黑土細(xì)菌及真菌群落對長期施肥響應(yīng)的差異及其驅(qū)動因素

王慧穎，徐明崗，周寶庫，馬想，段英華

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黑土細(xì)菌及真菌群落對長期施肥響應(yīng)的差異及其驅(qū)動因素

王慧穎1，徐明崗1，周寶庫2，馬想1，段英華1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/耕地培育技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，哈爾濱 150086）

【目的】研究長期施肥對黑土細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)影響差異，探索黑土肥力對長期施用化肥和有機(jī)肥響應(yīng)差異的生物學(xué)機(jī)制，為黑土的肥力培育和合理施肥提供科學(xué)理論依據(jù)?！痉椒ā炕?5年的長期定位施肥試驗(yàn)，采用定量PCR方法和Miseq高通量測序技術(shù)，分析長期不施肥（CK）、氮肥（N）、有機(jī)肥（M）和有機(jī)無機(jī)配施肥（MN）處理下，黑土細(xì)菌及真菌的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異。同時結(jié)合土壤理化性狀，探究不同施肥條件下細(xì)菌和真菌群落變化的環(huán)境驅(qū)動因子?！窘Y(jié)果】N處理對土壤細(xì)菌的數(shù)量沒有顯著影響，但使其群落多樣性降低了13.2%—48.5%。N處理使真菌的數(shù)量增加了24倍，多樣性降低了4.6%—80.3%。與N處理相比，MN處理使細(xì)菌數(shù)量和多樣性分別增加了2倍和7.7%—46.6%，而真菌的數(shù)量雖降低了14.2%，但其多樣性提高了62%—237%。單施氮肥增加了土壤細(xì)菌酸桿菌門（）中的、及變形菌門（）中的的相對豐度，并使土壤真菌中傘菌綱（）的相對豐度增加了41倍。與N處理相比，MN處理下細(xì)菌的各主要類群豐度未發(fā)生顯著變化，但M處理下土壤細(xì)菌中的、和豐度分別顯著降低了26、97和81個百分點(diǎn)，、和的豐度分別顯著增加了11倍、9倍和2倍。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在MN與N處理之間無顯著差異，明顯區(qū)別于CK和M處理，pH為主要驅(qū)動因素，其閾值為6.07；真菌群落結(jié)構(gòu)在CK、M和MN處理下相似，顯著區(qū)別于N處理，兩組處理之間差異由速效鉀含量（125.5 mg·kg-1）驅(qū)動。另外，有機(jī)質(zhì)含量對于細(xì)菌和真菌群落均是重要的驅(qū)動因素，但調(diào)控細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的閾值為28.4 g·kg-1，而驅(qū)動真菌群落結(jié)構(gòu)的閾值為30.8 g·kg-1?！窘Y(jié)論】黑土細(xì)菌對有機(jī)肥的響應(yīng)較強(qiáng)，而真菌對化肥更為敏感。長期施用化肥會刺激土壤中嗜酸細(xì)菌和真菌的生長，而有機(jī)無機(jī)肥配施可提高土壤微生物群落多樣性，刺激有益菌的生長。土壤pH和有效鉀含量分別是調(diào)控細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的重要影響因素，在黑土肥力培育中應(yīng)引起充分的重視。

