美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白OBP13的鑒定與功能

陳東凱，張林雅,2，邢振龍，雷仲仁

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美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白OBP13的鑒定與功能

陳東凱1，張林雅1,2，邢振龍1，雷仲仁1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒 334001）

【目的】克隆與鑒定美洲斑潛蠅（）氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）基因，并對其序列特征、表達情況、系統(tǒng)發(fā)育及蛋白功能進行研究，為深入研究美洲斑潛蠅嗅覺機制提供依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^PCR技術(shù)克隆美洲斑潛蠅OBP13編碼區(qū)全長，用DNAMAN對其進行序列分析，用BLAST進行同源性比較，并使用MEGA6.0構(gòu)建進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過實時定量PCR對OBP13在美洲斑潛蠅不同組織中的表達情況進行分析。構(gòu)建原核表達載體，進行原核表達及蛋白純化，獲取重組蛋白。設(shè)定熒光分光光度計的激發(fā)波長為337 nm，以1-NPN為熒光探針，研究OBP13與25種不同氣味配基的結(jié)合特性。使用間接免疫熒光染色技術(shù)及制備的OBP13的特異性多克隆抗體，對其在組織中的分布情況進行定位。將美洲斑潛蠅觸角進行包埋、切片、免疫染色，并在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察,了解OBP13在觸角感器中的亞細胞分布。【結(jié)果】獲得了一個美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白基因，命名為（GenBank登錄號：KT250751）。開放閱讀框全長462 bp，編碼153個氨基酸，預(yù)測成熟蛋白分子量為17.80 kD，等電點為5.75，N-末端的前17個氨基酸為信號肽序列。具有4個保守的半胱氨酸位點，為Minus-C OBP。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，其與地中海實蠅CcapOBP99a-like位于同一小分支上，親緣關(guān)系較近。檢測在不同組織的表達水平，發(fā)現(xiàn)在觸角中的表達量遠遠高于其他組織。成功構(gòu)建了重組表達載體并獲得了高純度的重組蛋白。對25種氣味配基的結(jié)合能力檢測，發(fā)現(xiàn)OBP13與反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、-紫羅蘭酮、苯并噻唑、-紫羅蘭酮具有較強的結(jié)合能力，解離常數(shù)分別為12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218 μmol·L-1，其中與-紫羅蘭酮親和能力最強。通過免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)其在觸角中主要定位在毛形感器和錐形感器上，在觸角嗅覺窩及觸角芒連接處也有分布?！窘Y(jié)論】美洲斑潛蠅OBP13為非典型的氣味結(jié)合蛋白Minus-C OBP。表達情況、氣味結(jié)合特性、免疫定位結(jié)果表明，OBP13主要存在于美洲斑潛蠅觸角中，參與觸角對綠葉植物中大量存在的氣味物質(zhì)的識別過程，推測其在美洲斑潛蠅嗅覺識別、寄主植物定位中發(fā)揮功能。

美洲斑潛蠅；氣味結(jié)合蛋白；序列分析；表達情況；氣味結(jié)合特性；免疫熒光定位

0 引言

【研究意義】美洲斑潛蠅（）是一種多食性昆蟲，能夠危害多種蔬菜、花卉，其主要通過成蟲在葉片上取食、產(chǎn)卵形成刻點和幼蟲取食葉肉組織進行危害，影響蔬菜、花卉的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴重時可以導(dǎo)致寄主植物生長緩慢甚至死亡[1]。目前，美洲斑潛蠅的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主，但是很多研究發(fā)現(xiàn)殺蟲劑的使用及其導(dǎo)致的抗藥性的形成，可能導(dǎo)致美洲斑潛蠅大規(guī)模暴發(fā)并產(chǎn)生更嚴重的危害[2]，因此需要探尋安全、無毒的綠色防控手段，而基于嗅覺靶標的害蟲控制策略為防治美洲斑潛蠅提供了新的方法和途徑。對美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白進行研究，對于揭示嗅覺反應(yīng)機制及基于嗅覺靶標的防治策略制定具有重要意義。【前人研究進展】有關(guān)美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白的研究目前尚無報道，僅有文獻報道研究了其成蟲對各種氣味物質(zhì)的行為學(xué)反應(yīng)、EAG反應(yīng)，鑒定出使美洲斑潛蠅產(chǎn)生嗅覺反應(yīng)的綠色植物揮發(fā)物[3]。昆蟲化學(xué)感受系統(tǒng)可以感受環(huán)境中的化學(xué)信號物質(zhì)并作出反應(yīng)，化學(xué)信號在昆蟲寄主選擇過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，氣味結(jié)合蛋白是一種主要存在于昆蟲嗅覺感受器淋巴液中的一類分子量較小、水溶性的酸性蛋白[4-7]，其主要功能是將疏水性的氣味分子運輸?shù)礁惺苌窠?jīng)樹突膜上的受體部位，是連接外界信息分子與嗅覺受體的重要載體，參與昆蟲專一性識別環(huán)境氣味物質(zhì)的過程，對嗅覺引導(dǎo)的昆蟲取食、交配、產(chǎn)卵等行為發(fā)揮非常重要的作用[8-11]。昆蟲氣味結(jié)合蛋白是一個龐大的基因家族，通常由135—220個氨基酸組成，根據(jù)其保守的半胱氨酸數(shù)量可以分為含有6個C的典型的Classic OBPs[12-13]，多于6個C的Plus-C OBPs[14-17]；少于6個C的Minus-C OBPs[18-19]，不同屬的昆蟲其OBPs序列相似性一般很低[16]。OBP在多種組織中均有表達，其表達量與部位、發(fā)育階段、性別相關(guān)[20-22]。對OBP的蛋白功能研究多集中于其對不同氣味物質(zhì)的結(jié)合特性的研究[7,23-24]。【本研究切入點】氣味結(jié)合蛋白在美洲斑潛蠅與外界化學(xué)信息交流中具有非常重要的作用，但是目前對美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白無研究報道，對其嗅覺反應(yīng)機制尚無了解?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對美洲斑潛蠅的氣味結(jié)合蛋白基因進行克隆鑒定，獲得高純度的重組蛋白，對其在蟲體的分布情況進行免疫定位，了解其發(fā)揮功能的部位，為美洲斑潛蠅嗅覺機制的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2015—2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所完成。

