耐冷嗜酸硫桿菌的生長特性和固定化培養(yǎng)

陳 鵬 王清良 胡鄂明 李 乾 劉天印 陳 寬

(1.南華大學(xué)核資源工程學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

浸鈾菌種多為中溫菌，最適宜的生長溫度為25～40 ℃[1-3]。因而，在新疆地區(qū)進(jìn)行細(xì)菌浸鈾就面臨著巨大的挑戰(zhàn)。李聰?shù)萚4]對新疆伊犁河谷地區(qū)近50 a來的氣候研究表明：該地區(qū)春季平均氣溫為9.9 ℃，夏季平均氣溫為20.5 ℃，秋季平均氣溫為8.6 ℃，冬季平均氣溫為-7 ℃。另據(jù)現(xiàn)場觀測，伊犁河谷地區(qū)某鈾水冶車間吸附尾液溫度在10～17 ℃，中溫菌在此類尾液中會出現(xiàn)生長活性不高，氧化Fe2+速率慢等情況，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)細(xì)菌生長和繁殖停止等問題，以至于細(xì)菌浸鈾技術(shù)未能在新疆酸法地浸采鈾礦山推廣應(yīng)用。

針對上述問題，本試驗(yàn)采用耐冷嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillusferrivorans簡稱A.ferrivorans)作氧化劑，該菌具有好氧嗜酸特性，可在5～30 ℃生長繁殖[5-6]。M.Liljeqvist等[7]指出，A.ferrivorans是一種嗜酸菌，通過氧化Fe2+和硫化物獲取能量，并從二氧化碳獲得有機(jī)碳。A.Amouric等[8]對A.ferrivorans的運(yùn)動性、鞭毛的有無、基因差異性等特征進(jìn)行了詳細(xì)研究。S.Christel等[9]利用RNA轉(zhuǎn)錄測序揭示了A.ferrivorans對無機(jī)硫化合物的氧化途徑。C.González等[10]通過基因組分析了A.ferrivorans的遺傳變異性，為細(xì)菌應(yīng)用于生物冶金以及含硫廢水的處理提供理論依據(jù)。Pinar Aytar等[11]從某礦山酸性廢水中分離純化了一株嗜酸硫桿菌，經(jīng)16S rRNA基因測序和做系統(tǒng)發(fā)育樹，得出該菌是一株A.ferrivorans，并且具有較強(qiáng)的脫硫效果以及氧化Fe2+能力。R.Ccorahua 等[12]從秘魯某銅礦山酸性礦坑中分離純化出一株A.ferrivorans，并研究了該菌浸礦的最適宜溫度、pH以及生長動力學(xué)，表明該菌具有較好的應(yīng)用前景。劉敏瑞等[13]采用16S rRNA 基因、RubisCO功能基因序列分析篩選來自新疆富蘊(yùn)縣的A.ferrivorans，表明A.ferrivorans與其棲息環(huán)境有一定的聯(lián)系。余水靜等[14]利用生物信息學(xué)方法鑒定和分析了一株A.ferrivorans的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)結(jié)構(gòu)特征，表明A.ferrivorans具有嗜酸硫桿菌共有的TCS功能，如氮素固定及代謝調(diào)節(jié)、檸檬酸蘋果酸代謝調(diào)節(jié)等，而特有的TCS功能涉及趨化性調(diào)控、重金屬響應(yīng)等。趙永紅等[15]利用生物信息學(xué)方法挖掘出A.ferrivorans與其他嗜酸硫桿菌共49個(gè)抗砷基因，發(fā)現(xiàn)一些抗砷基因?yàn)槭人崃驐U菌所共有，說明這類基因是嗜酸硫桿菌抗砷所必需的基因，有助于A.ferrivorans適應(yīng)極端環(huán)境。莫曉蘭等[16]通過對4株菌種在高氟環(huán)境下進(jìn)行馴化，選育出了一株具有較高耐氟能力的菌種，運(yùn)用16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)分析表明：該菌與A.ferrivorans菌相似度達(dá)到99%，并且具有較強(qiáng)的抗氟性和嗜鐵性，A.ferrivorans菌將在含氟鈾礦石的生物浸出中發(fā)揮重要作用。