細(xì)菌；真菌；長期施肥；mesiq測序；qPCR；黑土

0 引言

【研究意義】東北黑土區(qū)是中國商品糧生產(chǎn)基地，其黑土也是全球少有的幾種肥沃土壤之一。但近些年黑土退化嚴(yán)重、土壤肥力下降、土壤酸化及糧食產(chǎn)量降低等問題受到了廣泛關(guān)注。曾有學(xué)者認(rèn)為黑土退化主要由于黑土由自然生態(tài)系統(tǒng)向農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化過程中生態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更重要的是人為非科學(xué)活動所致[1]。向土壤中人為大量輸入外源物質(zhì)，尤其肥料，被認(rèn)為是導(dǎo)致農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性及土壤肥力發(fā)生變化的關(guān)鍵因素[1-2]。微生物通過參與有機(jī)質(zhì)的降解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化以及碳氮磷等的元素循環(huán)從而改善土壤肥力與生產(chǎn)力[3-4]。同時作為土壤中重要的生命有機(jī)體，微生物生物學(xué)特性和群落結(jié)構(gòu)與土壤質(zhì)量有密切關(guān)系，它們對生存環(huán)境的改變極其敏感，微生物數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)等均能作為判斷土壤健康狀況的重要指標(biāo)[5]。另外，微生物群落結(jié)構(gòu)的演變是一個漫長的過程，很多驅(qū)動微生物群落響應(yīng)的過程會隨施肥年限增強(qiáng)或減弱[6]。因此，研究長期定位施肥下的微生物群落變化及其驅(qū)動因素對提升黑土肥力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)菌和真菌是土壤中主要的兩大微生物類群[7]。近些年關(guān)于長期施肥對土壤微生物群落變化的影響及其驅(qū)動因素的研究大都集中在細(xì)菌[8-10]，對于真菌及其與細(xì)菌之間的關(guān)系在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，尚有待進(jìn)一步探索。真菌細(xì)胞中的碳氮比（C/N）遠(yuǎn)高于細(xì)菌細(xì)胞，需要從土壤環(huán)境中攝取更多有機(jī)物質(zhì)作為碳源的營養(yǎng)來源，因此較細(xì)菌群落更容易影響土壤肥力[11-12]。另外，土壤的有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等重要過程主要由細(xì)菌和真菌共同完成，如土壤中大多數(shù)復(fù)雜、難分解的有機(jī)質(zhì)的分解由真菌完成，而簡單、易被分解的有機(jī)質(zhì)由細(xì)菌分解[13-14]。同時，細(xì)菌與真菌在養(yǎng)分利用中還存在協(xié)作和競爭等關(guān)系。在養(yǎng)分匱乏的土壤環(huán)境中，真菌的菌絲有利于提高并均衡土壤中的養(yǎng)分，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌的生長代謝[15-17]。近年來，ZHOU等[7,18]、秦杰等[19]等應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究了化肥對黑土區(qū)細(xì)菌和真菌群落的影響，且取得了突破性進(jìn)展，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)長期施用化肥導(dǎo)致黑土細(xì)菌和真菌群落發(fā)生了顯著變化，氮肥導(dǎo)致黑土從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，且高量化肥對細(xì)菌和真菌的影響比低量化肥的影響更顯著。然而，之前的研究主要分析了細(xì)菌和真菌群落對不同化肥施用量的響應(yīng)，但其對有機(jī)肥和混施肥的響應(yīng)及其主要驅(qū)動因素，尚缺乏深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】長期施用化肥可降低土壤pH進(jìn)而顯著影響細(xì)菌與真菌群落[17-18]，而有機(jī)肥料的施用不僅向土壤中接種了大量的外源微生物直接影響土壤微生物[20]，且為微生物生長提供碳源和能源，其養(yǎng)分的緩慢釋放還可為微生物提供更穩(wěn)定的棲息環(huán)境[8-10]，進(jìn)而間接影響微生物群落。然而，長期化肥和有機(jī)肥處理下，黑土細(xì)菌和真菌群落的響應(yīng)差異，尤其是不同施肥影響了哪些關(guān)鍵菌群，進(jìn)而調(diào)控了土壤養(yǎng)分循環(huán)，亟需進(jìn)行深入分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文基于黑土上連續(xù)35年的長期定位施肥試驗(yàn)，采用定量PCR和Miseq高通量測序方法，探究細(xì)菌和真菌的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和多樣性對長期施用不同肥料的響應(yīng)差異，并結(jié)合土壤理化性狀揭示其驅(qū)動因素，以期闡明不同施肥管理措施影響黑土肥力的生物學(xué)機(jī)制，為黑土的肥力培育和合理施肥提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間和地點(diǎn)

長期定位施肥試驗(yàn)設(shè)于農(nóng)業(yè)部哈爾濱黑土生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗(yàn)區(qū)內(nèi)（N 45°40′，E126°35′），該區(qū)屬于典型的季風(fēng)性氣候，年平均降雨量為575 mm，年平均蒸發(fā)量為1 315 mm，年平均氣溫為3.0℃。未開展試驗(yàn)前，土壤pH和有機(jī)質(zhì)（SOM）的初始值分別為7.45和27.0 g·kg-1；全氮（TN）、全磷（TP）和全鉀（TK）的初始值分別為1.48 g·kg-1、1.07 g·kg-1和25.3 g·kg-1；堿解氮（AN）、速效磷（AP）和速效鉀（AK）分別為149.2 mg·kg-1、51 mg·kg-1和210 mg·kg-1。試驗(yàn)設(shè)于1979年，始于1980年并按小麥-大豆-玉米進(jìn)行輪作，且為一年一熟制。試驗(yàn)共設(shè)8個處理，3次重復(fù)，每個小區(qū)面積36 m2（9 m×4 m），各重復(fù)隨機(jī)區(qū)組排列。本試驗(yàn)選取其中4種典型處理進(jìn)行研究：不施肥（CK）、單施化學(xué)氮肥（N）、單施有機(jī)肥（M）、化學(xué)氮肥和有機(jī)肥混合施用（MN），其中化學(xué)氮肥為尿素，其施用量在大豆茬為75 kg·hm-2，在小麥和玉米茬的施用量均為150 kg·hm-2；有機(jī)肥為純馬糞（有機(jī)質(zhì)28.2%，氮素0.473%，磷0.458%，鉀0.63%），每輪作周期在玉米根茬施用一次，其用量為18 600 kg·hm-2。