1.1 供試蟲源

美洲斑潛蠅為2015年采集于北京，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所實驗室養(yǎng)蟲間養(yǎng)蟲籠（50 cm×40 cm×50 cm）中，以菜豆苗作為飼養(yǎng)寄主，飼養(yǎng)溫度為（26±1）℃，相對濕度（60±5）%，光周期為16L﹕8D。收集不同組織（初羽化雌雄成蟲的觸角、頭、胸、腹、足）的樣品，液氮冷凍，-80℃冰箱保存待用。

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

將收集的蟲樣于液氮中冷凍研磨后，按照TRIzol?LS Reagent（invitrogen公司）說明提取總RNA，并溶于Nuclease-Free水中，使用超微量紫外分光光度計NanoDrop 2000（Thermo公司）檢測RNA濃度和純度，-80℃保存?zhèn)溆?。然后按照Reverse Transcription System（Promega公司）說明書反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 LsatOBP13全長cDNA序列克隆

經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析，得到一條美洲斑潛蠅OBP基因。根據(jù)該片段設(shè)計特異性引物（表1，OBP13-S、OBP13-A），以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板進行PCR。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Taq MasterMix（博邁德公司）12.5 μl，cDNA第一條鏈1 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 1 min；每個循環(huán)條件為94℃ 30 s；54℃ 30 s；72℃ 30 s，重復(fù)35次；72℃ 10 min；4℃保存。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將目的條帶切下，使用DNA凝膠回收試劑盒回收純化（Axygen公司），純化產(chǎn)物連接到pGEM?-T Easy載體（Promega公司）上，然后轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞（博邁德公司），經(jīng)藍白斑篩選及菌液PCR驗證后，將陽性克隆進行測序驗證。使用DNASTAR?Lasergene軟件中的SeqMan分析，得到完整的基因編碼區(qū)序列。

1.4 序列分析及進化樹構(gòu)建

使用DNAMAN進行蛋白質(zhì)翻譯及開放閱讀框預(yù)測，使用SignalP 4.1在線軟件（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）進行信號肽預(yù)測，使用NCBI中BlastX數(shù)據(jù)庫（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性對比分析，得到與其他基因序列對比結(jié)果，使用MEGA 6.0軟件中的neighbor-joining（NJ）法（Bootsrap為1 000次）構(gòu)建所有基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。

1.5 表達情況分析

選取美洲斑潛蠅為內(nèi)參基因（GenBank：DQ452369.1）。設(shè)計用于熒光定量的目的基因引物（表1，OBP13-q-S、OBP13-q-A）及內(nèi)參基因引物（表1，-S、-A）。qPCR反應(yīng)體系：GoTaq? qPCR Master Mix（Promega公司）10 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA模板 2 μl，Nuclease-Free Water 7.2 μl。qPCR反應(yīng)條件：反應(yīng)采用兩步法PCR反應(yīng)，同時測定為記錄55—95℃內(nèi)每10 s上升0.5℃時反應(yīng)體系的熒光強度，記錄熔解曲線。每個樣品均有3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)均進行3次技術(shù)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)以各個樣品對應(yīng)的美洲斑潛蠅內(nèi)參基因的Ct值作為對照，利用2-△△Ct法[25]分析美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白基因在美洲斑潛蠅不同組織部位中的表達情況。

