丹參酮生物合成分子調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

李 珅，林愛真，楊 媛，沈亞芳，饒 盈，羊 健，劉云輝，王 洋，周 偉

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300； 2.浙江省泰順縣西旸鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江 泰順 325509；3.臨安天目山林場，浙江 杭州311311；4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部/浙江省植保生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021）

丹參Salvia miltiorrhiza是傳統(tǒng)的中藥材，其主要藥用成分包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物。其中丹參酮是一類松香烷二萜化合物。20世紀(jì)30年代末，有學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡB是天然的抗氧化劑。隨后幾十年，又連續(xù)發(fā)現(xiàn)了丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、異丹參酮、去甲基丹參酮等脂溶性有效成分。其藥理作用主要表現(xiàn)在抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗心肌缺氧、激素樣活性等方面，并能夠改善學(xué)習(xí)記憶能力，在臨床上主要用于心腦血管疾病的治療［1-2］。丹參有效成分產(chǎn)量較低，可利用資源有限，使其應(yīng)用推廣受到很大的限制。因此，篩選獲得高丹參酮產(chǎn)量的優(yōu)良品種或是通過其他方法解決藥源問題是很有必要的。筆者從丹參酮生物合成途徑及其分子調(diào)控機(jī)制等方面展開綜述，同時總結(jié)了以往研究中存在的問題，并結(jié)合自身對研究前景進(jìn)行了分析，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 丹參酮的生物合成途徑

丹參酮是一類二萜類化合物，其代謝合成方式有2條途徑（圖1），分別為位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑 （mevalonate,MVA）［3］和位于質(zhì)體中的非甲羥戊酸途徑（2-C-methyl-d-erythritol-4-phosphate,MEP）［4］。MVA合成途徑的上游基因包括AACT，HMGS，HMGR，MK，PMK和MDC；MEP合成途徑上游基因包括DXS，DXR，CMS，CMK，MCS，HDS和 IDS；中游合成酶基因包括IPPI，GPPS，F(xiàn)PPS和GGPPS；下游合成酶基因包括CPS，KSL，CYP76AH1，CYP76AH3，CYP76AK1以及未知的P450s基因；在下游合成途徑中柯巴基焦磷酸（copalyl diphosphate,CPP）經(jīng)類貝殼杉烯合酶（KSL）催化形成丹參酮二烯（miltiradiene），丹參酮二烯經(jīng)細(xì)胞色素 P450家族蛋白CYP76AH1催化合成鐵銹醇（ferruginol），鐵銹醇經(jīng)過CYP76AH3和CYP76AK1的多步催化生成11,20-二羥基鐵杉醇和11,20-二羥基柳杉酚，最后在其他CYP家族或其他酶作用下產(chǎn)生次丹參酮（miltirone），進(jìn)而合成丹參酮類成分［5］。目前，從鐵杉醇合成丹參酮之間的多步催化反應(yīng)步驟仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

圖1 丹參酮代謝合成路徑Figure 1 Biosynthetic pathway involved in the biosynthesis of tanshinone in Salvia miltiorrhiza

2 誘導(dǎo)子對丹參酮生物合成的調(diào)控作用

誘導(dǎo)子能誘發(fā)植物次生代謝過程中酶的活性，從而增加次生代謝物的產(chǎn)量，有時可以誘導(dǎo)出新的代謝化合物。依據(jù)來源可劃分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子兩大類。生物誘導(dǎo)子是指植物體在防御過程中為對抗微生物入侵而產(chǎn)生的防御性物質(zhì)，如分生孢子、分解細(xì)胞壁的酶、細(xì)胞壁的碎片。非生物誘導(dǎo)子是指所有非植物細(xì)胞的固有成分，但能觸發(fā)植物細(xì)胞形成抗毒素信號的物質(zhì)［6］。

