濾時(shí)設(shè)空白對(duì)照1 個(gè)，即用同樣的濾膜，抽濾2 L ddH2O 檢測(cè)有無污染；抽濾完成后，將濾膜置于1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存。

1.2 eDNA 的提取、擴(kuò)增及測(cè)序

采用Omega 公司的Water DNA Kit D5525 試劑盒提取水體eDNA。選用Tele02 硬骨魚類通用引物擴(kuò)增[15]，引物序列如下：Tele02-F AAACTCGTGCCA GCCACC，Tele02-R GGGTATCTAATCCCAGTTTG，PCR 為25 μL反應(yīng)體系：5×反應(yīng)緩沖液5 μL，5×GC緩沖液5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μM）1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 8.75 μL。Q5 DNA 聚合酶0.25 μL 反應(yīng)參數(shù)；初始變性98 ℃2 min，變性98 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)，最終延伸72 ℃5 min，10 ℃保持。PCR（PCR 儀：ABI GeneAmp2720 型）產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后用Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

用Vsearch（v2.13.4）完成生物信息學(xué)分析。具體流程如下：Illumina 測(cè)序得到的原始序列根據(jù)barcode 篩選有效序列，再用cutadapt 切除序列的引物片段，拼接序列（fastq_mergepairs），質(zhì)量控制（fastq_filter），去除重復(fù)序列和嵌合體后獲得高質(zhì)量序列（derep_fulllength），按97%相似水平的序列聚類（cluster_size）后輸出OTU 表格，最后去除OTU 表格中的豐度為1 的OTU。文中稀疏曲線、物種累計(jì)曲線、熱圖、PCoA 圖、PERMANOVA 分析、韋恩圖使用R 語言以及genescloud 在線平臺(tái)繪制（https://www.genescloud.cn）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)篩選、過濾和拼接處理，共獲得818 602 條有效序列，按照97%相似性聚類后得到1 140 個(gè)代表性O(shè)TU 序列。由本次測(cè)序的魚類物種稀疏曲線可知（圖2），當(dāng)前測(cè)序深度足夠，可用于紅楓湖魚類多樣性分析。各樣點(diǎn)OTU 組成見圖3，6個(gè)樣本共有OTU 數(shù)量為28 個(gè)，S2 特有OTU 數(shù)量最多，為260 個(gè)，S6 特有OTU 數(shù)量最少，僅為2 個(gè)。

圖2 紅楓湖魚類物種稀疏曲線（基于Chao1 指數(shù)）Fig.2 The fish species rarefaction curve in Hongfeng Lake（based on Chao1 index）

圖3 紅楓湖各采樣點(diǎn)共有OTU 的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of the shared OTUs at each sampling site in Hongfeng Lake

2.2 紅楓湖魚類物種組成

經(jīng)序列比對(duì)，共鑒定出魚類28 種，隸屬于4目，13 個(gè)科，25 個(gè)屬，其中鱸形目13 種，約占46.43%，鯉形目11 種，約占39.29%，鮭形目2 種，占約7.14%，鯡形目2 種，約占7.14%。各樣點(diǎn)中S1、S5、S6 魚類組成較單一，S2、S3、S4 魚類組成豐富；S1、S3 有1 種魚類為該樣點(diǎn)獨(dú)有，S2 共有9 種獨(dú)有種，S4、S5、S6 均無獨(dú)有魚類（表1）。如紅楓湖屬水平分布熱圖所示（圖4），主要屬分別是梭鱸屬（Sander）、鱭屬（Coilia）、鱖屬（Siniperca）、烏塘鱧屬（Bostrychus）和鱸屬（Perca）。各樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)屬不同，S4、S5 和S6 優(yōu)勢(shì)屬為梭鱸屬，S1 和S3 優(yōu)勢(shì)屬為鱭屬，S2 優(yōu)勢(shì)屬為鱖屬。

表1 基于eDNA 技術(shù)調(diào)查的紅楓湖魚類名錄Tab.1 Fish list of Hongfeng Lake based on eDNA metabarcoding technology survey