1.6 原核表達及純化

根據(jù)及表達載體pET-30a(+)的序列，設(shè)計帶有I和I限制性酶切位點的特異性引物（表1，OBP13-O-S，OBP13-O-A），使用高保真DNA聚合酶I-5TM2×High-Fidelity Master Mix（iCloning公司）進行擴增，擴增產(chǎn)物回收連接至pGEM?-T Easy載體（Promega公司）上，然后轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞（博邁德公司），提取質(zhì)粒進行雙酶切及測序驗證。將含有目的片段的重組質(zhì)粒及pET-30a(+)（Merck公司）用選定的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，回收的目標片段使用T4 DNA連接酶（TaKaRa公司）連接，然后轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行雙酶切及測序驗證。

將驗證正確的重組表達質(zhì)粒pET-30a(+) /OBP13轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞（博邁德公司）中，轉(zhuǎn)化后菌液涂布在含有50 μg·ml-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板中，37℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取平板中大小適中的菌落到5 ml LB液體培養(yǎng)基中（含卡那霉素50 μg·ml-1），37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

以1%的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接入100 ml的LB液體培養(yǎng)基中（含卡那霉素50 μg·ml-1），37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6—1.0，加入IPTG（終濃度0.5 mmol·L-1）誘導(dǎo)表達，28℃ 180 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3—4 h。收集菌體，并進行破碎及分離上清及包涵體。使用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況及表達形式。

表1 本試驗所用引物

酶切位點用下劃線標出 The restriction sites are underlined

使用Ni-NTA瓊脂糖重力柱（上海生工生物工程有限公司）進行蛋白的純化，并使用重組腸激酶（北京全式金生物技術(shù)公司）切除His標簽，純化的蛋白經(jīng)過透析除鹽和超濾濃縮后，使用BCA法測定濃度，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 競爭性熒光結(jié)合實驗

將獲得的美洲斑潛蠅OBP13重組蛋白用PBS緩沖液稀釋至1 μmol·L-1。將熒光探針1-NPN、25種氣味物質(zhì)溶于色譜級甲醇中，配置成濃度為1 mmol·L-1的工作液。

測定OBP13與熒光探針1-NPN的結(jié)合常數(shù)時，將1 μmol·L-1的蛋白溶液加入比色皿中，加入1-NPN，使其終濃度為1—16 μmol·L-1梯度遞增，使用熒光分光光度計970CRT（上海三科儀器有限公司）掃描，記錄每個1-NPN濃度下的熒光強度，掃描參數(shù)為EX波長337 nm，EM范圍為370—500 nm，靈敏度3。根據(jù)熒光強度的變化計算出OBP13與熒光探針1-NPN的結(jié)合常數(shù)。

測定OBP13與熒光探針1-NPN的結(jié)合能力時，將1 μmol·L-1的蛋白溶液加入比色皿中，加入1-NPN使其終濃度為1 μmol·L-1，并用熒光分光光度計進行掃描記錄，掃描參數(shù)同上；然后在目的蛋白與1-NPN的混合物中按照梯度加入濃度為1 mmol·L-1氣味物質(zhì)，使其氣味物質(zhì)終濃度0—40 μmol·L-1梯度遞增，記錄熒光強度變化。每個氣味物質(zhì)重復(fù)3次。計算氣味物質(zhì)競爭結(jié)合50%的1-NPN時的濃度IC50，計算目的蛋白與標準氣味配基的解離常數(shù)Ki，Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/ K1-NPN)[26]。

1.8 免疫定位

將純化的重組蛋白作為抗原制備特異性多克隆抗體（晶諾科生物技術(shù)有限公司）。將健康的3日齡雄蟲在體視顯微鏡下切下的頭部，放入包埋劑中冷凍包埋，然后于冷凍切片機中將樣品切成5 μm的薄片，并黏附于載玻片上，然后按照免疫染色試劑盒（碧云天公司）說明進行切片固定、組織封閉、一抗孵育、二抗孵育、封片。將制備好的玻片在激光共聚焦顯微鏡LMS680（Carl Zeiss公司）下進行觀察并記錄結(jié)果。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS19.0軟件進行Tukey’s（HSD）單因素方差分析，對表達情況數(shù)據(jù)進行差異分析。用Graphpad Prism 6 軟件擬合1-NPN的飽和曲線及計算目的蛋白和1-NPN的解離常數(shù)Ki。

2 結(jié)果

2.1 LsatOBP13克隆及序列分析

獲得一個新的美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白基因，命名為（GenBank登錄號：KT250751）。開放閱讀框全長462 bp，編碼153個氨基酸（圖1）。預(yù)測其蛋白分子量大小為17.80 kD，等電點為5.75，N-末端的前17個氨基酸為信號肽序列。該蛋白具有4個保守的半胱氨酸位點，缺失了典型OBP的6個保守半胱氨酸中的第2位和第5位的保守半胱氨酸，符合Minus-C OBP的保守結(jié)構(gòu)。