2.1 生物誘導(dǎo)子對丹參酮合成的影響

研究人員圍繞生物誘導(dǎo)子對丹參酮合成的影響做了許多研究。晏瓊等［6-7］利用酵母提取物（YE）、寡聚半乳糖醛酸和真菌誘導(dǎo)子等3種生物誘導(dǎo)子分別處理丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)都能顯著提高丹參酮的產(chǎn)量。施加100 g·L-1的真菌誘導(dǎo)子，總丹參酮的產(chǎn)量提升4.70倍；施加100 g·L-1的YE，總丹參酮的產(chǎn)量提升3.20倍；施加100 g·L-1的寡半乳糖醛酸，總丹參酮的產(chǎn)量提升4.20倍。GE等［8］考察了不同濃度的β-氨基丁酸（BABA）和YE單獨(dú)或是協(xié)同對丹參酮代謝合成的影響，與對照相比最多可提高4.50倍。BABA+YE協(xié)同作用，在BABA處理3 d后再加入YE，對丹參酮的積累更加有效。YAN等［9］發(fā)現(xiàn)密旋鏈霉菌Streptomyces pactum處理丹參毛狀根后，GGPPS，HMGR，DXS，DXR等4個關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量顯著提升，總丹參酮產(chǎn)量提高12.61倍［9］。研究發(fā)現(xiàn)，丹參毛狀根中丹參酮ⅡA和隱丹參酮的積累和產(chǎn)量受YE誘導(dǎo)。丹參酮的產(chǎn)量經(jīng)誘導(dǎo)處理6 d后測得的最大值為0.64 mg·g-1，其中HMGS，DXR，DXS2，CMK，IPPI，CPS等6個關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。YE和銀離子（Ag+）共同誘導(dǎo)處理表明，丹參酮ⅡA和隱丹參酮的產(chǎn)量顯著增加。丹參酮誘導(dǎo)處理9 d后測得的丹參酮的最大值為2.08 mg·g-1，其中AACT，HMGS，DXR，IPPI，CMK，F(xiàn)PPS，GGPPS，CPS等8個關(guān)鍵酶基因表達(dá)顯著上調(diào)［10］。 上述研究表明，生物誘導(dǎo)子對于丹參酮的合成具有促進(jìn)作用。因此，新型高效生物誘導(dǎo)子的挖掘和開發(fā)利用將是后續(xù)重要研究方向之一。

2.2 非生物誘導(dǎo)子對丹參酮合成的影響

非生物誘導(dǎo)子能引起或者促進(jìn)植物細(xì)胞與防御機(jī)制有關(guān)的次生代謝產(chǎn)物的生物合成。目前，已證實(shí)的非生物誘導(dǎo)子約有100多種，主要包括茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA），茉莉酸（jasmonate，JA），水楊酸（alicylic acid，SA），重金屬鹽類和稀土元素。郭肖紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的銅離子（Cu2+）， 鎂離子（Mg2+）， 鋅離子（Zn2+）， 亞鐵離子（Fe2+）， 錳離子（Mn2+）以及稀土元素均能促進(jìn)丹參酮ⅡA的合成。KAI等［10］研究了0.10 mmol·L-1MeJA誘導(dǎo)處理丹參毛狀根后丹參酮ⅡA和隱丹參酮的積累變化。處理9 d后，HMGR，DXR，DXS2，GGPPS，CPS和KSL等基因的表達(dá)顯著上調(diào)，丹參酮的產(chǎn)量達(dá)到最大值 0.93 mg·g-1干質(zhì)量（DW）， 相比于對照組 0.16 mg·g-1（DW）增加了約 5.78 倍。 HAO 等［12］發(fā)現(xiàn)SA處理丹參毛狀根36 h后，丹參酮產(chǎn)量上升1.63倍。銀離子處理毛狀根后，HMGR，DXS2，IPPI，GGPPS等基因的表達(dá)顯著上調(diào)；丹參酮ⅡA和隱丹參酮的積累逐漸增加，處理9 d后測得的丹參酮的最大產(chǎn)量為 0.35 mg·g-1， 相比于對照組的 0.16 mg·g-1（DW）增加約 2.20 倍。 晏瓊等［6-7］利用銀離子（Ag+），鈷離子（Co2+）和α-氨基異丁酸（AIB）等3種非生物誘導(dǎo)子分別處理丹參毛狀根，通過檢測丹參酮的產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，此3種非生物誘導(dǎo)子都能提高丹參酮的積累，但誘導(dǎo)能力比生物誘導(dǎo)子弱；其中50.00 mmol·L-1鈷離子獲得了最高的丹參酮產(chǎn)量（1.75 mg·g-1），是對照組產(chǎn)量的4.10倍；30.00 mmol·L-1銀離子處理后總丹參酮的產(chǎn)量提高了2.10倍；50.00 mmol·L-1AIB處理后總丹參酮產(chǎn)量提高了2.30倍。ZHOU等［13］利用金屬元素0.01 mmol·L-1鑭（La）對丹參毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果表明丹參酮代謝途徑上關(guān)鍵酶基因包括HMGR,HMGS,KSL,DXR,CMK的表達(dá)量均上調(diào)，丹參酮Ⅰ，丹參酮Ⅱ和隱丹參酮的產(chǎn)量均升高。由此可推測鑭可能通過促進(jìn)丹參酮代謝途徑上游關(guān)鍵酶基因的表達(dá)而增加丹參酮的積累。房翠萍［14］研究了外源激素對丹參毛狀根生長和丹參酮ⅡA生物合成的影響，結(jié)果顯示在1/2MS培養(yǎng)基中單獨(dú)施加2.00 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤（6-BA）能使丹參酮ⅡA產(chǎn)量增加3.01倍；同時添加3.00 mg·L-16-BA與0.20 mg·L-1NAA能使丹參酮ⅡA產(chǎn)量增加0.93倍；同時添加1.00 mg·L-16-BA與2 mg·L-1赤霉素（GA）能使丹參酮ⅡA濃度增加1.69倍；同時添加1.00 mg·L-1激動素（KT）與1.00 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）能使丹參酮ⅡA產(chǎn)量增加0.21倍；此外還研究了pH值對丹參毛狀根生長和丹參酮ⅡA生物合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH值為pH 9時，丹參酮產(chǎn)量最高。YANG等［15］利用聚乙二醇（PEG）和脫落酸（ABA）對丹參毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)處理，發(fā)現(xiàn)PEG和ABA通過增加毛狀根中活性氧含量促進(jìn)丹參酮的代謝合成，推測PEG和ABA可能通過ABA途徑誘導(dǎo)丹參毛狀根中內(nèi)源茉莉酸（JA）的活性，從而刺激丹參酮的代謝積累［15-16］（表1）。