圖4 紅楓湖魚類屬水平分布熱圖Fig.4 Heat map of fish distribution in Hongfeng Lake based on genus level

2.3 紅楓湖魚類多樣性分析

由Chao1 指數(shù)可知（表2），紅楓湖S2 觀測(cè)到OTU 數(shù)目最多，S5 最少；由Shannon 指數(shù)可知，紅楓湖各樣點(diǎn)魚類群落多樣性指數(shù)由高之低以次為：S2＞S4＞S3＞S1＞S5＞S6。

表2 紅楓湖各樣點(diǎn)α 多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity index of various sites in Hongfeng Lake

利用R 語言分析紅楓湖魚類β 多樣性（圖5）可知，S5、S6 魚類組成相似性最高，S2 與紅楓湖其他樣點(diǎn)魚類組成相似性最低。PERMANOVA 分析表明，紅楓湖南湖和北湖魚類組成結(jié)構(gòu)差異不顯著（R2=0.466，P=0.1＞0.05）；PCoA 分析和層次聚類分析驗(yàn)證，兩者結(jié)果一致。

圖5 基于序列豐度的紅楓湖魚類組成的層次聚類分析圖（a）和PCoA 分析圖（b）Fig.5 Hierarchical clustering analysis（a）and PCoA analysis（b）of fish composition in Hongfeng Lake based on sequence abundance

3 討論

3.1 基于eDNA 的紅楓湖魚類組成及空間分布

本研究利用eDNA 宏條形碼技術(shù)分析了紅楓湖魚類多樣性，共監(jiān)測(cè)到28 種魚類，其中鱸形目魚類和鯉形目魚類分別為13 種和11 種，二者數(shù)量相當(dāng)。這與2010—2011 年牟洪民等[16]在紅楓湖采集的魚類結(jié)果不同，同樣檢測(cè)到28 種魚類，其中鯉形目有23 種，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而鱸形目?jī)H有1 種。紅楓湖魚類組成較歷史發(fā)生較大變化，可能是近年來人工引種放流、養(yǎng)殖逃逸等導(dǎo)致紅楓湖魚類結(jié)構(gòu)和豐度較歷史發(fā)生變化，也可能是紅楓湖歷史魚類數(shù)據(jù)庫超十年未更新，歷史魚類數(shù)據(jù)庫不足以完全代表紅楓湖魚類現(xiàn)狀。此外，eDNA 技術(shù)監(jiān)測(cè)魚類群落的研究大多依賴魚類線粒體12S 區(qū)段通用引物擴(kuò)增，并進(jìn)行物種基因注釋[18]，這可能會(huì)在個(gè)別近緣物種的基因注釋上產(chǎn)生混淆[19,20]。如楊海樂等[5]在長(zhǎng)江武漢江段監(jiān)測(cè)到韓國(guó)瀕危魚類——短體擬鲿（Pseudobagrus brevicorpus）的eDNA 信號(hào)。研究者認(rèn)為這可能是由于缺乏長(zhǎng)江幾種擬鲿的基因序列而導(dǎo)致的錯(cuò)配。本研究缺乏基因序列數(shù)據(jù)庫和歷史魚類數(shù)據(jù)庫，無法判斷紅楓湖監(jiān)測(cè)到的13 種鱸形目魚類在物種分類單元上的準(zhǔn)確性，但本研究揭示了紅楓湖存在多種鱸形目外來魚類。