1.2 試驗(yàn)材料

土壤樣品為2014年10月所采集的耕層土壤（0—20 cm），每個處理的每個重復(fù)隨機(jī)采9個點(diǎn)，混勻成1個樣品，且每個重復(fù)采集2個土壤樣品。剔除土樣中的石粒和植物殘根等雜物，裝入無菌封口袋后暫時貯存在低溫冰盒中，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；過2 mm篩后的土樣分成兩部分，一部分風(fēng)干處理，用于土壤理化性狀分析；另一部分保存在-80℃冰箱，用于土壤DNA的提取。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤理化性狀分析 土壤pH采用1﹕2.5的水土比、復(fù)合電極測定；有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱方法測定；全氮采用半微量凱氏定氮法；全磷全鉀采用硫酸-高氯酸消煮后分別用鉬銻抗比色法和火焰光度計(jì)法測定；速效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀采用HF-HClO4消煮-火焰光度計(jì)法；銨態(tài)氮及硝態(tài)氮用KCl浸提后利用流動分析儀測定；堿解氮采用擴(kuò)散法測定，即用堿液處理樣品，硼酸吸收后以標(biāo)準(zhǔn)酸滴定。以上測定方法均參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[21]。

1.3.2 土壤DNA的提取及qPCR，Meiseque分析 用Powersoil DNA Isolation Kit（MoBio Labories，Carlsbad，CA，USA）試劑盒從0.25 g土壤樣品中提取60 μl DNA。避免提取過程中的誤差，利用DNeasy Tissue kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）將得到的DNA進(jìn)行純化。根據(jù)260/280-nm和260/230-nm吸收比例，用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)（NanoDrop，ND2000，Thermo Scientific，111 Wilmington，DE）測定土壤DNA的質(zhì)量。以341F（5′-CCTACGGGNG GCWGCAG-3′）和 805R（5′- GACTACHVGGGTATC TAATCC-3′）為DNA引物擴(kuò)增代表細(xì)菌的16S rRNA序列[22]；以為ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC -3′）和ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′）DNA引物擴(kuò)增定代表真菌的ITS rRNA序列[23-24]。利用ABI Real-Time 7500 System（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）及SYBR Green（FasteFire Qpcr Premix，TIANGENBIOTECH，China）進(jìn)行qPCR的克隆擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件見表1。利用Minipre Kit（Qiagen，Germantown，MD，USA）得到所需的質(zhì)粒DNA，并以此拷貝數(shù)及2＞0.99為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，且每個被測DNA樣品設(shè)置3次重復(fù)。

采用Illumina Miseque Platform System的Miseque 高通量測序方法測定代表真菌和細(xì)菌的ITS和16S序列。對于得到的高通量序列的結(jié)果，首先去除測定序列中的雜質(zhì)，然后以10 bp的barcodes及引物序列為標(biāo)準(zhǔn)對序列進(jìn)行修剪。在分析過程中，去除長度小于200 bp和包含未被處理的核酸序列；隨后，真菌和細(xì)菌的每條序列分別在以SRX766215和SRX1032809為檢索號的NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行匹對。最后，分別得到24個樣品的8 703—9 820條不等的真菌序列和10 405—13 642條不等的細(xì)菌序列；將每個樣品的真菌和細(xì)菌序列統(tǒng)一純化為8 703和10 405條。以97%的序列相似度為標(biāo)準(zhǔn)，將所有序列組成不同的可操作單元（OTUs）；最后得到代表真菌序列的837個OTUs，代表細(xì)菌序列的5 075個OTUs。以85%的置信水平為標(biāo)準(zhǔn)，利用Ribosomal Database Project（RDP）平臺將每個代表序列的OTU進(jìn)行物種匹對，得到每個OTU所代表的物種。