表1 誘導(dǎo)子對丹參酮代謝合成的影響Table 1 Effect on the biosynthesis of tanshinone induced by elicitors in Salvia miltiorrhiza

3 轉(zhuǎn)錄因子對丹參酮代謝合成的調(diào)控作用

轉(zhuǎn)錄因子又稱為反式作用元件，是能夠特異結(jié)合真核基因啟動子區(qū)域順式作用元件的脫氧核糖核酸（DNA）結(jié)合蛋白，通過蛋白與基因之間、蛋白與蛋白之間的相互作用激活或抑制轉(zhuǎn)錄［17］。近年來，隨著對植物轉(zhuǎn)錄因子研究和認(rèn)識的不斷深入，轉(zhuǎn)錄調(diào)控被認(rèn)為是一種能有效調(diào)控植物次生代謝途徑的新手段。超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子能夠有效地克服多基因共轉(zhuǎn)化存在的弊端，全面調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，對整個代謝途徑的調(diào)控效果要優(yōu)于單純提高單個或多個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。目前，研究人員對轉(zhuǎn)錄因子在丹參次生代謝調(diào)控方面進(jìn)行了深入研究，研究較多的轉(zhuǎn)錄因子有基本螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）、植物中髓細(xì)胞組織增生蛋白（myelocytomatosis，MYCs），WRKY和JAZ等幾個類型（表2）。

3.1 bHLH類轉(zhuǎn)錄因子

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族因其成員含有高度保守的bHLH區(qū)域而被命名為bHLH轉(zhuǎn)錄因子。bHLH結(jié)構(gòu)域由50～60個左右氨基酸組成，包含10～15個氨基酸組成的堿性氨基酸區(qū)和40個左右氨基酸構(gòu)成的HLH區(qū)［18］。50%以上的植物堿性氨基酸區(qū)含有高度保守的His5-Glu9-Arg13序列，這使得堿性氨基酸區(qū)能夠識別 DNA 上 E-box（5′-CANNTG-3′）和 G-box（5′-CACGTG-3′）位點(diǎn)， 并與之結(jié)合［19-20］。 由于 HLH結(jié)構(gòu)域中疏水氨基酸之間常?；プ鲝亩龠M(jìn)蛋白二聚體的形成，因此bHLH蛋白常以二聚體的形式發(fā)揮作用［21］。目前已報(bào)道的植物bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子已有很多，其中擬南芥Arabidopsis thaliana中報(bào)道的bHLH家族成員有164個，水稻Oryza sativa中bHLH家族成員有180個［22］，而煙草Nicotiana tabacum和葡萄Vitis vinifera中bHLH轉(zhuǎn)錄因子分別有190個和191個以上［23-24］。通過轉(zhuǎn)錄組測序，127個丹參bHLH類轉(zhuǎn)錄因子已被分離，其中7個成員被發(fā)現(xiàn)能響應(yīng)甲基茉莉酸 （MeJA）信號誘導(dǎo)。SmbHLH37，SmbHLH74和SmbHLH92被證實(shí)與丹參萜類物質(zhì)的代謝合成密切相關(guān)［25］。由此推測，bHLH類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在JA信號途徑中調(diào)控丹參酮和丹酚酸的生物合成具有重要的作用。此外，丹參轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH1和SmbHLH93的全長基因被相繼克隆，分析表明此2個基因的表達(dá)與丹參酮的代謝合成密切相關(guān)［26-27］，這些研究為從分子水平全面解析bHLH類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控丹參酮的代謝合成機(jī)制奠定了扎實(shí)的工作基礎(chǔ)。