目前，國內(nèi)外雖有對A.ferrivorans性能研究的相關(guān)報(bào)道，但多集中于該菌耐受機(jī)理的理論研究，而A.ferrivorans菌作為酸法地浸鈾礦山氧化劑的研究卻鮮有報(bào)道。試驗(yàn)參照新疆某酸法地浸采鈾礦山吸附尾液溫度、pH以及生產(chǎn)工藝條件，初步研究了A.ferrivorans菌氧化Fe2+的特性，并在現(xiàn)場進(jìn)行細(xì)菌的耐酸馴化，首次采用耐酸性強(qiáng)、比表面積大、直徑為3～5 mm的生物陶粒作為浸鈾細(xì)菌掛膜載體，對細(xì)菌進(jìn)行固定化培養(yǎng)，提高單位體積的細(xì)菌數(shù)量，從而加快細(xì)菌連續(xù)氧化Fe2+速率，為A.ferrivorans菌代替中溫菌在低溫和高酸環(huán)境下作氧化劑提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及儀器

A.ferrivorans和A.ferrooxidans均來自于南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，9K培養(yǎng)基試劑和FeSO4·7H2O購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，吸附尾液取自新疆中核天山鈾業(yè)有限公司某廠水冶車間，耐酸生物陶粒購自滎陽綠錦活性炭有限公司，IS-RDD3臺式恒溫振蕩器購自美國精騏有限公司，有機(jī)玻璃生物反應(yīng)器(圖1)為自制。

圖1 生物反應(yīng)器

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌氧化Fe2+的活性表征

A.ferrivorans和A.ferrooxidans在生長和繁殖過程中，作為電子傳遞鏈上的各種細(xì)胞色素都具有特定的氧化還原電位，隨著Fe3+濃度的升高，培養(yǎng)液的氧化性隨之增強(qiáng)，并且細(xì)菌以氧化Fe2+成Fe3+作為主要代謝途徑，即細(xì)菌氧化Fe2+的速率與細(xì)菌的生長速率存在正相關(guān)關(guān)系[17]。所以細(xì)菌的活性通過測定培養(yǎng)液的氧化還原電位以及Fe2+的氧化速率來表征。

2.2 分析方法

試驗(yàn)用重鉻酸鉀滴定法測定培養(yǎng)液的Fe2+濃度，分析步驟及方法參見文獻(xiàn)[16]；用pH計(jì)(pHS-3C)測定培養(yǎng)液的pH、氧化還原電位(簡稱Eh)。

2.3 培養(yǎng)基成分與菌種活化

試驗(yàn)所用9K培養(yǎng)基成分見表1，用2 mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH,另據(jù)條件試驗(yàn)Fe2+濃度要求添加 FeSO4·7H2O。為保證菌種活性，每次條件試驗(yàn)前，需對菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)。取2個(gè)250 mL錐形瓶，分別加入90 mL Fe2+濃度為1 g/L的9K培養(yǎng)基(pH=2.0)以及10 mL的A.ferrivorans或A.ferrooxidans(即按10%的體積分?jǐn)?shù)接種)，測定初始Eh，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，培養(yǎng)至Eh為500 mV左右即可作為接種菌種用于條件試驗(yàn)。

表1 9K培養(yǎng)基成分

2.4 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

取6個(gè)250 mL錐形瓶，按5%、10%、20%、30%、40%、50%接種比例分別加入A.ferrivorans菌液7.5 mL、15 mL、30 mL、45 mL、60 mL、75 mL，再依次加入Fe2+濃度為1 g/L的9K培養(yǎng)基(pH=2.0)142.5 mL、135 mL、120 mL、105 mL、90 mL、75 mL。測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，開始培養(yǎng)，每隔6 h測定Eh及Fe2+濃度，直至Fe2+氧化完全。

2.5 初始Fe2+濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

取3個(gè)250 mL錐形瓶，分別加入初始Fe2+濃度為0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L的9K培養(yǎng)基(pH=2.0)135 mL以及15 mL的A.ferrivorans菌液，測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，開始培養(yǎng)，每隔6 h測定Eh及Fe2+濃度，直至Fe2+被全部氧化。