表1 定量PCR反應(yīng)條件

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 將qPCR反應(yīng)得到的ITS rRNA及16S rRNA基因拷貝數(shù)取log后的值作為細(xì)菌和真菌的相對數(shù)量，二者拷貝數(shù)的比例作為真菌和細(xì)菌的數(shù)量比（F/B）。細(xì)菌和真菌的α-多樣性通過計(jì)算Chao1，香農(nóng)（Shannon）和辛普森（Inv_Simpson）指數(shù)獲得。原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)EXCEL2007軟件處理，隨后采用SPSS16.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）的描述統(tǒng)計(jì)（Descripitive Statistics）將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；利用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan方法對不同施肥處理的土壤理化性狀、微生物數(shù)量和多樣性、每種菌的豐度進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)；采用R語音軟件的2.15.3版本對不同施肥處理間的OTUs及土壤因子進(jìn)行對應(yīng)分析（CA）和多元回歸樹（MRT）分析。以上所有分析的顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 長期不同施肥對土壤理化性狀及作物產(chǎn)量的影響

所有施肥處理均顯著提高了土壤中除有效鉀外的養(yǎng)分含量（表2）。在施肥處理中，所有養(yǎng)分含量均為MN處理最高。與N處理相比，土壤的SOM、TN、AN、AP和AK含量在MN處理中分別顯著增加了17%、17%、19%、263%和16%；與M處理相比，土壤的SOM、TN、AN、AP和AK含量在MN處理下分別顯著增加了15%、21%、41%、195%和12%。土壤pH值在施用化肥的處理（MN和N）下較CK處理顯著降低了1.2—1.4個單位，而在只施用有機(jī)肥處理下未顯著變化。一輪作周期內(nèi)作物的年均產(chǎn)量在MN和N處理下最高，M處理其次，在不施肥處理最低。

表2 長期不同施肥下黑土的理化性狀及產(chǎn)量

1）產(chǎn)量代表輪作一周期內(nèi)三種作物產(chǎn)量的均值，即當(dāng)年大豆產(chǎn)量與之前兩年作物（玉米和小麥）的均值；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間土壤的理化性狀及作物產(chǎn)量差異達(dá)到顯著水平（＜0.05）

1）Yield indicated the average value of three typical crop yields during a latest rotation system; Values followed by lowercases in the same column mean significant differences in soil properties and crop yield between treatments (＜0.05)

2.2 長期不同施肥下細(xì)菌和真菌的數(shù)量及多樣性

由表3可見，細(xì)菌數(shù)量和真菌數(shù)量均在M處理下最高。與CK、N和MN處理相比，M處理的細(xì)菌數(shù)量分別顯著增加了2.74倍、4.20倍和0.91倍，真菌數(shù)量分別顯著增加了50倍、1.04倍和1.38倍（＜0.05）。與CK處理相比，N處理的細(xì)菌數(shù)量無顯著差異，但真菌數(shù)量顯著增加了24倍（＜0.05）。細(xì)菌數(shù)量在MN處理下較N處理下顯著增加了1.72倍，而真菌數(shù)量在MN與N之間沒有顯著差異。真菌與細(xì)菌相對數(shù)量比（F/B）在N處理最高，其次為MN和M處理，CK處理最低。

香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Inv_Simpson）和Chao1指數(shù)均是表征微生物α-多樣性的指標(biāo)，其值越高表示微生物多樣性越高。細(xì)菌的多樣性指數(shù)在4個處理中差異顯著，香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和Chao1指數(shù)的變化趨勢為：M≥CK＞MN＞N，其中混施肥MN處理比N處理的α-多樣性提高了7.7%—46.6%。真菌的α-多樣性指數(shù)在CK、MN和M處理中無顯著差異，且較N處理的α-多樣性指數(shù)顯著提高了28.9%—237.3%（＜0.05）。

2.3 長期不同施肥下細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)

圖1是分別以組成24個土樣細(xì)菌和真菌的5 076和837個OTUs數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)得出的對應(yīng)分析（CA）結(jié)果。CA1軸可解釋65.8%細(xì)菌和61.5%真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，且其群落結(jié)構(gòu)和組成在不同施肥處理間差異較大。黑土細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均在CK處理與M處理相似，并在CA1軸上與施N處理分開。細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)對長期混施肥MN處理的響應(yīng)卻不一致，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在MN處理下與N處理下相似，共同位于CA1軸的右半軸；而MN處理下的真菌群落處于CA1軸中間，在CA2軸明顯與其他3個處理分開。