2.2 LsatOBP13氨基酸序列對比及系統(tǒng)進化分析

利用NCBI中的blastx對美洲斑潛蠅進行同源性搜索，主要與雙翅目昆蟲具有較高的同源性，與其他昆蟲的Minus-C OBP的氨基酸序列進行對比顯示，這些序列都具有4個典型的保守半胱氨酸位點，此外還存在一個保守的谷氨酸位點（圖2）。將OBP13與其他雙翅目昆蟲的OBP構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)其與地中海實蠅CcapOBP99a- like位于同一小分支上，說明它們可能具有相同的基因起源。

下劃線表示信號肽，方框標內(nèi)表示保守的4個半胱氨酸位點，星號表示終止密碼子

OBP序列來源及GenBank登錄號 Origin of the OBP proteins and their GenBank accession numbers：CsupOBP1：二化螟Chilo suppressalis，KC492498；DmelOBP99c：黑腹果蠅Drosophila melanogaster，F(xiàn)Bgn0039682；AmelOBP14：意大利蜜蜂Apis mellifera，ABD92646.1；HarmOBP：棉鈴蟲Helicoverpa armigera，AEX07280。相同的氨基酸用黑色標出The identical amino acids are highlighted in dark

2.3 LsatOBP13表達譜分析

通過qPCR的方法測定美洲斑潛蠅雌雄成蟲不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，不同組織部位中（圖4），以雌蟲腹部的表達量為基準，在觸角中的表達量顯著高于其他部位，在足中也有一定的表達量。

2.4 LsatOBP13原核表達及純化

對成功構(gòu)建的原核表達載體pET30a(+)/OBP13進行雙酶切和菌液PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物分為大小與預(yù)期相符載體片段和目的片段；菌液PCR產(chǎn)物條帶大小符合擴增的目的片段。表達載體轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)過條件優(yōu)化，在0.5 mmol·L-1的IPTG濃度，28℃，150 r/min誘導(dǎo)6 h后，大量表達，超聲破碎對上清和包涵體進行分離，用SDS-PAGE電泳檢測，目的蛋白主要在上清中大量表達。對包涵體進行溶解后，使用Ni柱進行純化，用SDS-PAGE電泳檢測不同濃度咪唑洗脫液的蛋白情況（圖5），發(fā)現(xiàn)在250 mmol·L-1的咪唑濃度下洗脫純凈的OBP13重組蛋白，切除His標簽后，再經(jīng)純化、透析、超濾濃縮后得到了高純度的OBP13重組蛋白。

OBP序列來源及GenBank登錄號 Origin of the OBP proteins and their GenBank accession numbers：AfraOBP99c：南美按實蠅Anastrepha fraterculus，AOW41553.1；CcapOBP99a：地中海實蠅Ceratitis capitata，XP_004521186.1；CcapOBP99a-like：地中海實蠅C. capitata，XP_020717484.1；CvesOBP5：棗實蠅Carpomya vesuviana，AMY98995.1；BdorOBP99c-1：橘小實蠅Bactrocera dorsalis，AKI29023.1；BdorOBP99a-like：橘小實蠅B. dorsalis，XP_011210426.1；BdorOBP99c-2：橘小實蠅B. dorsalis，AKI29024.1；BdorOBP3：橘小實蠅B. dorsalis，AGC82132.1；BdorOBP99c-3：橘小實蠅B. dorsalis，AKI29025.1；BdorOBP18：橘小實蠅B. dorsalis，AKM45838.1；BdorOBP99b-like：橘小實蠅B. dorsalis，XP_011210422.1；BdorOBP1：橘小實蠅B. dorsalis，AGC82130.1；BdorOBP99c-4：橘小實蠅B. dorsalis，AKI29026.1；BdorOBP10：橘小實蠅B. dorsalis，AKM45833.1；BlatOBP99a-like：辣椒實蠅B. latifrons，XP_018799094.1；BoleOBP99a-like：橄欖果蠅B. oleae，XP_014090679.1；BoleOBP99b-like：橄欖果蠅B.oleae，XP_014090663.1；ZtauOBP99a-2：南瓜實蠅Zeugodacus tau，ALS40420.1；ZcucOBP：瓜實蠅Zeugodacus cucurbitae，AMH85956.1；DtakOBP99a：高橋氏果蠅Drosophila takahashii，XP_017000586.1；DbusOBP99a：巴氏果蠅D. busckii，XP_017846546.1；DmelObp99c：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0039682；DmelObp99d：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0039684；DmelObp8a：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0030103；DmelObp18a：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0030985；DmelObp56b：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0046880；DmelObp84a：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0011282；DmelObp76a：黑腹果蠅D. melanogaster，F(xiàn)Bgn0020277；GmorOBP21：采采蠅Glossina morsitans morsitans，CBA11325.1；DsimOBP99c：斑翅果蠅D. simulans，XP_002105371.1；CstyOBP：麗蠅Calliphora stygia，AID61318.1；ScalOBP99b-like：廄螯蠅Stomoxys calcitrans，XP_013097458.1；ScalOBP99a：廄螯蠅S. calcitrans，XP_013104969.1；MdomOBP：家蠅Musca domestica，XP_005192089.1；DantOBP1：蔥蠅Delia antiqua，BAI82441.1；DantOBP2：蔥蠅D. antiqua，BAI82442.1；DantOBP3：蔥蠅D. antiqua，BAI82443.1；CquiOBP：致倦庫蚊Culex quinquefasciatus，EDS29382.1