2.6 溫度對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

取2個(gè)250 mL錐形瓶，分別加入135 mL Fe2+濃度為1 g/L的培養(yǎng)基(pH=2.0)以及15 mLA.ferrivorans或A.ferrooxidans菌液。測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為5 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，開始培養(yǎng)，每隔24 h測定Eh及Fe2+濃度，其他溫度條件(15、25 ℃)按相同方法依次進(jìn)行。

2.7 A.ferrivorans的耐酸馴化

量取300 mL吸附尾液(成分見表2)至錐形瓶中，加入4.5 g濃硫酸和1.5 g FeSO4·7H2O，攪拌至溶解,再加入300 mL的A.ferrivorans菌液。測定初始Eh、pH，置于水浴恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min，開始培養(yǎng)，每隔12 h測定Eh、pH。當(dāng)培養(yǎng)液Eh達(dá)到550 mV左右時(shí)，量取此培養(yǎng)液300 mL作為接種菌液，按上述方法進(jìn)行第二、三、四、五次耐酸馴化。

表2 吸附尾液成分

2.8 A.ferrivorans固定化培養(yǎng)

向裝有5 L生物陶粒的反應(yīng)器中加入2 L Fe2+濃度為1 g/L、pH=2.0的9K培養(yǎng)基，再加入0.4 L的A.ferrivorans菌液，測定初始Eh，調(diào)節(jié)通氣量為 5 L/min，開始培養(yǎng)，每隔1 h測定培養(yǎng)液Eh和Fe2+濃度；待Fe2+氧化完成時(shí)，向反應(yīng)器中加10 g FeSO4·7H2O，當(dāng)Fe2+被完全氧化后，再補(bǔ)加1次 10 g FeSO4·7H2O；為驗(yàn)證細(xì)菌固定化效果，在保證反應(yīng)器中生物陶粒不發(fā)生位置移動的前提下，排盡反應(yīng)器中培養(yǎng)液后，不添加菌液，只加2 L Fe2+濃度為1 g/L、 pH=2.0的9K培養(yǎng)基，測定初始Eh，再調(diào)節(jié)通氣量為5 L/min，培養(yǎng)至Fe2+全部氧化完成，按此方法重復(fù)8次。

細(xì)菌固定化完成后，取少量生物陶粒，加入濃度為4%的戊二醛固定處理，放入溫度為4 ℃的冰箱內(nèi)保存，用于掃描電鏡分析。

2.9 固定化細(xì)菌與游離細(xì)菌氧化Fe2+速率的對比

細(xì)菌固定化培養(yǎng)結(jié)束后，放出反應(yīng)器中的培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液均分成2份備用。放出反應(yīng)器中的一半陶粒，再加入1份備用培養(yǎng)液，記為A培養(yǎng)液；另1份培養(yǎng)液加入未裝填生物陶粒的反應(yīng)器中，記為B培養(yǎng)液，再向A、B培養(yǎng)液中分別加5 g FeSO4·7H2O，測定初始培養(yǎng)液的Eh，均在通氣量為5 L/min下培養(yǎng)，每隔1 h測定Eh和Fe2+濃度，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌在生物陶粒上的固定化效果。

3 試驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

細(xì)菌接種量直接影響培養(yǎng)液中的細(xì)菌基數(shù)，從而影響細(xì)菌的整體增殖速度和氧化Fe2+的速率。接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響見圖2。

從圖2(a)可知，培養(yǎng)液初始電位隨著細(xì)菌接種量的增加而增大，不同培養(yǎng)液中的細(xì)菌都在30 h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，表明接種量對細(xì)菌遲緩期的影響較小。從圖2(b)可知，接種量從5%提高至50%，F(xiàn)e2+濃度下降的速率越來越快，表明培養(yǎng)液氧化Fe2+的速率加快，F(xiàn)e2+的氧化時(shí)間縮短。從代謝產(chǎn)物對細(xì)菌活性的影響[18]以及生產(chǎn)成本考慮，A.ferrivorans的接種量以10%為宜。

3.2 Fe2+初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

對于A.ferrivorans來說，可利用Fe2+氧化成Fe3+過程中產(chǎn)生的能量來維持自身的生長繁殖。Kevin等[6]的研究表明，A.ferrivorans與A.ferrooxidans的DNA染色體的G+C只有4%不同，因此，A.ferrivorans可能類似于A.ferrooxidans，在產(chǎn)能過程中也需要Fe2+將電子傳遞給分子氧，傳遞過程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有質(zhì)子消耗，從而驅(qū)動ATP的合成來維持細(xì)菌的活性[19-20]。圖3為Fe2+初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響結(jié)果。