表3 長期不同施肥下黑土的細(xì)菌和真菌數(shù)量及其多樣性

同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間土壤的微生物指標(biāo)差異達(dá)到顯著水平（＜0.05）

Values followed by lowercases in the same rows mean significant differences between treatments (＜0.05)

圖1 長期不同施肥對土壤細(xì)菌群落及真菌群落結(jié)構(gòu)影響的對應(yīng)分析（CA）

長期不同施肥處理下，在綱水平相對豐度大于2%的細(xì)菌有16個，綱水平相對豐度大于3%的真菌有9個，圖2分別為這些細(xì)菌的相對豐度和真菌的相對豐度。與CK處理相比，M處理的各細(xì)菌相對豐度未發(fā)生顯著變化；而MN和N處理的土壤酸桿菌（）中的和及α-變形菌綱（）均顯著增加（＜0.05），其中MN處理使得它們分別增加了36倍、4.3倍和0.35倍，N處理使得它們分別增加了11倍、3.1倍和0.52倍。同時，MN處理的_、和浮霉菌綱（）的豐度顯著比CK處理下降低了75%、75%和28%，但顯著比N處理下提高了262%、147%和27%。

在9種主要綱水平的真菌中，傘菌綱（）的相對豐度在各處理中的差異最顯著，其變化趨勢為：N＞MN＞M＞CK，且在N處理的真菌群落中的相對豐度高達(dá)70%，比在CK處理下提高了41倍；糞殼菌（）和毛霉菌（）在M和CK處理下的豐度最高，其次為MN，N處理中最低。

圖2 長期不同施肥下細(xì)菌和真菌的主要群落組成

2.4 土壤養(yǎng)分含量與細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

不同處理中，MN和N處理的作物產(chǎn)量與土壤養(yǎng)分含量均處于較高水平（表2），且二者的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均與CK處理有顯著差異（圖1，圖2）。因此，表4分析了與CK處理相比，MN和N處理具有相同顯著變化趨勢的綱水平細(xì)菌和真菌的豐度與土壤理化性狀的相關(guān)性。表中所有細(xì)菌和真菌的相對豐度均與土壤pH呈極顯著相關(guān)關(guān)系（＜0.01），其中、、和與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)；、、和與pH呈極顯著正相關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)土壤養(yǎng)分（除AK外）含量均與豐度呈顯著正相關(guān)（＜0.05）；SOM、AN、NH4+和NO3-含量與中的、呈顯著正相關(guān)，與、呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。真菌中豐度與NH4+含量呈顯著正相關(guān)，而和與AN、NH4+和NO3-含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。

表4 長期施肥下顯著變化的細(xì)菌或真菌豐度與土壤理化性狀之間的相關(guān)分析

綱水平菌：與CK相比，MN和N處理下具有相同顯著變化趨勢的細(xì)菌和真菌。其中“↑”或“↓”代表此物種的豐度在MN和N處理下均顯著提高或降低。“**”和“*”代表顯著性水平分別為＜0.01和＜0.05，且顯著性水平≥0.05的相關(guān)系數(shù)未列入表中

Class: Compared with CK, bacterial or fungal abundance commonly and significantly changed under MN and N treatments. “↑” or “↓” indicated this species abundance commonly and significantly enhanced or decreased. “**” and “*” indicated difference were significant at the levels of＜0.01 and＜0.05, respectively. Correlation coefficient at the level of≥0.05 was not showed in form

根據(jù)“1SE”準(zhǔn)則，選擇最小交叉驗(yàn)證相對誤差CVRE值[25]將微生物群落進(jìn)行多元回歸分析，以明確驅(qū)動黑土細(xì)菌和真菌群落的主要因子（圖3）。4個處理的細(xì)菌和真菌群落均被分成了3組：CK與M、N和MN。土壤因子對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化的解釋率（2）分別為76.8%和67.3%。細(xì)菌群落的主要驅(qū)動因子為土壤pH值，其閾值為6.07；在pH低于6.07的土壤中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)一步受SOM含量影響，其閾值為28.4 g·kg-1。真菌群落的主要驅(qū)動因子為土壤AK含量，其閾值為125.5 mg·kg-1；在AK含量高于125. 5 mg·kg-1的土壤中，真菌群落結(jié)構(gòu)也受到SOM含量影響，其閾值為30.8 g·kg-1。