2.5 LsatOBP13的氣味結(jié)合特性

測定OBP13與1-NPN結(jié)合常數(shù)測定過程中擬合的飽和曲線，根據(jù)Scatchard方程的線性化（圖6），根據(jù)結(jié)果可以計算出OBP13與1-NPN的解離常數(shù)為（9.792±0.585）μmol·L-1，OBP13與1-NPN復(fù)合體的熒光強度隨著與氣味性物質(zhì)配基競爭性結(jié)合過程下降，使OBP13與1-NPN熒光強度下降超過50%的氣味配基（圖7），共6種分別為反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、-紫羅蘭酮、苯并噻唑、-紫羅蘭酮，它們的Ki值見表2，其中與-紫羅蘭酮親和能力最強。OBP13主要和植物中大量存在的醛、醇、酮等氣味結(jié)合。

An：觸角Antenna；He：頭Head；Th：胸Thorax；Ab：腹Abdomen；Lg：足Leg

M：蛋白分子量標準Protein molecular weight marker；1—5：分別代表20、50、100、250、500 mmol·L-1的咪唑濃度Concentration of iminazole is 20, 50, 100, 250, 500 mmol·L-1, respectively

圖6 LsatOBP13蛋白與1-NPN的結(jié)合曲線

2.6 LsatOBP13的免疫定位

將制備好的經(jīng)過免疫染色的玻片在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。在觸角鞭節(jié)橫切切片中，發(fā)現(xiàn)OBP13主要分布于毛形感器和錐形感器中（圖8），在觸角鞭節(jié)縱切切片中，觸角芒與鞭節(jié)連接處以及嗅覺窩處有OBP13的定位（圖9）。

圖7 LsatOBP13蛋白與氣味分子的競爭結(jié)合曲線

表2 氣味配基與LsatOBP13的結(jié)合特性

1、2、3為同一切片在激光共聚焦顯微鏡不同光照下的結(jié)果 1, 2, 3 are the same section under different illuminations of laser scanning confocal microscope；LsatOBP13在熒光共聚焦顯微鏡下顯示綠光LsatOBP13 is reflected by the green fluorenscence under laser scanning confocal microscope；標尺Scale bar =20 μm，白色箭頭指向毛形感器The white arrows point to trichoid sensilla，紅色箭頭指向錐形感器The red arrows point to basiconic sensilla

1、2、3為同一切片在激光共聚焦顯微鏡不同光照下的結(jié)果 1, 2, 3 are the same section under different illuminations of laser scanning confocal microscope；LsatOBP13在熒光共聚焦顯微鏡下顯示綠光LsatOBP13 is reflected by the green fluorenscence under laser scanning confocal microscope，標尺Scale bar =20 μm，白色箭頭指向嗅覺窩The white arrows point to olfactory pit，紅色箭頭指向觸角芒與鞭節(jié)連接處The red arrows point to the joint of arista and funicular section

3 討論

本研究克隆出一個美洲斑潛蠅氣味結(jié)合蛋白基因，屬于非典型的氣味結(jié)合蛋白Minus-C OBP，具有4個保守的半胱氨酸位點，與典型的OBP相比缺少第二位和第五位的保守半胱氨酸位點，其理化特性符合OBPs基因家族的共有特征。由于半胱氨酸形成的二硫鍵在蛋白高級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中發(fā)揮非常重要的作用[27]，數(shù)量更多的半胱氨酸可以形成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，有研究推測Minus- C OBP是一類較為原始的OBP，是其他種類OBP的起源[28]。系統(tǒng)發(fā)育分析中，進化樹顯示其與地中海實蠅CcapOBP99a-like具有更近的親緣關(guān)系，同源性較高，位于同一分支上，進化上可能具有同樣的起源。