圖2 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

從圖3可知，氧化還原電位上升的幅度大致相當(dāng)，且Fe2+的氧化速率也大致相當(dāng)，這表明Fe2+的初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響較小，細(xì)菌完全可以在Fe2+含量為0.3～0.5 g/L的吸附尾液中較好地生長和繁殖。

圖3 不同初始Fe2+濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

3.3 溫度對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

溫度對A.ferrivorans與A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影響見圖4。

圖4 溫度對A.ferrivorans與A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影響

從圖4可知，溫度在5～25 ℃時(shí)，2種細(xì)菌氧化Fe2+速率都隨著溫度的升高而加快，A.ferrivorans尤為明顯，說明隨著溫度的升高，細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜流動性隨之變大，這有利于營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)和代謝產(chǎn)物排出胞外，使細(xì)菌的生長繁殖加快，促使細(xì)菌氧化速率增加。在試驗(yàn)溫度條件下，A.ferrivorans培養(yǎng)液中Eh上升的速度和Fe2+的氧化速率均高于A.ferrooxidans培養(yǎng)液。當(dāng)溫度為5 ℃，可能是由于A.ferrooxidans的細(xì)胞膜呈晶格排列，營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸受阻，酶促反應(yīng)停止，導(dǎo)致細(xì)菌幾乎處于停止生長狀態(tài)，而A.ferrivorans能繼續(xù)生長并保持較好的氧化性，主要是因?yàn)樵摼陨砭哂心屠浠蛞约爸舅岷铣芍械奶赜谢蜃謇谠诘蜏丨h(huán)境中生長[21-22]，從文獻(xiàn)[14]也可以推測，A.ferrivorans特有的TCS功能涉及耐冷調(diào)控。A.ferrivorans與A.ferrooxidans在生長繁殖過程中所發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)絕大多數(shù)都是在特定酶催化作用下完成的，每一種酶都有合適的酶促反應(yīng)溫度，溫度的變化影響酶促反應(yīng)率，進(jìn)而影響菌體的活性，結(jié)合新疆酸法地浸鈾礦山所處的氣候條件，A.ferrivorans更適于用作浸鈾的目標(biāo)菌種。

3.4 A.ferrivorans的耐酸馴化

在細(xì)菌生長和繁殖過程中，機(jī)體內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)大多是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)必須在一定的pH范圍內(nèi)進(jìn)行，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)率達(dá)到最高，細(xì)菌生長活性最好，所以培養(yǎng)液的酸堿度是影響細(xì)菌生長活性的重要因素之一。細(xì)菌耐酸馴化試驗(yàn)結(jié)果見圖5，圖中1～5代表馴化次數(shù)。

圖5 A.ferrivorans耐酸馴化試驗(yàn)

從圖5(a)可知，A.ferrivorans第1次耐酸馴化時(shí)，細(xì)菌緩慢生長期較長，約為96 h；隨著馴化次數(shù)增加，緩慢生長期縮短，對數(shù)生長期提前，細(xì)菌耐受酸的能力明顯增強(qiáng)。表明A.ferrivorans在酸度較高的培養(yǎng)液中形成越來越完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)能高度有序進(jìn)行。從圖5(b)可知，當(dāng)培養(yǎng)液pH=0.31時(shí)，A.ferrivorans仍能保持較好的生長活性和氧化性，這也表明，A.ferrivorans經(jīng)耐酸馴化后，完全適應(yīng)酸法地浸采鈾礦山吸附尾液環(huán)境。

3.5 A.ferrivorans固定化培養(yǎng)

在自然界中，細(xì)菌往往并不是以游離態(tài)存在和生長繁殖，而是會成群吸附到固體表面，共同分泌以多糖、蛋白質(zhì)和DNA為主要成分的黏液到細(xì)胞外，形成多層有序的群體結(jié)構(gòu)——能把自己包裹起來的生物膜。生物膜上分布有許多微小孔道，有利于營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入膜內(nèi)、代謝產(chǎn)物排出膜外，維持整個(gè)生物膜內(nèi)細(xì)菌群體的生長和繁殖[23]。在適宜的生長環(huán)境下，A.ferrivorans菌也有形成生物膜的特點(diǎn)。