3 討論

土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，施肥和肥料類型與土壤微生物的數(shù)量、組成及多樣性的差異緊密相關(guān)[26-27]。本研究結(jié)果表明，長期施用氮肥未顯著改變土壤細(xì)菌數(shù)量，但增加了真菌數(shù)量，因此土壤微生物向F/B值較高的“真菌型”轉(zhuǎn)變（表3），這與前人提出的相比細(xì)菌，真菌更適宜生長在施用化肥的環(huán)境中的結(jié)果一致[18,28]。其原因可能主要有：一是長期施用氮肥導(dǎo)致土壤養(yǎng)分較為單一，不能滿足部分細(xì)菌生長代謝所需，然而，以菌絲生長方式繁殖的真菌能夠利用廣泛分布的菌絲從作物根茬或其他養(yǎng)分源中獲得大量且均衡的養(yǎng)分供自身代謝[17]，因此其生長速度相對較高；二是與適宜生長在pH為7左右且與對土壤pH變化敏感的細(xì)菌相比，真菌對酸化土壤環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)[29]，因此單施化肥更利于真菌的生長。MN處理的細(xì)菌數(shù)量和多樣性均顯著高于N處理，說明化肥配施有機(jī)肥可促進(jìn)細(xì)菌的生長與繁殖[30-31]?？梢娂?xì)菌與真菌的生長與肥料類型密切相關(guān)，調(diào)控肥料類型與比例是協(xié)調(diào)不同類型微生物生長和提高土壤生物肥力的有效途徑。

圖3 驅(qū)動細(xì)菌群落（A）和真菌群落（B）結(jié)構(gòu)變化的土壤因子的多元回歸樹（MRT）分析

與不施肥相比，單施化肥盡管顯著提高了真菌數(shù)量且未顯著影響細(xì)菌數(shù)量，但卻顯著降低了細(xì)菌和真菌的多樣性（表3）。這是由于長期施用氮肥導(dǎo)致pH較低和養(yǎng)分不均衡刺激了嗜酸和嗜氮微生物的生長[28,32]。同時，生物間的競爭性導(dǎo)致其他微生物的生長變慢，甚至消失，因此微生物多樣性降低。此外，真菌在N處理的數(shù)量大于CK處理，而細(xì)菌的數(shù)量在兩個處理中相近，說明嗜氮微生物可能大量存在于真菌群落中，或真菌群落中的嗜氮微生物繁殖速率高于細(xì)菌群落中的嗜氮微生物繁殖速率。與單施化肥（N）相比，施用有機(jī)肥（MN和M處理）顯著提高了細(xì)菌和真菌的多樣性（表3）。這可能是由于有機(jī)肥一方面改善了由于N處理引起的酸化和養(yǎng)分不均衡的土壤環(huán)境[33-34]，有效減緩了嗜氮和嗜酸微生物對其他微生物的抑制作用；另一方面，有機(jī)肥向土壤中輸入了大量的外源微生物[20,35]，從而提高了微生物多樣性。

由于微生物會隨生態(tài)位點(diǎn)及作用底物的差異而發(fā)生變化，故不同施肥處理所引起的土壤環(huán)境變化顯著影響了微生物群落的組成[29-30]。與各處理細(xì)菌的豐度變化相比，真菌的變化程度更大（圖2），尤其是真菌擔(dān)子菌（）中的，其在施肥處理較不施肥處理提高了41倍。多數(shù)屬于叢植菌根真菌，能為作物提供大量養(yǎng)分，促進(jìn)作物生長[36]。且多為腐生菌，能分泌過氧化物酶從而分解和利用土壤中木質(zhì)素、植株殘留物等有機(jī)質(zhì)[37]，與CK處理的低有機(jī)質(zhì)環(huán)境相比，有機(jī)質(zhì)水平較高的施肥處理為提供了生長代謝底物，因此顯著提高了的豐度（表4，圖2）。其中化肥處理顯著提高了的豐度，這與Wang等[38]的結(jié)果一致。我們發(fā)現(xiàn)化肥處理下相對豐度的提高程度比有機(jī)肥處理的提高程度更大，但Wang[38]的結(jié)果卻表明化肥對的影響并不顯著。這可能因?yàn)榈呢S度與土壤pH呈負(fù)相關(guān)，與NH4+呈正相關(guān)[18]（＜0.01，表4），所以長期化肥處理下，Wang等[38]所研究的pH只降低了0.09個單位，而NH4+降低了1 mg·kg-1的潮土環(huán)境對的影響不明顯；而我們所研究的pH顯著降低了1.41個單位，且NH4+提高了2.6 mg·kg-1的黑土環(huán)境更適合的生長。我們推測長期化肥處理的黑土提高了對養(yǎng)分和能源的競爭力，導(dǎo)致其他微生物生長緩慢甚至消失，因此真菌多樣性在N處理下顯著降低，但真菌數(shù)量卻因的大量繁殖而顯著增加。