通過熒光定量PCR技術(shù)研究基因在不同組織部位的表達情況是研究基因功能的基本途徑。對美洲斑潛蠅表達情況測定發(fā)現(xiàn)，在不同的組織部位中，在觸角中的表達量遠遠高于其他部位，而掃描電鏡發(fā)現(xiàn)美洲斑潛蠅觸角上具有大量的嗅覺感器[29]，說明其主要在觸角中發(fā)揮作用，此外，在雄蟲的足中也有一定的表達，而昆蟲的足上也存在著一些味覺感受器，有研究推測其主要是對非揮發(fā)性物質(zhì)進行感知[29-33]。

為了深入研究OBP13的功能，構(gòu)建了其原核表達載體，對其進行誘導(dǎo)表達及純化，對獲得的重組蛋白進行競爭性熒光結(jié)合實驗，測定了其對25種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。解離常數(shù)Ki通常被用來衡量蛋白與氣味物質(zhì)的結(jié)合能力，其值小于10 μmol·L-1的時候認為結(jié)合能力強[34-37]。經(jīng)過測定，OBP13只對25種氣味物質(zhì)中的6種物質(zhì)有結(jié)合，說明其氣味結(jié)合具有選擇性[38]，其中，對-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強，而-紫羅蘭酮是許多綠色植物中普遍存在的氣味物質(zhì)[39-40]，且被證實是美洲斑潛蠅田間引誘劑中的關(guān)鍵成分[41]，可能在美洲斑潛蠅對寄主植物的定向中起作用。此外，與反式-2-己烯醛有較強的結(jié)合，而反式-2-己烯醛已被證實能夠引發(fā)美洲斑潛蠅觸角的EAG反應(yīng)[42]。這些具有較強結(jié)合的氣味物質(zhì)可以進一步應(yīng)用于美洲斑潛蠅驅(qū)避劑的開發(fā)利用。

為了進一步探究OBP13在美洲斑潛蠅組織中的分布情況及其發(fā)揮功能的位置，利用原核表達的重組蛋白制備了特異性多克隆抗體，進行免疫熒光定位。主要對其頭部的觸角進行了切片、免疫染色觀察。美洲斑潛蠅觸角上存在著多種嗅覺感器，如毛形感器、錐形感器等[29]，定位結(jié)果顯示，OBP13主要分布于觸角的毛形感器和錐形感器上，此外在嗅覺窩及觸角芒與鞭節(jié)的連接處也有分布。OBP13的分布情況為不同類型感器的功能研究提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

美洲斑潛蠅OBP13為非典型的氣味結(jié)合蛋白Minus-C OBP。表達情況、氣味結(jié)合特性、免疫定位結(jié)果表明，OBP13主要存在于美洲斑潛蠅觸角中，參與觸角對綠葉植物中大量存在的氣味物質(zhì)的識別過程，推測其在美洲斑潛蠅嗅覺識別、寄主植物定位中發(fā)揮功能。

[1] Parrella M P. Biology of., 1987, 32: 201-224.

[2] MacDonald O C. Responses of the alien leafminersand(Diptera: Agromyzidae) to some pesticides scheduled for their control in the UK., 1991, 10(6): 509-513.

[3] Wei J N, Zhu J, Le K. Volatiles released from bean plants in response to agromyzid flies., 2006, 224: 279.

[4] Vogt R G, Riddiford L M. Pheromone binding and inactivation by moth antennae., 1981, 293(5827): 161-163.

[4] Pelosi P. Odorant-binding proteins: structural aspects., 1998, 855: 281-293.

[6] Vogt R G, Callahan F E, Rogers M E, Dickens J C. Odorant binding protein diversity and distribution among the insect orders, as indicated by LAP, an OBP-related protein of the true bug(Hemiptera, Heteroptera)., 1999, 24(5): 481-495.

[7] 紀萍, 劉靖濤, 谷少華, 朱曉強, 張永軍, 郭予元. 綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP7的表達及氣味結(jié)合特性. 昆蟲學(xué)報, 2013, 56(6): 575-583.

Ji P, Liu J T, Gu S H, Zhu X Q, Zhang Y J, Guo Y Y. Expression and binding specificity analysis of odorant binding protein AlucOBP7 from(Hemiptera: Miridae)., 2013, 56(6): 575-583. (in Chinese)

[8] Vet L E, Dicke M. Ecology of infochemical use by natural enemies in a tritrophic context., 1992, 37: 141-172.

[9] De Moraes C M, Mescher M C, Tumlinson J H. Caterpillar-induced nocturnal plant volatiles repel conspecific females., 2001, 410(6828): 577-580.

[10] 張治科, 吳圣勇, 雷仲仁. 西花薊馬化學(xué)感受蛋白的cDNA克隆、時空表達分析及組織定位. 昆蟲學(xué)報, 2015, 58(1): 1-14.