A.ferrivorans固定化培養(yǎng)試驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液溫度為19～20 ℃，試驗(yàn)結(jié)果見圖6、圖7，圖6中的1～10代表固定化培養(yǎng)次數(shù)。

圖6 A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化培養(yǎng)

從圖6可知，對細(xì)菌進(jìn)行第2次固定化培養(yǎng)時(shí)，F(xiàn)e2+的氧化速率約為第1次的2倍，這是由于在第1次固定化培養(yǎng)后，在不更換培養(yǎng)基的情況下，直接補(bǔ)加2次FeSO4·7H2O進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，在此期間，可能生物膜在陶粒表面已初步形成，從而加快了氧化速率。為驗(yàn)證細(xì)菌是否形成生物膜，從第2次開始，只添加培養(yǎng)基未添加菌液，隨著培養(yǎng)液更換次數(shù)的增加，反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌氧化等量Fe2+的速率也逐步增大，至第8次開始穩(wěn)定在3 h左右。表明陶粒表面生物膜逐漸生成，膜內(nèi)細(xì)菌的生長和繁殖隨之加快，并且從第8次起，細(xì)菌在生物膜內(nèi)生長和繁殖開始趨于穩(wěn)定，氧化Fe2+的速率穩(wěn)定在0.33 g/(Lh)左右。

圖7 生物陶粒表面掛膜前后SEM圖像

從圖7(a)可知，生物陶粒表面比較粗糙，分布著不規(guī)則的紋理狀結(jié)構(gòu)和發(fā)育良好的孔隙，這為A.ferrivorans的附著提供了充足的場所，對比圖7(a)，從圖7(b)可以看出，生物陶粒表面形成了較厚且不均勻的生物膜，生物膜上可見利于細(xì)菌代謝產(chǎn)物排出和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入的微孔[24-25]，這些微孔也為細(xì)菌進(jìn)出生物膜提供了通道。

3.6 固定化細(xì)菌與游離態(tài)細(xì)菌氧化Fe2+活性對比

通過固定化細(xì)菌與游離態(tài)細(xì)菌氧化速率對比試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證A.ferrivorans生物膜形成后氧化Fe2+的效果，結(jié)果見圖8。

從圖8可知，A培養(yǎng)液中Eh上升的速度和細(xì)菌氧化速率明顯高于B培養(yǎng)液,表明固定化細(xì)菌和游離態(tài)細(xì)菌協(xié)同氧化Fe2+的速率高于游離態(tài)細(xì)菌單獨(dú)氧化的速率，即A.ferrivorans在生物陶粒上進(jìn)行固定化培養(yǎng)有利于加快Fe2+的氧化速率，有助于解決以往細(xì)菌浸鈾過程中Fe2+氧化速率較慢的問題。

4 結(jié) 論

(1)接種量對A.ferrivorans的緩慢生長期影響較小，考慮時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，A.ferrivorans的接種量宜為10%左右；Fe2+的初始濃度為0.3～0.5 g/L時(shí)，對細(xì)菌的生長活性影響較小，表明吸附尾液中Fe2+含量為0.3～0.5 g/L能滿足A.ferrivorans較快生長繁殖。

圖8 A.ferrivorans固定化培養(yǎng)后氧化Fe2+速率對比試驗(yàn)

(2)溫度為5～25 ℃時(shí)，A.ferrooxidans的最大氧化速率為0.018 g/(Lh)，A.ferrivorans為0.024 g/(Lh)，與A.ferrooxidans相比，A.ferrivorans更適應(yīng)新疆酸法地浸鈾礦山尾液的低溫環(huán)境。

(3)A.ferrivorans經(jīng)多次耐酸馴化，細(xì)菌能在高酸(pH=0.31)培養(yǎng)液中保持較好的生長活性，滿足現(xiàn)場生產(chǎn)工藝要求。

(4)A.ferrivorans經(jīng)過多次固定化培養(yǎng)，陶粒表面生物膜逐漸生成，氧化Fe2+速率持續(xù)加快，最大氧化速率達(dá)到0.33 g/(Lh)，固定化細(xì)菌和游離態(tài)細(xì)菌協(xié)同氧化等量Fe2+的速率是游離態(tài)細(xì)菌單獨(dú)氧化的3.4倍，A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化，大幅提高了氧化Fe2+的速率。

[1] 王清良，胡凱光，劉迎九，等.伊寧鈾礦512礦床地浸中細(xì)菌代替雙氧水初步試驗(yàn)研究[J].鈾礦冶，1999(4)：262-268.