在細(xì)菌群落中的比例高達(dá)20%，是土壤中主要的細(xì)菌菌群之一，對土壤的養(yǎng)分循環(huán)及微生態(tài)環(huán)境的平衡起著重要作用。JANSSEN等對美國87個土樣的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，、、及為的主要類群[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)這4種酸桿菌綱不僅為的主要類群，而且均對長期施肥有明顯響應(yīng)（圖2）。和在含化肥處理（MN和N）的土壤中顯著高于CK和M處理，而和的變化趨勢則相反。眾多研究表明低pH的土壤環(huán)境更適合生長[39-41]，本研究結(jié)果顯示和與土壤pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01，表4），說明Gp1和Gp3為嗜酸菌，適宜生長在pH較低的土壤中。然而，和與土壤pH呈極顯著正相關(guān)（＜0.01，表4），說明它們可能更適宜生長在偏中性的土壤中。我們的研究結(jié)果中，長期MN和N處理顯著提高了豐度，說明施用氮肥在黑土中可提高的豐度，這與Fierer等[42]的研究結(jié)果一致。同時，豐度與養(yǎng)分呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01，表4），這與前人認(rèn)為變形菌（）為富營養(yǎng)菌[43]的結(jié)果一致，但我們的研究未發(fā)現(xiàn)、這兩種對環(huán)境改變更敏感的變形菌在不同施肥處理中發(fā)生顯著變化，對此值得進(jìn)一步深入的研究。

大量研究結(jié)果表明，土壤pH為陸地生態(tài)系統(tǒng)中影響細(xì)菌和真菌群落變化的關(guān)鍵因子[31,43]。本研究證明了pH不僅是影響黑土細(xì)菌群落的首要因子，且進(jìn)一步提出了引起細(xì)菌群落變化的關(guān)鍵土壤pH閾值為6.07（圖3-A）。長期施用化肥的N和MN處理下，土壤pH降至5.2—5.4，其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著區(qū)別于pH為6.6的CK和M處理（表2，圖3-A）。然而，與以往報(bào)道不同的是，本試驗(yàn)中驅(qū)動真菌群落變化的關(guān)鍵因子為有效鉀（AK），其閾值為125.5 mg·kg-1（圖3）。這可能是由于本研究中土壤pH變化范圍較?。?.2—6.6），真菌群落對此范圍內(nèi)變化的pH并不敏感[31]。而且，在鉀含量較低的N處理下（表2），作物與真菌競爭土壤中的AK，因此較低的AK含量成為N處理下真菌群落的限制因素。但是，同樣處于較低AK水平的M處理中的真菌群落卻未發(fā)生顯著變化。我們推測其原因可能是：與N處理相比，一方面M處理利于真菌從有機(jī)肥中攝取更多的鉀[34,44]，另一方面M處理的作物產(chǎn)量比N處理低，作物與真菌間對AK的競爭變?nèi)酢?/p>

土壤有機(jī)質(zhì)可同時調(diào)控黑土中的真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。作為微生物的能量來源和代謝底物，土壤有機(jī)質(zhì)的含量及其成分顯著影響著微生物的群落組成[8,43]。調(diào)控黑土細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的SOM閾值分別為28.4 g·kg-1和30.8 g·kg-1，這可能由于不同處理下土壤有機(jī)質(zhì)組分的活性不同[45]，且細(xì)菌和真菌群落對有機(jī)質(zhì)的分解利用能力存在差異所致[15,46]。對于真菌來說，作物產(chǎn)量較高的MN處理土壤有機(jī)質(zhì)含量較高，且大量來源于作物根茬，其成分多為復(fù)雜且難被分解的木質(zhì)素等，更易被-策略的貧營養(yǎng)型真菌群落分解利用[15]，故MN處理中的真菌群落顯著區(qū)別于CK和M；對于細(xì)菌來說，有機(jī)肥中除了復(fù)雜有機(jī)物外，還含有大量的半纖維素和蛋白質(zhì)等簡單有機(jī)物，它們更易被-策略的富營養(yǎng)型細(xì)菌群落分解利用[15]，故MN處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著區(qū)別于N處理的細(xì)菌群落。因此，在不同有機(jī)質(zhì)水平下，明確土壤中細(xì)菌和真菌的群落構(gòu)成和主要功能菌的變化，將是下一步的研究重點(diǎn)。