3.2 MYC類轉(zhuǎn)錄因子

MYC類轉(zhuǎn)錄因子是植物茉莉酸類激素響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子。MYC具有多種調(diào)節(jié)功能，廣泛存在于動植物中。MYC類轉(zhuǎn)錄因子中MYC2研究最為深入。MYC2轉(zhuǎn)錄因子含有bHLH保守結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族成員。MYC2在N端含有1個JID結(jié)構(gòu)域，與JAZ結(jié)合相關(guān)［28］。ZHOU等［29］研究發(fā)現(xiàn)，丹參SmMYC2a能和丹酚酸代謝途徑的結(jié)構(gòu)基因SmHCT6，SmCYP98A14的E-BOX互作；而SmMYC2b能和SmCYP98A14的E-BOX互作，直接調(diào)控丹酚酸而間接調(diào)控丹參酮的代謝合成。王曉榮［30］研究發(fā)現(xiàn)，SmMYC2-like能和SmJAZ3互作，在丹參毛狀根中過表達(dá)AtMYC2后，丹參酮代謝合成關(guān)鍵酶基因SmGGPPS的表達(dá)上調(diào)，總丹參酮產(chǎn)量達(dá)16.00 mg·g-1（DW），高出對照5.40倍。而過表達(dá)SmMYC2-like后，總丹參酮產(chǎn)量增加3.50倍。

3.3 WRKY類轉(zhuǎn)錄因子

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是高等植物十大轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域約由60個氨基酸殘基組成，其中靠近氨基酸N端的7個保守氨基酸殘基WRKYGQK為WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列，它們的變異會導(dǎo)致DNA結(jié)合活性減弱或者喪失；羧基C末端的鋅指類似結(jié)構(gòu)在植物的進(jìn)化中可能起到重要的作用［31-32］。

在植物進(jìn)化過程中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員不斷擴(kuò)大。 LI等［33］克隆了61個WRKYs基因，發(fā)現(xiàn)其中42個WRKYs成員能夠響應(yīng)MeJA和銀離子（Ag+）脅迫，與丹參酮的代謝合成密切相關(guān)。郝小龍［34］研究發(fā)現(xiàn)，在丹參毛狀根中過表達(dá)SmWRKY3后，丹參酮合成關(guān)鍵酶基因SmCPS表達(dá)上調(diào)，總丹參酮產(chǎn)量達(dá)3.98 mg·g-1（DW），相比于對照提高了1.83倍；而抑制表達(dá)SmWRKY3后，SmCPS的表達(dá)下調(diào)，總丹參酮產(chǎn)量僅為1.98 mg·g-1（DW）。因此，WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠促進(jìn)丹參酮的合成，是丹參酮合成的正向調(diào)控因子。