Zhang Z K, Wu S Y, Lei Z R. cDNA cloning, expression profiling and immunolocalization of a chemosensory protein in the western flower thrips,(Thysanoptera: Thtipidae)., 2015, 58(1): 1-14. (in Chinese)

[11] Bruce T J, Wadhams L J, Woodcock C M. Insect host location: a volatile situation., 2005, 10(6): 269-274.

[12] Vogt R G, Prestwich G D, Lerner M R. Odorant binding protein subfamilies associate with distinct classes of olfactory receptor neurons in insects., 1991, 22(1): 74-84.

[13] Krieger J, von Nickisch-Rosenegk E, Mameli M, Pelosi P, Breer H. Binding proteins from the antennae of., 1996, 26(3): 297-307.

[14] Hekmat-Scafe D S, Scafe C R, Mc Kinney A J, Tanouye M A. Genome-wide analysis of the odorant-binding protein gene family in., 2002, 12(9): 1357-1369.

[15] Rivière S, Lartigue A, Quennedey B, Campanacci V, Farine J P, Tegoni M, Cambillau C, Brossut R. A pheromone-binding protein from the cockroach: cloning, expression and pheromone binding., 2003, 371(2): 573-579.

[16] Zhou J J, Huang W, Zhang G A, Pickett J A, Field L M. “Plus-C” odorant-binding protein genes in twospecies and the malaria mosquito., 2004, 327(1): 117-129.

[17] Zhou J J, Zhang G A, Huang W, Birkett M A, Field L M, Pickett J A, Pelosi P. Revisiting the odorant-binding protein LUSH of: evidence for odour recognition and discrimination., 2004, 558(1/3): 23-26.

[18] Spinelli S, Lagarde A, Iovinella I, Legrand P, Tegoni M, Pelosi P, Cambillau C. Crystal structure ofOBP14, a C-minus odorant-binding protein, and its complexes with odorant molecules., 2012, 42(1): 41-50.

[19] Li Z Q, Zhang S, Luo J Y, Cui J J, Ma Y, Dong S L. Two minus-C odorant binding proteins fromdisplay higher ligand binding affinity at acidic pH than neutral pH., 2013, 59(3): 263-272.

[20] Allen J E, WANNER K W. Asian corn borer pheromone binding protein 3, a candidate for evolving specificity to the 12-tetradecenyl acetate sex pheromone., 2011, 41(3): 141-149.

[21] CALVELLO M, GUERRA N, BRANDAZZA A, D’AMBROSIO C, SCALONI A, DANI F R, TURILLAZZI S, PELOSI P. Soluble proteins of chemical communication in the social wasp., 2003, 60(9): 1933-1943.

[22] SUN M J, LIU Y, WANG G R. Expression patterns and binding properties of three pheromone binding proteins in the diamondback moth,., 2013, 59(1): 46-55.

[23] ZHU J, BAN L P, SONG L M, LIU Y, PELOSI P, WANG G R. General odorant-binding proteins and sex pheromone guide larvae ofto better food., 2016, 72: 10-19.

[24] HE M, HE P. Molecular characterization, expression profiling, and binding properties of odorant binding protein genes in the whitebacked planthopper,:,2014, 174: 1-8.

[25] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[26] Gong Z J, Zhou W W, Yu H Z, Mao C G, Zhang C X, Cheng J A, Zhu Z R. Cloning, expression and functional analysis of a general odorant-binding protein 2 gene of the rice striped stem borer,(Walker) (Lepidoptera: Pyralidae)., 2009, 18(3): 405-417.

[27] Pelosi P, Maida R. Odorant-binding proteins in insects., 1995, 111(3): 503-514.

[28] Vieira F G, Rozas J. Comparative genomics of the odorant- binding and chemosensory protein gene families across the Arthropoda: origin and evolutionary history of the chemosensory system., 2011, 3: 476-490.

[29] Zhao Y X, Kang L. Role of plant volatiles in host plant location of the leafminer,(Diptera: Agromyzidae)., 2002, 27(2): 103-111.

[30] Pelletier J, Leal W S. Genome analysis and expression patterns of odorant-binding proteins from the southern house mosquito., 2009, 4(7): e6237.

[31] Xu W, Cornel A J, Leal W S. Odorant-binding proteins of the malaria mosquito., 2010, 5(10): e15403.

[32] Mitaka H, Matsuo T, Miura N, Ishikawa Y. Identification of odorant-binding protein genes from antennal expressed sequence tags of the onion fly,,2011, 38(3): 1787-1792.

[33] Gu S H, Wang S P, Zhang X Y, Wu K M, Guo Y Y, Zhou J J, Zhang Y J. Identification and tissue distribution of odorant binding protein genes in the lucerne plant bug(Goeze)., 2011, 41(4): 254-263.