Wang Qingliang，Hu Kaiguang，Liu Yingjiu，et al.The study on bacteria instead of H2O2for in-situ leaching uranium at.512 deposit of yining uranium mine[J].Uranium Mining and Metallurgy，1999(4):262-268.

[2] 王清良，劉選明.pH值與溫度對氧化亞鐵硫桿菌氧化Fe2+影響的研究[J].礦冶工程，2004(2):36-38.

Wang Qingliang，Liu Xuanming.Effects of pH and Temperature onthiobacillusferrooxidansoxidation of Fe2+[J].Mining and Metallurgical Engineering,2004(2):36-38.

[3] 王清良，胡鄂明，余潤蘭，等.細(xì)菌低溫馴化及其浸出砂巖型鈾礦試驗(yàn)研究[J].礦冶工程，2011(6):6-8.

Wang Qingliang，Hu Eming，Yu Runlan，et al.Low-temperature bacteria domestication and leaching of sandstone-type refractory uranium ore[J].Mining and Metallurgical Engineering，2011(6):6-8.

[4] 李 聰，曹占洲，丁 林，等.新疆伊犁河谷地區(qū)50 a來氣候變化特征分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(5):508-514.

Li Cong，Cao Zhanzhou，Ding Lin，et al.Climate change characters in recent 50 years in Yili Valley Xinjiang[J].Journal of Shanxi Agricultural Sciences，2012(5):508-514.

[5] 辛明秀，馬延和.嗜冷菌和耐冷菌[J].微生物學(xué)通報(bào)，1999(2):155.

Xin Mingxiu，Ma Yanhe.PsychroplilesandPsychrotrophs[J].Microbiology China，1999(2):155.

[6] Hallberg K B，Gonzáleztoril E，Johnson D B.Acidithiobacillusferrivorans,sp.nov.;facultatively anaerobic，psychrotolerant iron-,and sulfur-oxidizing acidophiles isolated from metal mine-impacted environments[J].Extremophiles Life Under Extreme Conditions,2010(1):9-19.

[7] Liljeqvist M，Valdes J，Holmes D S，et al.Draft genome of the psychrotolerant acidophileAcidithiobacillusferrivoransSS3[J].Journal of Bacteriology，2011(16):4304-4305.

[8] Amouric A，Brochierarmanet C，Johnson D B，et al.Phylogenetic and genetic variation among Fe(II)-oxidizingacidithiobacillisupports the view that these comprise multiple species with different ferrous iron oxidation pathways[J].Microbiology，2011(1):111-122.

[9] Christel S，F(xiàn)ridlund J，Watkin E L，et al.AcidithiobacillusferrivoransSS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8°C suggesting it is a eurypsychrophile[J].Extremophiles Life Under Extreme Conditions，2016(6):903-913.

[10] González C，Yanquepe M，Cardenas J P，et al.Genetic variability of psychrotolerantAcidithiobacillusferrivoransrevealed by (meta)genomic analysis[J].Research in Microbiology，2014(9):726-734.

[11] Aytar P，Kay C M，Mutlu M B，et al.Coal Desulfurization withAcidithiobacillusferrivorans,from Balya Acidic Mine Drainage[J].Energy & Fuels，2013(6):3090-3098.

[12] Ccorahua R，Eca A，Bieberach G G，et al.Oxidation of Copper Sulfide at Low Temperature byAcidithiobacillusferrivoransPQ33 isolated from Peruvian Mine[C] General Meeting American Society of Microbiology，2015.

[13] 劉敏瑞，藺朋武，齊興娥，等.基于16S rRNA和RubisCO基因?qū)κ人崃驐U菌的系統(tǒng)發(fā)育及多樣性[J].微生物學(xué)報(bào)，2016(4):664-679.