4 結(jié)論

4.1 不同施肥方式通過影響土壤的理化性狀，進(jìn)而影響土壤細(xì)菌和真菌的數(shù)量及群落構(gòu)成。長期施用化肥不會影響黑土中細(xì)菌的數(shù)量，但是降低了其多樣性，其中主要是促進(jìn)了、和的生長，而抑制了、和的生長。長期施用化肥可提高土壤真菌的數(shù)量卻降低了其多樣性，促進(jìn)的生長。對于化肥配施有機(jī)肥，可顯著提高土壤細(xì)菌的數(shù)量，并提高細(xì)菌和真菌的多樣性。施用化肥可刺激土壤中真菌的生長，而有機(jī)肥對細(xì)菌的作用更加明顯。

4.2 驅(qū)動黑土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的首要因素是土壤pH，其閾值為6.07，這也是施用化肥土壤（N和MN的pH分別為5.2和5.4）的群落結(jié)構(gòu)與不施肥或僅施用有機(jī)肥的土壤（pH均為6.6）的群落結(jié)構(gòu)差異較大的原因。土壤有效鉀含量對于調(diào)節(jié)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)起著重要作用。土壤有機(jī)質(zhì)含量對于細(xì)菌和真菌群落均起到重要的調(diào)節(jié)作用，但是其調(diào)控閾值不同。

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（責(zé)任編輯 李云霞）

Response and Driving Factors of Bacterial and Fungal Community to Long-Term Fertilization in Black Soil

WANG HuiYing1, XU MingGang1, ZHOU BaoKu2, MA Xiang1, DUAN YingHua1

(1Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences /National Engineering Laboratory for Improving Quality of Arable Land, Beijing 100081;2Soil and Fertilizer Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086)

【Objective】This study was conducted to explore the bacterial and fungal community responses to long-term chemical fertilizer and manure application, and thus to clarify the biological mechanism of fertilization on soil fertility in black soils. It aims to provide a theoretical support for rational application of fertilizer and black soil fertility improvement. 【Method】The study was conducted on the long-term fertilization (35 years) experiment at Harbin, China. Soil samples were collected from the following four treatments: control, non-fertilization (CK), chemical nitrogen fertilizer (N), manure only (M) and M plus N (MN). Miseq pro-sequencing and qPCR technology were used to find out the difference between bacterial and fungal communities. In combination with soil properties, we analyzed the driving factors for bacterial and fungal community by multivariate statistical analysis. 【Result】Compared with CK, N treatment significantly decreased bacterial diversity and fungal diversity by 13.2%-48.5% and 4.6%-80.3%, respectively, while fungal abundance was increased by 24 times. Applied manure to N fertilization enhanced bacterial abundance and bacterial diversity by 2 times and 7.7%-46.6%, respectively. However, fungal quantity was declined by 14.2% and fungal diversity was increased by 62%-237%, comparing MN with N only fertilizer. In comparison with CK, the abundance of_,and-(bacterial classes) were significantly increased, and(fungal class) even was enhanced by 41 times with the addition of N. Compared with N treatment, the bacterial abundance kept constant for MN treatment, while the abundance of α-Proteobacteria,_andwere decreased, and_,andwere increased for M treatment. Bacterial community structure for MN and N treatments appeared similar, which were significantly different from CK and M treatments. Fungal community structure for CK, M and MN treatments were similar and significantly different from N treatment. Soil pH (6.07) and available potassium (125.5 g·kg-1) were the principal factors for the difference of bacterial community and fungal community, respectively. Soil organic matter explained both bacterial and fungal community structure alternations while the criteria was different as 28.4 g·kg-1for bacteria and 30.8 g·kg-1for fungi. 【Conclusion】Therefore, our results indicate that bacteria was sensitive to the manure, and fungi was sensitive to N fertilizer application. Long term N application stimulated the growth of acidophilic microbe, while addition of manure to N enhanced microbial diversity and promoted the growth of beneficial microorganism. Soil pH and available potassium were the principal factors driving bacterial and fungal community structure, respectively. Further detailed study is required on this aspect for the improvement of black soil quality.

bacteria; fungi; long-term fertilization; Mesiq pro-sequencing; qPCR; black soil

2017-08-07；

2017-09-25

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）（2015CB150505）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200301）、國家自然科學(xué)基金（41471247）

王慧穎，E-mail：15201530612@163.com。

段英華，E-mail：duanyinghua @caas.cn