3.4 JAZ類轉(zhuǎn)錄因子

含有ZIM結(jié)構(gòu)域的基因稱為JASMONATE ZIM-DOMAIN（JAZ）基因。ZIM結(jié)構(gòu)域一般位于JAZ蛋白的中間，主要由28個氨基酸組成；在N端含有（TIF［F/Y］XG）結(jié)構(gòu)域，在C末端有2個不變的丙氨酸。Jas結(jié)構(gòu)域（SLX2FX2KRX2RX5PY）位于JAZ蛋白的C端，在JAZ蛋白中極其保守。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的SCFCOI1復(fù)合體依賴JA-Ile，并通過Jas結(jié)構(gòu)域與JAZ1，JAZ3，JAZ9，JAZ10蛋白結(jié)合；Jas結(jié)構(gòu)域是JAZ蛋白核定位信號的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。JAZ參與JA信號介導(dǎo)的次生代謝物的合成在擬南芥中研究得比較透徹。JAZ在擬南芥中有12個成員，其中至少8個JAZ蛋白成員都與MYC2相互作用。擬南芥MYC2的同源基因MYC2-LIKE成員JAM1，JAM2和 JAM3也參與JA信號途徑的次生代謝合成（表2）；其中JAM1和JAM2分別與6個不同的JAZ成員相互作用，而JAM3卻不能與任何JAZ蛋白成員互作。近期丹參JAZ蛋白參與JA信號介導(dǎo)的次生代謝物的合成機(jī)制研究也取得一些進(jìn)展。在丹參中超表達(dá)JAZ3和JAZ9基因能使毛狀根中丹參酮的產(chǎn)量急劇降低；酵母雙雜試驗(yàn)證實(shí)SmJAZ9蛋白能與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子擬南芥的AtMYC2互作，而SmJAZ3不能與AtMYC2互作，推測SmJAZ9通過與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子互作，SmJAZ3通過與其他bHLH類轉(zhuǎn)錄因子互作而調(diào)控丹參酮的生物合成［5］。研究證實(shí)將SmJAZ8遺傳轉(zhuǎn)化丹參，超表達(dá)SmJAZ8的轉(zhuǎn)基因毛狀根系表現(xiàn)出對JA信號不敏感的表型；SmJAZ8的超表達(dá)導(dǎo)致SmJAZ1，SmJAZ2和SmJAZ3的表達(dá)量急劇下調(diào)，從而提高丹參酮和花青素的代謝合成；究其原因發(fā)現(xiàn)，SmJAZ8蛋白跟擬南芥的AtJAZ8類似，缺少LPIARR的結(jié)構(gòu)域，而此結(jié)構(gòu)域是JA信號誘導(dǎo)JAZ蛋白降解釋放正向調(diào)節(jié)因子的關(guān)鍵區(qū)域。可見擬南芥JAZ蛋白在JA信號介導(dǎo)的次生代謝合成作用機(jī)制的解析為在丹參中研究JAZ調(diào)控丹參酮和丹酚酸的合成提供了很好的參考。丹參JAZ家族其他成員的功能有待于進(jìn)一步地解析。

表2 轉(zhuǎn)錄因子對丹參酮代謝合成的影響Table 2 Effect on the biosynthesis of tanshinone regulated by transcription factors in Salvia miltiorrhiza

4 可變剪接的分子調(diào)控作用

真核生物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體大多數(shù)只按一種方式進(jìn)行剪接，產(chǎn)生一種成熟的mRNA分子，只翻譯成一種蛋白質(zhì)。但有的基因mRNA前體通過不同的剪接方式（按不同的剪接位點(diǎn)）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，此過程稱為可變剪接。RNA可變剪接不涉及遺傳信息的永久性改變，是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要手段，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制，是導(dǎo)致人類基因和蛋白質(zhì)數(shù)量變異的重要原因。

現(xiàn)如今可變剪接作為代謝和發(fā)育另一個重要的調(diào)節(jié)機(jī)制已在許多植物中被鑒定，如擬南芥［36-37］，大豆 Glycine max［38］， 蔓越橘 Brachypodium distachyon［39］和水稻［40］。 而在丹參中， 利用短讀高通量測序技術(shù)（NGS）和單分子實(shí)時（SMRT）長讀測序技術(shù)，結(jié)合對根部各組織進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，KSL1，HDR，HMGR，AACT3，MK和 PMK基因存在著選擇性剪接調(diào)控的現(xiàn)象［41］。由此可見，丹參酮代謝合成途徑中關(guān)鍵合成酶基因的可變剪接對丹參酮的代謝合成起到了重要的調(diào)節(jié)作用。某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是否也存在可變剪接的調(diào)控方式有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

丹參這種傳統(tǒng)的中草藥具有重要的藥用價(jià)值。近年來野生丹參品質(zhì)嚴(yán)重退化，瀕臨滅絕，導(dǎo)致丹參原藥的供應(yīng)極不穩(wěn)定，解決藥源問題已成為研究的熱點(diǎn)。目前，對丹參酮次生代謝合成的研究重點(diǎn)主要包括以下幾個方面：①丹參酮代謝合成途徑的解析。分離丹參酮代謝合成酶或是修飾酶，通過底物與產(chǎn)物的鑒定，解析丹參酮次生代謝化合物的合成途徑。②轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析。轉(zhuǎn)錄因子可同時調(diào)控代謝途徑上的1個或是多個基因的表達(dá)，在丹參酮次生代謝合成中起重要的調(diào)控作用。為闡明丹參酮代謝合成的調(diào)控機(jī)制，利用誘導(dǎo)子處理丹參，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)揭示候選轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與產(chǎn)物代謝流的分配規(guī)律，以揭示轉(zhuǎn)錄因子間的表達(dá)與互作機(jī)制對丹參酮合成代謝的調(diào)控規(guī)律。③丹參酮基因工程的研究。在代謝途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)充分解析的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)代謝調(diào)控的可預(yù)測性。如采用時空特異性表達(dá)的啟動子、多基因共轉(zhuǎn)化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)丹參有效成分在特異部位或是全株系大量積累和特定性狀改良的目標(biāo)。