Liu Mingrui，Lin Pengwu，Qi Xing′e，et al.Phylogenetic and diversity analysis ofAcidithiobacillusspp.based on 16S rRNA and RubisCO genes homologues[J].Acta Microbiologica Sinica，2016(4):664-679.

[14] 余水靜，彭 濤，周 丹，等.嗜酸硫桿菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)多樣性分析[J].中國環(huán)境科學(xué)，2015(7):2146-2152.

Yu Shuijing，Peng Tao，Zhou Dan，et al.Diversity analysis of two-component signal transduction systems in the genusAcidithiobacillus[J].China Environmental Science，2015(7):2146-2152.

[15] 趙永紅，張 靜，周 丹，等.嗜酸硫桿菌Acidithiobacillus抗砷基因多樣性分析[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2013(7):1141-1147.

Zhao Yonghong，Zhang Jing，Zhou Dan，et al.Diversity analysis of arsenic resistance genes inAcidithiobacillusgenus[J].Ecology and Environment Sciences，2013(7):1141-1147.

[16] 莫曉蘭，溫建康，陳勃偉，等.耐受高氟環(huán)境生長的浸礦菌種的選育[J].稀有金屬，2015(1):75-83.

Mo Xiaolan，Wen Jiankang，Chen Bowei，et al.Breeding of bacteria for high concentration fluoride-tolerance[J].Chinese Journal of Rare Metals，2015(1):75-83.

[17] 邱冠周，柳建設(shè)，王淀佐，等.氧化亞鐵硫桿菌生產(chǎn)過程鐵的行為[J].中南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998(3):226-228.

Qiu Guanzhou，Liu Jianshe，Wang Dianzuo，et al.Iron behavior in growth ofthiobacillusferrooxidans[J].Journal of Central South University，1998(3):226-228.

[18] 范偉平，方 蘋，張 俊，等.氧化亞鐵硫桿菌能量代謝產(chǎn)物之間反應(yīng)促進(jìn)硫化礦細(xì)菌浸出[J].化工學(xué)報(bào)，2004(2):242-246.

Fan Weiping，F(xiàn)ang Ping，Zhang Jun，et al.Intermediate reaction promoting bacterial leaching of sulfide ores[J].Journal of chemical industry and engineering (china)，2004(2):242-246.

[19] 戴艷霞，劉宏偉，廖立琴，等.硫酸鐵對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌鐵代謝基因表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009(21):4010-4014.

Dai Yanxia，Liu Hongwei，Liao Liqin,et al.Influence of ferric sulphate On expression of genes involved in iron metabolism inAcidithiobacillusferrooxidans[J].Progress in Modern Biomedicine，2009(21):4010-4014.

[20] 劉元東.嗜酸氧化亞鐵硫桿菌浸礦過程鐵硫代謝體系的研究[M].長沙：中南大學(xué)，2008.

Liu Yuandong.Study on the System of Iron and Sulfur Metabolism of the Process ofAcidithiobacillusferrooxidans.Leaching.Minerals[M].Changsha:Central South University，2008.

[21] Zou K，Guo X，Liang Y L，et al.Physiological and genetic characteristics of psychrotolerant acidophileAcidithiobacillusferrivoransZB-1 and DX-1[J].Advanced Materials Research，2015，1130:71-74.

[22] Christel S，F(xiàn)ridlund J，Watkin E L，et al.AcidithiobacillusferrivoransSS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 ℃ suggesting it is a eurypsychrophile[J].Extremophiles，2016(6):903-913.

[23] Vlamakis H，Chai Y，Beauregard P，et al.Sticking together:building a biofilm the Bacillus subtilis way[J].Nature Reviews Microbiology，2013(3):157-68.

[24] Breitenbücher K，Siegl M，Knüpfer A，et al.Open-pore sintered glass as a high-efficiency support medium in bioreactors:new results and long-term experiences achieved in high-rate anaerobic digestion[J].Water Science & Technology，1990，22:25-32.

[25] 丁文川，曾曉嵐，王永芳，等.生物炭載體的表面特征和掛膜性能研究[J].中國環(huán)境科學(xué)，2011(9):1451-1455.

Ding Wenchuan，Zeng Xiaolan，Wang Yongfang，et al.Characteristics and performances of biofilm carrier prepared from agro-based biochar[J].China Environmental Science，2011(9):1451-1455.