[34] Pelosi P, Zhou J J, Ban L P, Calvello M. Soluble proteins in insect chemical communication., 2006, 63(14): 1658-1676.

[35] Guo H, Huang L Q, Pelosi P, Wang C Z. Three pheromone- binding proteins help segregation between twospecies utilizing the same pheromone components., 2012, 42(9): 708-716.

[36] Liu N Y, He P, Dong S L. Binding properties of pheromone-binding protein 1 from the common cutworm.:, 2012, 161(4): 295-302.

[37] Zhang T T, Mei X D, Feng J N,Berg B G, Zhang Y J, Guo Y Y. Characterization of three pheromone-binding proteins (PBPs) of(Hübner) and their binding properties., 2012, 58(7): 941-948.

[38] Manoharan M, Chong M N, Vaitinadapoulé A, Frumence E, Sowdhamini R, Offmann B. Comparative genomics of odorant binding proteins inand., 2013, 5(1): 163-180.

[39] Obata T, Koh H S, Kim M, Fukami H. Constituents of planthopper attractant in rice plant., 1983, 18(2): 161-169.

[40] Gora J, Brud W. Progress in synthesis of sensory important trace components of essential oils and natural flavours., 1983, 27(5): 413-428.

[41] 魏明, 鄧曉軍, 杜家緯. 豇豆與菜豆揮發(fā)物中美洲斑潛蠅引誘成分的分析與鑒定. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2005, 16(5): 907-910.

Wei M, Deng X J, Du J W. Analysis and identification of-attractants from cowpea and kidney bean volatiles., 2005, 16(5): 907-910. (in Chinese)

[42] Zhao Y X, Kang L. The role of plant odours in the leafminer(Diptera: Agromyzidae) and its parasitoid(Hymenoptera: Eulophidae): orientation towards the host habitat., 2002, 99: 445-450.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification and function of the OBP13 protein from the leafminer ()

CHEN DongKai1, ZHANG LinYa1,2, XING ZhenLong1, LEI ZhongRen1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Life Science Department, Shangrao Normal College, Shangrao 334001, Jiangxi)

【Objective】The objective of this study is to clone and clarity odorant binding protein gene in the leafminer (), analyze the sequence properties, gene expression, phylogeny and protein function, which would provide a basis for further study of the olfactory mechanism.【Method】The whole coding region of OBP gene fromwas cloned by PCR strategy.Nucleotide sequence was analyzed using DNAMAN and homology comparison was analyzed using BLAST. An evolutionary tree was constructed by MEGA 6.0 to analyze phylogeny. Expression situation ofOBP13 was located by the indirect immuno-fluorescent staining and specific polyclonal antibody which was already prepared. The antenna ofwas embedded, sliced up and observed under laser scanning confocal microscope to study the subcellular distribution of OBP13.【Result】An OBP gene inwas obtained and named as. The accession number in GenBank ID is KT250751. The whole length ofcoding region is 462 bp that encodes a putative protein of 153 amino acids with a molecular mass of 17.80 kD and an isoelectric point of 5.75, and deduced amino acid sequence possesses a putative signal peptide of 17 amino acid residues at the N terminus. There are four conservative cysteine sites in the protein sequence, so that theOBP13 is a Minus-C OBP. Phylogenetic analysis showed that the OBP13 and CcapOBP99a-like were clustered into one branch and had a high homology. According to the expression level in different tissues, the expression level in the antenna was much higher than that in other tissues. The recombinant expression vector was successfully constructed and the recombinant protein of high purity was obtained. After testing combining capacity of 25 odor ligands, it was found thatOBP13 had a good combining capacity with trans-2-hexenal, linalool, 1-octen-3-ol,-ionone, benzothiazole and-ionone, and the dissociation constants were 12.592, 10.995, 11.165, 11.224, 10.336, 9.218 μmol·L-1, respectively. In these 6 kinds of odors, the affinity of-ionone was the strongest. By immunofluorescence localization, it was found that it was mainly located in trichoid sensilla and basiconic sensilla on the crosscut flagellum section, and also in the olfactory pit and the joint of arista and funicular section.【Conclusion】TheOBP13 is a Minus-C OBP which belongs to the atypical OBPs. Expression situation, odorant binding characteristic and immunofluorescence localization showed that OBP13 existed mainly in the antenna ofand involved in the recognition process of odors in green leafed plants. It is presumed that it plays a role in olfactory recognition and host plant location of.

; odorant binding protein; sequence analysis; expression situation; odorant binding characteristic; immunofluorescence localization

2017-08-29；

2017-10-20

國家自然科學(xué)基金（31471769）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（CARS-23-D-08）

陳東凱，E-mail：chendongkai0608@sina.com。

雷仲仁，Tel：010-62815930；E-mail：leizhr@sina.com