隨著研究的深入，進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平全面解析丹參酮的代謝分子調(diào)控機(jī)制對于利用現(xiàn)代基因工程手段培育高品質(zhì)丹參新品種/系具有重要的指導(dǎo)意義，也具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，應(yīng)從以下幾個方面開展研究工作：①丹參酮代謝合成關(guān)鍵調(diào)控因子可變剪接的挖掘與分子機(jī)制解析。②非編碼RNA在丹參酮代謝合成過程中的調(diào)控作用。③丹參酮合成生物學(xué)的研究。通過工程酵母生產(chǎn)丹參酮前體物，并利用有機(jī)半合成技術(shù)體外合成丹參酮，這將改變丹參藥源生產(chǎn)方式，為丹參系列藥物走向國際市場奠定工作基礎(chǔ)，無疑將具有重要的應(yīng)用前景。

［1］ CHEN Xiuping,GUO Jiajie,BAO Jiaolin,et al.The anticancer properties of Salvia miltiorrhiza Bunge （Danshen）：a systematic review ［J］.Med Res Rev,2014,34（4）：768-794.doi：10.1002/med.21304.

［2］ WANG Xin,LEE W,ZHOU Xuelin,et al.A pharmacodynamic-pharmacokinetic （PD-PK） study on the effects of danshen （Salvia miltiorrhiza） on midazolam,a model CYP3A probe substrate,in the rat ［J］.Phytomedicine,2010,17（11）：876-883.doi：10.1016/j.phymed.2010.05.007.

［3］ LANGE B,RUJAN T,MARTIN W,et al.Isoprenoid biosynthesis：the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97（24）：13172-13177.doi：10.1073/pnas.240454797.

［4］ ROHMER M,KNANI M,SIMONIN P,et al.Isoprenoid biosynthesis in bacteria：a novel pathway for the early steps leading toisopentenyldiphosphate ［J］.Biochem J,1993,295（2）：517-524.doi：10.1042/bj2950517.

［5］ SHI Min,ZHOU Wei,ZHANG Jianlin,et al.Methyl jasmonate induction of tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza hairy roots is mediated by JASMONATE ZIM-DOMAIN repressor proteinsb ［J］.Sci Rep,2016,6（1）：20919.doi：10.1038/srep20919.

［6］ 晏瓊,胡宗定,吳建勇.生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響［J］.中國中藥雜志， 2006， 31（3）： 188-191.YAN Qiong,HU Zongding,WU Jianyong.Synergistic effects of biotic and abiotic elicitors on the production of tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root culture ［J］.China J Chin Mater Med,2006,31（3）：188-191.

［7］ 晏瓊，胡宗定，吳建勇.生物和非生物誘導(dǎo)子對丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響［J］.中草藥，2006，37（2）： 262-265.YAN Qiong,HU Zongding,WU Jianyong.Influence of biotic and abiotic elicitors on production of tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root culture ［J］.China Tradit Herb Drug,2006,37（2）：262-265.

［8］ GE Xiuchun,WU Jianyong.Induction and potentiation of diterpenoid tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy roots by β-aminobutyric acid ［J］.Appl Microbiol Biot,2005,68（2）：183-188.doi：10.1007/s00253-004-1873-2.

［9］ YAN Yan,ZHANG Shuncang,YANG Dongfeng,et al.Effects of Streptomyces pactum Act12 on Salvia miltiorrhizahairy root growth and tanshinone synthesis and its mechanisms ［J］.Appl Biochem Biotechnol,2014,173（4）：883-893.doi：10.1007/s12010-014-0876-4.

［10］ KAI Guoyin,LIAO Pan,XU Hui,et al.Molecular mechanism of elicitor-induced tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy rootcultures ［J］.Acta Physiol Plant,2012,34（4）：1421-1433.doi：10.1007/s11738-012-0940-z.