紅楓湖南湖、北湖魚類群落組成差異不顯著，但各樣點(diǎn)間魚類群落組成存在差異。根據(jù)相關(guān)資料[16]，紅楓湖將軍灣附近（本研究S2）魚類密度最高，在大壩附近（本研究S5）最低。本研究顯示，S2 觀測(cè)到魚類代表OTU 數(shù)目最多，S5 觀測(cè)到魚類代表OTU 數(shù)目最少，魚類群落多樣性由高至低依次為：S2＞S4＞S3＞S1＞S5＞S6。紅楓湖魚類空間結(jié)構(gòu)同歷史數(shù)據(jù)一致性較好。引起紅楓湖魚類空間分布差異可能是，S5、S6 樣點(diǎn)位于南湖，常年有觀光船、漁政執(zhí)法船行駛，受人類活動(dòng)影響較大；S1 位于羊昌河匯入口附近，水面淺、窄，本研究采樣期間為冬季，水溫變化大，不利于魚類越冬。S2、S3、S4 位于北湖，水面寬闊，少有人前往，受人類活動(dòng)影響較小。各樣點(diǎn)S5、S6 魚類組成相似性最高，S2 與紅楓湖其他樣點(diǎn)魚類組成相似性最低。魚類對(duì)生境的選擇[21,22]，與pH、鹽度、溶氧、水面溫度、透光率等環(huán)境因子有關(guān)[23]，紅楓湖魚類群落空間分布與環(huán)境因子聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

3.2 eDNA 技術(shù)與喀斯特水域魚類多樣性監(jiān)測(cè)及適用性

本研究結(jié)果表明，eDNA 技術(shù)適用于紅楓湖魚類監(jiān)測(cè)，這也說明eDNA 技術(shù)監(jiān)測(cè)喀斯特水域魚類多樣性具有可行性。據(jù)Santana 統(tǒng)計(jì)[19]，在33 124 種硬骨魚類中僅有4 243 種魚類線粒體12S 區(qū)段完成測(cè)序，占比13%，對(duì)存在于目標(biāo)區(qū)域但尚無線粒體序列數(shù)據(jù)的魚類，eDNA 技術(shù)無法檢測(cè)到。雖然eDNA 技術(shù)監(jiān)測(cè)魚類多樣性的科學(xué)性和可靠性已得到大量驗(yàn)證[24-26]，但該技術(shù)對(duì)監(jiān)測(cè)水域的魚類線粒體12S 序列文庫依賴程度高，而喀斯特區(qū)域魚類線粒體序列文庫較缺乏，尤其是在地區(qū)特有魚類方面，如喀斯特洞穴魚類、湖庫魚類等。因此，在開展喀斯特高原水域調(diào)查監(jiān)測(cè)時(shí)仍需不斷豐富該地區(qū)魚類線粒體12S 序列文庫，這將有利于提升eDNA技術(shù)監(jiān)測(cè)喀斯特高原水域魚類多樣性的效率及準(zhǔn)確性。

Strickler 等[27]研究表明，在低溫、避光且偏堿性的水體中eDNA 的降解速率會(huì)更慢。目標(biāo)水域位于中國(guó)西南喀斯特中心，是世界三大喀斯特集中分布區(qū)域之一。該地區(qū)復(fù)雜的地質(zhì)背景和特殊的自然條件，使該地區(qū)湖泊富含營(yíng)養(yǎng)鹽，水體大多呈堿性[28,29]，且高原地區(qū)水溫一般低于平原、沿海等其他區(qū)域?？λ固馗咴虻睦砘再|(zhì)，利于該地區(qū)水體eDNA 長(zhǎng)時(shí)間留存。Goriki 等[30]針對(duì)歐洲的一種穴居兩棲動(dòng)物洞螈（Proteus）設(shè)計(jì)了特異性引物，利用eDNA 技術(shù)成功在包括喀斯特環(huán)境在內(nèi)的水環(huán)境樣本中監(jiān)測(cè)到了該類生物的存在。West 等[31]在澳大利亞圣誕島的喀斯特地貌區(qū)域利用eDNA 技術(shù)監(jiān)測(cè)真核生物，在23 個(gè)洞穴和泉水中采集的159 個(gè)水和沉積物樣本中監(jiān)測(cè)到了隸屬于60 個(gè)目、71 個(gè)科的生物。

綜上所述，eDNA 技術(shù)可用于喀斯特高原水域的魚類組成及多樣性研究，這為該地區(qū)魚類多樣性調(diào)查手段及豐富本底資料提供了新思路，但后續(xù)仍需結(jié)合該區(qū)域地理環(huán)境和水域特征進(jìn)行全面深入地研究。