［11］ 郭肖紅，高文遠(yuǎn)，陳海霞，等.金屬離子對丹參酮ⅡA和原兒茶醛生物合成的影響［J］.中國中藥雜志，2005， 30（12）： 885-888.GUO Xiaohong,GAO Wenyuan,CHEN Haixia,et al.Effects of mineral cations on the accumulation of tanshinoneⅡA and protocatechuic aldehyde in the adventitious root culture of Salvia miltiorrhiza ［J］.China J Chin Mater Med,2005,30（12）：885-888.

［12］ HAO Xiaolong,SHI Min,CUI Lijie,et al.Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on tanshinone production and biosynthetic gene expression in transgenic Salvia miltiorrhiza hairy roots ［J］.Biotechnol Appl Biochem,2015,62（1）：24-31.doi：10.1002/bab.1236.

［13］ ZHOU Jie,FANG Lei,WANG Xiao,et al.La dramaticaly enhances the accumulation of tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures ［J］.Earth Sci Res,2012,2（1）：187-192.doi：http：//dx.doi.org/10.5539/esr.v2n1p187.

［14］ 房翠萍.丹參多倍體誘導(dǎo)、毛狀根培養(yǎng)及其丹參酮產(chǎn)量提高的研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.FANG Cuiping.Polyploidy Induction,Hairy Root Culture and Improve the Yield of Tanshinone in Salvia miltiorrhiza［D］.Hefei：Anhui Agriculture University,2011.

［15］ YANG Dongfeng,SHENG Dongfeng,DUAN Qimei,et al.PEG and ABA trigger the burst of reactive oxygen species to increase tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy roots ［J］.J Plant Growth Regul,2012,31（4）：579-587.doi：10.1007/s00344-012-9268-6.

［16］ YANG Dongfeng,MA Pengda,LIANG Xiao,et al.PEG and ABA trigger methyl jasmonate accumulation to induce the MEP pathway and increase tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy roots ［J］.Physiol Plantarum,2012,146（2）：173-183.doi：10.1111/j.1399-3054.2012.01603.x.

［17］ 李潔.植物轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控［J］.生物學(xué)通報(bào)，2004， 39（3）： 9-11.LI Jie.Plant transcription factors and gene regulation ［J］.Bull Biol,2004,39（3）：9-11.

［18］ 張鑫，宋經(jīng)元，胡鳶雷，等.bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物活性成分生物合成的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014， 49（4）： 435-442.ZHANG Xin,SONG Jingyuan,HU Yuanlei,et al.Research progress of the regulation on active compound biosynthesis by the bHLH transcription factors in plants ［J］.Acta Pharm Sin,2014,49（4）：435-442.

［19］ WANG Jinyan,HU Zhongze,ZHAO Tongmin,et al.Genome-wide analysis of bHLH transcription factor and involvement in the infection by yellow leaf curl virus in tomato （Solanum lycopersicum）［J］.BMC Genom,2015,16（1）：1-14.doi：10.1186/s12864-015-1249-2.

［20］ PIRES N,DOLAN L.Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants ［J］.Mol Biol Evol,2010,27（4）：862-874.doi：10.1093/molbev/msp288.

［21］ FERRé-D’AMARé A R,PRENDERGAST G C,ZIFF E B,et al.Recognition by max of its cognate DNA through a dimeric b/HLH/Z domain ［J］.Nature,1993,363（6424）：38-45.doi：10.1038/363038a0.

［22］ XIONG Yuqing,LIU Tieyan,TIAN Chaoguang,et al.Transcription factors in rice：a genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots ［J］.Plant Mol Biol,2005,59（1）：191-203.doi：10.1007/s11103-005-6503-6.

［23］ RUSHTON P J,BOKOWIEC M T,HAN Shengcheng,et al.Tobacco transcription factors：novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae ［J］.Plant Physiol,2008,147（1）：280-295.doi：https：//doi.org/10.1104/pp.107.114041.

［24］ JAILLON O,AURY J M,NOEL B,et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization inmajor angiosperm phyla ［J］.Nature,2007,449（7161）：463-467.doi：10.1038/nature06148.

［25］ ZHANG Xin,LUO Hongmei,XU Zhichao,et al.Genome-wide characterisation and analysis of bHLH transcription factors related to tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza ［J］.Sci Rep,2015,5：11244.doi：10.1038/srep11244.

［26］ 汪琬宜，蔣喜紅，張利華，等.丹參轉(zhuǎn)錄因子 SmbHLH1基因的克隆和表達(dá)分析［J］.中國中藥雜志，2011， 36（24）： 3416-3420.WANG Wanyi,JIANG Xihong,ZHANG Lihua,et al.Isolation and characteristics of SmbHLH1 gene in Salvia miltiorrhiza ［J］.China J Chin Mater Med,2011,36（24）：3416-3420.

［27］ 周宏駿，武玉翠，晉鑫鑫，等.丹參轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH93的克隆及表達(dá)模式分析［J］.中草藥，2014，45（23）： 3449-3455.ZHOU Hongjun,WU Yucui,JIN Xinxin,et al.Cloning and expression pattern analysis of transcription factor SmbHLH93 from Salvia miltiorrhiza ［J］.Chin Tradit Herb Drug,2014,45（23）：3449-3455.

［28］ HONG Gaojie,XUE Xueyi,MAO Yingbo,et al.Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteins in regulating sesquiterpene synthase gene expression ［J］.Plant Cell,2012,24（6）：2635-2648.doi：10.1105/tpc.112.098749.

［29］ ZHOU Yangyun,SUN Wei,CHEN Junfeng,et al.SmMYC2a and SmMYC2b played similar but irreplaceable roles in regulating the biosynthesis of tanshinones and phenolic acids in Salvia miltiorrhiza ［J］.Sci Rep,2016,6：22852.doi：10.1038/srep22852.

［30］ 王曉榮.丹參bHLH類轉(zhuǎn)錄因子MYCs的基因克隆及功能初步研究［D］.上海：上海師范大學(xué)，2015.WANG Xiaorong.Isolation and Function Analysis of bHLH Translation Factor in Salvia miltiorrhiza ［D］.Shanghai：Shanghai Normal University,2015.

［31］ RUSHTON P J,TORRES J T,PARNISKE M,et al.Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes ［J］.Embo J,1996,15（20）：5690-5700.

［32］ XIE Zhen,ZHANG Zhonglin,ZOU Xiaolu,et al.Annotations and functional analyses of the rice WRKY gene superfamily reveal positive and negative regulators of abscisic acid signaling in aleurone cells ［J］.Plant Physiol,2005,137（1）：176.doi：https：//doi.org/10.1104/pp.104.054312.

［33］ LI Caili,LI Dongqiao,SHAO Fenjuan,et al.Molecular cloning and expression analysis of WRKY transcription factor genes in Salvia miltiorrhiza ［J］.BMC Genom,2015,16（1）：200.doi：10.1186/s12864-015-1411-x.

［34］ 郝小龍.丹參SmWRKY3和SmWRKY70轉(zhuǎn)錄因子的功能研究［D］.上海：上海師范大學(xué)，2014.HAO Xiaolong.The Functional Study of SmWRKY3 and SmWRKY70 Transcription Factor in Salvia miltiorrhiza ［D］.Shanghai：Shanghai Normal University,2014.

［35］ 李磊磊.丹參WRKY轉(zhuǎn)錄因子SmWRKY54的功能初步研究［D］.上海：上海師范大學(xué)，2016.LI Leilei.The Functional Study of SmWRKY54 Transcription Factor in Salvia miltiorrhiza ［D］.Shanghai：Shanghai Normal University,2016.

［36］ FILICHKIN S A,PRIEST H D,GIVAN S A,et al.Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana ［J］.Genome Res,2010,20（1）：45-58.doi：10.1101/gr.093302.109.

［37］ MARQUEZ Y,BROWN J W,SIMPSON C,et al.Transcriptome survey reveals increased complexity of the alternative splicing landscape in Arabidopsis ［J］.Genome Res,2012,22（6）：1184-1195.doi：10.1101/gr.134106.111.

［38］ SHEN Yangting,ZHOU Zhengkui,WANG Zheng,et al.Global dissection of alternative splicing in paleopolyploid soybean ［J］.Plant Cell,2014,26（3）：996-1008.doi：https：//doi.org/10.1105/tpc.114.122739.

［39］ BRADEN W,GENGKON L,GAURAV S,et al.Genome-wide landscape of alternative splicing events in brachypodium distachyon ［J］.DNA Res,2013,20（2）：163-171.doi：10.1093/dnares/dss041.

［40］ ZHANG Guojie,GUO Guangwu,HU Xueda,et al.Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome ［J］.Genome Res,2010,20（5）：646-654.doi：10.1101/gr.100677.109.

［41］ XU Zhicao,PETERS R J,WEIRATHER J,et al.Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis ［J］.Plant J,2015,82（6）：951-961.doi：10.1111/tpj.12865.